双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的构建及转化
LBM2eHBc+融合基因植物表达载体构建及对番茄的转化研究
究结果为进一步开发禽流感 口服疫苗奠定 了基础 ．
关键词 ：禽流感病毒 ； Ｔ ；Ｍ２ ＨＢ ＋；转基 因番茄 ＬＢ ｅ ｃ
中图分类号： Ｑ９ ３ ４． ２ 文献标识码： Ａ
Ｓ ｕ ｅ ｎ Ｃｏｎ ｔ ｕｃ ｉ ｎ ｏ ａ ｔＥｘ ｅ ｓｏ ｃ ｏ ｆＲｅ ｏ ｂｉ ｎ ｔ ｄｉｓｏ ｓ ｒ ｔｏ ｆＰｌ ｎ ｐｒ ｓ ｉ ｎ Ｖｅ ｔ ｒｏ ｃ ｍ ｎａ ｔ ＬＢＭ ２ｅ Ｂｃ Ｇｅ ｎｄ Ｔｏ ａ ｏ Ｔｒ ｎｓｏ ｍａ ｉ ｎ ｌ ＋ ｎｅａ ｍ ｔ ａ ｆ ｒ ｔｏ
载体构建
水稻中cdc2超表达载体的构建生物技术专业 吴娇娇指导教师： 傅体华教授 寿惠霞教授摘要：每个细胞都是一个细胞周期的产物。
细胞增殖是由一系列细胞分裂调控机制精确控制的，在此过程中细胞周期蛋白依赖性激酶起着关键作用。
由p34cdc2和细胞周期蛋白组成的复合物在真核生物中被称为有丝分裂启动子（MPF），控制从G1到S期的转变，而目前通过转基因的材料来研究水稻中cdc2的报道比较少。
为了了解细胞分裂调控基因cdc2在水稻中的作用，通过基因芯片我们得到了一个水稻的cdc2同源基因，期望通过对其超表达得到一些水稻中细胞周期调控的信息。
在此我们选择了包含玉米泛素ubi启动子的双元载体pCAMBIA1390-ubiquitin作为超表达载体，该载体可以在大肠杆菌和农杆菌中稳定表达。
之后我们将最终载体通过电击转化进入强毒力农杆菌强毒力菌株EHA105，保菌。
经典的构建载体的构成就是一系列是酶切和连接反应，因此如何能够高效的进行酶切和连接反应就成为提高构建效率的关键。
在实验中我们也积累了一些经验，同时也改进了一些方法以提高效率。
关键词：细胞分裂调控基因2；细胞周期蛋白；超表达；双元载体Construction of overexpressing vector for rice cdc2 geneBiotechnology Wu JiaojiaoAcademic advisor Shou HuixiaAbstract：Every cell in life is the production of cell division which is controlled by a serial precise reaction. Cyclin-dependent protein kinases (CDKs) play an important role in regulating the eukaryotic cell cycle. A key element of cell cycle control in eukaryotes is the M-phase kinase, composed of p34cdc2 and cyclin A. To dissect the plant cell cycle, we have previously got a cdc2 (cell division control) gene which is homologous to Arabidopsis thaliana from Oryza sativa through DNA chips, We have cloned it into a overexpressing vector termed pCAMBIA1390-ubiqiutin using ubi as promoter which can express efficiently in E.coli and Agrobacterium, then it could be transformed into rice callus. So the target gene is tightly linked to a strong constitutive promoter from Maize, which can over express cdc2. In this study, it is found that digestion and ligation are the key steps in the construction of vector. Some questions in experiment were found and discussed in this paper.Key words:cdc2；cyclin；overexpression；binary Ti vector细胞周期的进程是通过细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase,CDK）的活性变化来控制的。
种子中特异表达IPT基因的植物双元载体构建及转基因水稻获得_张红心
物转化 DH5α，获 得 克 隆 子，提 取 质 粒，然 后 进 行 PCＲ 和酶切鉴定。 1． 2． 4 p1300-pPG-5α-IPT-Nos 植物表达载体的构 建 用 Xba Ⅰ 和 Nco Ⅰ 双酶切 p1300-pPG-5α，回收 后备用。 用 Nco Ⅰ 和 Spe Ⅰ 双 酶 切 pSG516，获 得 IPT-Nos，将 IPT-Nos 和 p1300-pPG-5α 连接后，转化 DH5α，获得克隆子，提取质粒，然后进行 PCＲ、酶切 鉴定及测序验证（ 图 1） 。 1． 2． 5 水稻遗传转化［9 － 10］ 其主要步骤为取水稻 未成熟种子，用 70% 酒精消毒 45 s，无菌水清洗 3 次。然后加入 10% 的次氯酸钠消毒 45～ 60 min 后， 用无菌水清洗 3 ～ 5 次。然后用解剖针取出未成熟 胚，接种至诱导培养基上（ MS + 2，4-D 2 mg / L） ，在 25 ～ 26 ℃ 黑暗条件下诱导愈伤组织，5 d 后将愈伤 继代 1 次。将 农 杆 菌 （ EHA 105，含 有 p1300-pPG5α-IPT-Nos 质粒） 菌液涂布在卡那抗性的 LB 平板， 28 ℃ 倒置培养 3 d，进行 PCＲ 和酶切鉴定。挑取阳 性克隆，培养至 OD600 为 0． 6 ～ 0． 8 时，吸取 10 mL 菌 液，8 000 r / min 离心后，收集菌体，然后用共培养基 悬浮（ MS + 2，4-D 4 mg / L + AS 100 μmol / L） ，用于遗 传转化。挑选新鲜愈伤组织，放入共培养基中浸泡 20 min 后，将愈伤组织转移到固体共培养基中培养 3 d，然后转移到筛选培养基上（ NB + 2，4-D 2 mg / L + Cb 500 mg / L + Hyg 100 mg / L） ，60 d 后挑选生长良 好、结构致密的抗性愈伤组织转移到预分化培养基中 （ NB + ABA 2 mg / L + 6-BA 3 mg / L + NAA 1 mg / L + Cb 250 mg / L + Hyg 25 mg / L） ，在 25 ℃ ，12 h光照条 件下培养，待出现绿点后，将愈伤转移到分化培养基 （ NB + 6-BA 3 mg / L + NAA 1 mg / L + Sorbitol 13 g / L + Cb 250 mg / L + Hyg 25 mg / L） 上进行分化，1 周后可 见绿苗分化，4 周后将再生小苗转移至水中培养，然 后移栽到土中。 1． 2． 6 转基因植物的 PCＲ 检测 用 CTAB 法提取 再生植株叶片 DNA，利用特异于潮霉素抗性基因引 物 （ 5'-CTTATCTGGGAACTACTCACACA-3' 和 5'-AT CACCAGTCTCTCTCTACAAATC-3'） 进行 PCＲ 反应， 反应条件为： 94 ℃ 5 min； 94 ℃ 45 s，58 ～ 60 ℃ 45 s， 72 ℃ 1 min，34 个循环； 72 ℃ 5 min。反应体系为 20 μL，内含 1． 5 mmol / L 的镁离子，2． 0 mmol / L 的 dNTP，0． 1 mmol / L 的引物，0． 2 U 的 Taq 酶。
