超氧化物歧化酶样活性的测定方法
人超氧化物歧化酶(SOD)说明书活性
人超氧化物歧化酶（SOD）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中超氧化物歧化酶（SOD）的活性。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人超氧化物歧化酶（SOD）水平。
用纯化的人超氧化物歧化酶（SOD）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入超氧化物歧化酶（SOD），再与HRP标记的超氧化物歧化酶（SOD）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的超氧化物歧化酶（SOD）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人超氧化物歧化酶（SOD）活性浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：720U/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性
2.1试剂和主要仪器
一.试剂
0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2，内含2mmol/L EDTA)：0.2mol/L Tris(内含4mmol/L EDTA)100ml与0.2mol/L HCl44.76ml混合，加双蒸水至200ml，调pH8.2±0.01;邻苯三酚(45mmol/L)：以10mmol/LHCl配制成6mmol/L溶液，存放于冰箱备用;所用试剂均为国产分析纯;实验用水为自制双蒸水;
目前超氧化物歧化酶sod活性测定结果混乱为提高测定结果的可比性对邻苯三酚自氧化法测定sod活性的方法进行了研究就该活力测定体系中缓冲溶液的介质组成浓度ph及所含的edta量等因素对测定结果响进行了探讨根据实验结果提出了新的改良方法超氧化物歧化酶sod是一种特殊的金属酶它能催化超氧阴离子自由基02发生歧化反应从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基02是生物体重要的细胞防御系统之一具有防御氧毒抗辐射防衰老以及防治肿瘤和抗炎等药用功效1超氧化物歧化酶sod这一独特的生理功能使其在医药领域具有良好的应用前景激起了人们广泛的研究热情
2.SOD或粗醉抽提液的活性浏定:
测定时按表2加样，测定步骤与测邻苯三酚的自氧化速率同。
酶活力单位定义:在1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为一个活力单位，即420nm0.030D/分为一个活力单位。若自氧化速率在36~65%，通常可按比例计算，不在此范围内的数值应增减样液量。
二、仪器:
721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)
操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率的测定:在试管中按表l加入缓冲液和双蒸水，25℃保温劝分钟，然后加入25℃预温的邻苯三酚(对照管用10mMHCI代替)，迅速摇匀，倒入比色杯中，在4加nm的分光光度计中，每隔半分钟测一次OD值，要求自氧化速率控制在0.060OD/分。
抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法
抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定办法之羊若含玉创作一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量.分离用蒸馏水定容到1000ml.0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分离取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml.参加10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：，2000：267～268.（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml.网上说定容到100ML我也不懂.奉求（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；（4）10075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保管，随用随配，并稀释10倍（5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保管；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）于预冷的研钵中，加2ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml.取5ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液.提取酶液时如何保管;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里.2、酶活性测定2．显色反响取试管（要求透明度好）5支，3支为样品测定管，1支为对比管，别的1支作为空白，按表39-1参加各溶液.混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx 日光灯下反响20min （要求各管受光情况一致，反响室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）.表39-1 各溶液参加量试剂（酶）用量(ml) 终浓度（比色时） mol/L 磷酸缓冲液130mmol/L Met 溶液750μmol/L NBT 溶液100μmol/L EDTA-Na 2液20μmol/L 核黄素酶液蒸馏水总体积 13mmol 75μmol 10μmol μmol 空白和对比管加缓冲液代替酶液加核黄素时记得要快并且要避光，SOD 活性测定与盘算至反响停止后，以不照光的作空白，分离测定其它各管560nm 波长下的消光度值，已知SOD 活性单位以抑制NBT 光化还原的50%为一个酶活性单位暗示.按下式盘算SOD 活性：SOD 总活性=1005.0)(V FW A V A A T S ⨯⨯⨯⨯-式中 SOD 总活性以每克鲜重酶单位暗示；比活气单位以酶单位/mg 蛋白暗示；A 0—照光对比管的消光度值；A S —样品管的消光度值；V T —样液总体积（ml ）；V 1—测准时样品用量（ml ）；FW —样重（g ）；蛋白质浓度单位为每克鲜重含蛋白毫克数(mg/g).用荧光灯20w 照20min 可以吗不成以,二、POD 、CAT 酶活性的测定粗酶液制备同SOD.1、 过氧化物酶（POD ）活性测定（愈创木酚法） （1）试剂配制：100mmol/L 磷酸缓冲液(pH6.0)：分离取A 母液(Na 2HPO 4 ) ml 和B 母液(NaH 2PO 4 ) ml 混匀即为1000ml PBS(0.2M ，pH6.0)；（2）反响混杂液配制：取50ml PBS(100mmM，pH6.0)，参加28ul愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后参加19ul 30％的H2O2，混匀后保管于冰箱中备用.（3）样品测定：称取1g，放入预冷研钵，加适量磷酸缓冲液研磨至匀浆以4000r/min离心15min，上清液转入100ml容量瓶,用磷酸缓冲液定容至刻度，贮于冷处备用.取试管3支，一支取3ml反响液并参加磷酸缓冲液1ml 作调零，两支取3ml反响液并参加1ml酶液，立刻计时，在470nm测定，酶隔30s念书一次.测一个样加一个，不要全部加上.（边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要包管每个样品从加好样到开端记时的时间相差不大）（4）酶活性盘算：以每min OD值变更（升高）0.01为1个酶活性单位（u）.POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t） (u/g min)ΔA470：为反响时间内吸光度的变更；W为样品鲜重(g)；t为反响时间(min)；Vt为提取酶液总体积；Vs为测准时取用酶液体积.2、过氧化氢酶（CAT）活性测定（1）试剂配制：0.2mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液(Na2HPO4) ml 和B母液(NaH2PO4) ml混杂后至100ml.(加1gPVP)（2）反响液配制：ml 30%的H2O2（原液）稀释至1000ml，摇匀即可.（3）样品测定：1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，参加2～3ml 4℃下磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，归并冲洗液，并定容到刻度.混杂平均将量瓶置4℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液.4℃下保管备用.2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管（参加酶液后在滚水中煮沸5-10min，冷却之后参加H2O2测定吸光值），按表40-2顺序参加试剂.表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液设置装备摆设表管号粗酶液(ml)pH7.8磷酸(ml)蒸馏水(ml)S1S2S325℃预热后,逐管参加0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立刻记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式盘算酶活性.调零用磷酸缓冲液（pH=7.8）3.成果盘算：以1min内A240削减0.1的酶量为1个酶活单位（u）.过氧化氢酶活性(u/g/min)= A240×Vt/0.1×V1×t×FW式中 A240 = AS0－（AS1+AS2）/2AS0—参加煮死酶液的对比管吸光值；AS1, AS2—样品管吸光值；Vt—粗酶提取液总体积（ml）；V1—测定用粗酶液体积（ml）；FW—样品鲜重（g）；0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）五、丙二醛含量的测定1、试剂配制：10%TCA：100g 三氯乙酸→1L0.6%TBA：0.6g硫代巴比妥酸,加少量氢氧化钠（1mol/l）溶解→用10%TCA定容100ml （避光）1mol/l氢氧化钠；称4gNaOH用蒸馏水溶解定容100ml3、测定步调:称取剪碎的试材1g，参加2ml 10％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml TCA进一步研磨，匀浆离心（4000r）离心10min，上清液为样品提取液.3. 显色反响和测定吸取离心的上清液2ml（对比加2ml 蒸馏水），参加2ml 0.6%TBA溶液，混匀物于滚水浴上反响15min，迅速冷却后再离心.取上清液测定532nm、600nm和450nm波长下的消光度.(2) 双组分分光光度法按公式③可直接求得植物样品提取液中MDA的浓度.用上述任一办法求得MDA的浓度，依据植物组织的重量盘算测定样品中MDA的含量：MDA（μmol/g FW）＝C2(u*(D532－D600)－*D450C2－为MDA的浓度；D450、D532、D600分离代表450nm、532nm和600nm波长下的消光度值.七、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）1、试剂的配制（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取g考马斯亮蓝，溶于50 ml 90％乙醇中，参加100 ml 85％（W/V）的磷酸（不懂），85%是磷酸的质量分数，买回来时直接就是85%的磷酸，参加100ml就行.再用蒸馏水定容到1Ｌ，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月.（2）100μg/ml牛血清蛋白（BSA）尺度溶液：称取25mg BSA加水溶解后定容至100 ml，再从中吸取40ml用蒸馏水定容至100 ml（也可取10mg BSA定容至100ml即为100μg/ml 尺度BSA溶液）.2、样品可溶性蛋白含量的测定（1）样品可溶性蛋白含量测定：称取鲜样0.5g,用5ml蒸馏水或磷酸缓冲液研磨提取.吸取样品提取液1.0Ml，放入具塞试管中(每个样品设置两个重复)，参加5Ml考马斯亮蓝G－250溶液，充分混杂，放置2Min后在595nM下比色，记载吸光值，并通过尺度曲线查得蛋白质含量.调零管是用蒸馏水样品中蛋白质的含量(Mg／g)＝C×VT/(V1×FW×1000)（2-2）式中C：查尺度曲线值(μg)；VT：提取液总体积(Ml)；ＦW：样品鲜重(g)； V1：测准时加样量(Ml).我就测这五个所以帮下我谢谢.。
抗氧化酶活性测定方法
抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类对抗氧化反应具有重要作用的酶。
其主要功能是清除体内的自由基，抑制过氧化物形成和脂质氧化反应，从而保护细胞免受氧化应激的伤害。
测定抗氧化酶活性有助于评估生物体内的氧化应激水平，为疾病的诊断和治疗提供重要的指导。
本文将介绍几种常见的抗氧化酶活性测定方法。
1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法：SOD能够催化超氧阴离子（O2-）的还原反应，将其转化为较为稳定的氧气和过氧化氢。
常见的SOD活性测定方法有：-标准醛缩法：根据SOD催化的还原反应，利用NBT（硝基蓝盐）和醛缩剂的变色反应来测定SOD活性。
-自动化测定法：利用包含其中一种还原物质和pH染料的较为稳定的底物，通过测定底物的氧化程度来确定SOD活性。
-XTT法和WST-1法：由于SOD具有还原型的性质，可以通过测定细胞培养基中的还原型琼脂糖（XTT）或水溶性四硝基噻唑盐（WST-1）的还原动力学来测定其活性。
2.过氧化氢酶（CAT）活性测定方法：CAT主要参与还原过氧化氢（H2O2），将其转化为氧和水。
常见的CAT活性测定方法有：-色素法：利用黄曲霉素作为还原剂，观察黄曲霉素的消费量来测定CAT活性。
-光度法：通过测定样品中H2O2浓度的下降程度来间接测定CAT活性。
-氧化还原电极法：通过测定样品中H2O2浓度的下降速度来测定CAT活性。
3.过氧化物酶（POD）活性测定方法：POD主要参与氧气与还原型供体之间的氧化还原反应，转化为过氧化物（ROO-）。
常见的POD活性测定方法有：-色谱法：利用酚类底物的氧化反应，测定产生的醌类产物的含量来测定POD活性。
-酶标法：POD催化氧化反应会形成有色产物，通过测定产物的吸光度来测定POD活性。
4.谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性测定方法：GPx主要参与还原过氧化物，将其转化为相对稳定的醇和水。
常见的GPx活性测定方法有：-碳酸盐法：根据GPx还原底物中的碳酸盐，观察样品溶液pH值的变化来测定GPx活性。
动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定
动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定原理超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。
离子(02-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。
由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2 -)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型。
最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D 酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。
每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。
第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。
第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。
Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。
l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。
自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。
迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。
藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。
为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。
玉米超氧化物歧化酶(SOD)的提取及活性测定
- · O2 -· O 2 + + 2H + H 2O 2 + O 2 SOD 玉米超氧化物歧化酶（SOD ）的提取及活性测定一、目的1．通过对玉米超氧化物歧化酶（SOD ）的提取及活性测定，掌握硫酸铵盐析沉淀蛋白质和超滤浓缩的方法和原理。
2．掌握测定超氧化物歧化酶（SOD ）的活力和比活力的方法。
3．掌握分级盐析沉淀的方法和原理，以及透析的方法和原理。
二、原理超氧化物歧化酶（superoxide dismutase ，简称SOD ），它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：Cu,Zn-SOD ，Mn-SOD ，Fe-SOD 。
SOD 催化如下反应：在生物体内，它是一种重要的自由基清除剂，能治疗人类多种病症，如炎症、脑外伤、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老等，对生物体有保护作用。
在玉米中，SOD 主要存在于胚芽中，当将萌发的玉米籽粒打浆破碎后，以中性盐沉降其蛋白质部分，SOD 就存在于沉淀中，但其中有许多杂蛋白，因此在盐析时先用40%（NH 4）2SO 4去除杂蛋白部分，再用90%（NH 4）2SO 4饱和上清液，经过一定时间后，再将盐析液离心，取其沉淀进行透析，一定时间后，则其中的SOD 成分即被浓缩分离。
超滤也是一种蛋白质浓缩方法，其工作原理是运用液压迫使溶质透过膜，并按溶质分子量、形状、大小的差异，把大溶质分子阻留在膜的一侧，而小分子溶质则随溶剂透过膜到另一侧，使大小溶质分子得到分离。
利用此原理只要选择适当的超滤膜即可将玉米浆中SOD 与其它小分子杂蛋白、可溶性糖等分离，并去除水份，得到SOD 浓缩液。
SOD 活性的测定：采用NBT 光还原法。
其原理为核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O 2-，当加入NBT 后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），既而还原成二甲月替（呈兰色）。
该产物在560nm 下有最大吸收峰。
当加入SOD 时，可以使超氧自由基与H +结合生成H 2O 2+O 2，从而抑制了NBT 光还原的进行，使兰色二甲月替 生成速度减慢。
SOD测定方法
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD）的测定方法2009年12月08日 16:17法适用于以各类鲜活的动植物组织器官及初加工品（如生鱼片、动物血等初加工肉制品）、乳制品、各类水果蔬菜、果汁等食品中超氧化物歧化酶活性的测定。
超氧化物歧化酶是催化以下反应的金属酶，测酶活方法很多，本文介绍氮蓝四唑法与连苯三酚自氧化法。
（一）氮蓝四唑法1. 方法提要在电子供体如甲硫氨酸存在下，核黄素受光激发，与电子供体反应被还原。
在氧气中，还原的核黄素与氧化反应产生，将无色（或微黄）的氮蓝四唑还原为蓝色的不溶性僭，SOD通过催化歧化反应，生成O2与H2O2，从而抑制蓝色形成。
按抑制蓝色特形成的50%为一酶活单位。
酶活力越高，抑制50%蓝色形成所需酶量越少。
2. 仪器荧光灯管。
离心机。
分光光度计。
pH计。
3. 试剂（1）磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），甲硫氨酸（Met），氮蓝四唑（NBT），核黄素，乙二胺四乙酸（EDTA），以上试剂均为分析纯级；所用水为离子水或同等纯度蒸馏水。
（2）pH7.8, 5.0×10-2mol/L的K2HPO4- KH2PO4缓冲液（于冰箱中保存）。
4. 测定步骤（1）酶液的制备：称取5~10g样品，加预先在冰箱中放置的上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液，缓冲液的量为所用样品的10倍以上，在4℃条件下或冰浴中研磨成匀浆，四层纱布过滤，滤液经4000r/min离心20min，取上清液用于酶活测定。
（2）酶反应酬体系液的制备：取上述K2HPO4- KH2PO4缓冲液30ml，依次溶入Met，NBT，核黄素与EDTA，使它们的浓度分别为1.3×10-2mol/L, 6.3×10-5mol/L, 1.3×10-6mol/L与1×10-4mol/L，放冰箱中避光保存。
（3）测酶活在暗光下，取上述酶反应体系液3mL，移入试管中，试管放在一反应小室中，反应小室壁上贴锡箔纸，应将每个试管摆放在照光后所接受光强一致的位置。
超氧化物歧化酶(SOD)活力测定
超氧化物歧化酶（SOD）活力测定植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。
这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。
近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。
过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。
自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。
生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2.－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。
植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。
抗坏血酸（VC ）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。
SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.－、H2O2、OH. 和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。
自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。
二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。
超氧自由基（O2.－）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。
自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。
如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2.－），生成H2O2和O2。
H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。
一、目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。
sod酶活标准
sod酶活标准
一、酶活定义
超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，简称SOD）的酶活定义为：在一定条件下，每分钟内能转化一定量的底物，生成一定量的产物所需的酶量，称为该酶的酶活。
通常以U/mL或U/g表示。
二、酶活单位
在SOD的测定中，常用的酶活单位是U/mL或U/g。
U/mL表示每毫升样品中含有的SOD酶活单位，而U/g表示每克样品中含有的SOD酶活单位。
三、酶活测定
SOD酶活的测定方法通常采用化学比色法。
该方法基于SOD对O2-的歧化反应，通过观察反应过程中O2-的变化来计算SOD的酶活。
具体步骤包括：
1.制备待测样品；
2.设立空白对照组；
3.在一定条件下，将待测样品与O2-反应；
4.观察反应过程中O2-的变化，记录数据；
5.计算SOD酶活。
四、影响因素
SOD酶活的测定结果受多种因素影响，包括：
1.温度：高温会加速反应，但过高的温度可能导致SOD失活。
2.pH值：pH值的变化会影响SOD的活性。
3.底物浓度：底物浓度过高或过低都会影响SOD酶活。
4.样品保存：样品的保存条件和时间也会影响SOD酶活。
五、酶活力保持
为了保持SOD酶活的稳定性，需要注意以下几点：
1.低温保存：将SOD样品保存在低温条件下，如0-4℃。
2.避免反复冻融：避免SOD样品反复冻融，以免影响酶活。
3.及时测定：尽量在提取后及时测定SOD酶活，以免因长时间保存而影响酶
活。
NBT法测定SOD活力
NBT法测定SOD活力1.原理超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（O2.-）的酶，它催化下列反应：2 O2.- + 2H+→H2O2 + O2反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
实验中依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2.-，O2.-可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除O2.-，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可计算出酶活性大小。
2.试剂50mM，PH7.8磷酸缓冲液（57.1875mL A + 5.3125mL B定容至250mL）130mM甲硫氨酸，0.1940g →10mL，磷酸缓冲液配制750µM NBT，0.0061g →10mL，磷酸缓冲液配制100µM EDTA-Na2，0.0037g →100mL，磷酸缓冲液配制20µM 核黄素，0.00753g →100mL，蒸馏水配制，避光保存附录：不同pH 磷酸缓冲液的配制母液：A：0.2M Na2HPO4溶液：Na2HPO4.12H2O 71.64g用蒸馏水溶至1LB：0.2M NaH2PO4溶液：NaH2PO4.2H2O 15.60g用蒸馏水溶至500mL100mM磷酸缓冲液配法：x(mL)A + y(mL)B稀释至200 mL3.实验步骤（1）酶液粗提称取一定量的实验材料于预冷的研钵中，加入适量磷酸缓冲液，冰浴充分研磨后定容（1mL/0.1g）。
取1.5mL匀浆于4℃,10000rpm离心15min，上清液即为酶粗提液。
（POD，CAT，MDA，可溶性蛋白等的测定均按此方法提取）（2）反应液配制取透明度好的指形管或离心管，按下表依次加入各溶液：试剂（酶液）用量/µL 终浓度/比色时50mM磷酸缓冲液600130mM Met 120 13 mM750µM NBT 120 75µM 100µM EDTA-Na2120 10µM20µM 核黄素120 2.0µM酶液20 对照以缓冲液代替酶液蒸馏水100总体积1200混匀后将1只对照管放在暗处，其它各样品于4000lx日光下反应20min（各管受光必须一致，温度高则缩短时间，低则延长）。