独行菜CBF基因的克隆及其植物表达载体的构建
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｈａｄ ｃｌｏｎｅｄ ＣＢＦ ３ ａｎｄ ＣＢＦ ４ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｌｅｐｉｄｉｕｍａ— ｐｅｔ—ａｌｕｍ Ｗ ｉｌｌｄ．Ｔｈｅｎ ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡ Ｍ ＢＩＡ ２３００ ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ３５ Ｓ ＋ ． Ｂａｓｉｃ ａｂｏｖｅ ａｌ１．ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｓｕｉｔ— ａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｉｔ ｗａｓ ａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｆｏｒ ｎｅｘｔ ｓｔｅｐ ｔｏ ｌｅａｒｎ ａｂｏｕｔ ｔｈｅ ｓｔｒ ｕ ｃ－ ｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｂｆ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｌｅｐ—ｉｄｉｕｍａｐｅｔａｌｕｍ Ｗ ｉｌｌｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌｅｐｉｄｉｕｍａｐｅｔａｌｕｍ Ｗ ｉｌｌｄ；ＣＢＦ；ｃｌｏｎｅ；ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
热诱导的位点特异性重组植物表达载体构建及烟草转化
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｔｈ ｅ ｓ ｅ ｃ ｕ ｉｔ ｒ ｙ ｐ ｒ ｏ ｂ ｌ ｅ ｍ ｆ ｏ ｓ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ｍａ ｒ ｋ ｅ ｒ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｈ ｓ ａ ｂ ｅ ｃ ｏ ｍｅ ｏ ｎ ｅ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｉ ｍｐ ｏ ￣ ｎｔ ａ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ ｓ ｌ ｉ ｍｉ ｔ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｍｍｅ ｒ ｃ ｉ ａ ｌ ｐ ｌ ｎｔ ａ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｆ ｏ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ・
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热诱 导 的位 点特 异 性 重 组植 物表 达 载体 构 建 及 烟草 转 化
徐广博 ， 李 政 ， 赵 惠贤 ， 刘香利 ， 赵 洁 ， 刘 丹 ， 吴 静
（ １ ． 西 北农林 科技大学生命科 学学 院， 陕西 杨陵 ７ １ ２ １ ０ ０ ； ２ ． 旱区作物逆境生物学 国家重点实验室 ， 陕西 杨陵 ７ １ ２ １ ０ ０ ）
多选择标记植物表达载体的构建
多选择标记植物表达载体的构建李春艳;吴三民;赵建宇;樊宪伟;李有志【期刊名称】《广西农业生物科学》【年(卷),期】2011(030)001【摘要】具有多选择标记的植物基因表达载体有利于转基因植物研究中的转基因植株的筛选。
本研究对植物基因表达载体pCAMBIA1301进行了改造,产生了1个具有可溶性的红移绿色荧光蛋白基因（smRS-GFP）、抗除草剂Basta、葡萄糖苷酸酶（GUS）及潮霉素（Hpt）的多选择标记的新的植物基因表达载体。
运用这一表达载体的多选择标记可以有效降低检测和筛选转化植株时的假阳性率。
此外,如此的基因表达载体也能满足实验室的不同筛选方法的需求。
%A plant gene expression vector with multi-selectable markers benefits screening of transgenic plants in plant transgene researches. In this study, a plant gene expression vector pCAMBIA1301 was re-constructed, generating a new plant expression vector with【总页数】8页(P27-34)【作者】李春艳;吴三民;赵建宇;樊宪伟;李有志【作者单位】广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,南宁530005;广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,南宁530005;广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,南宁530005;广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,南宁530005;广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,南宁530005【正文语种】中文【中图分类】Q943.2【相关文献】1.无选择标记的甜瓜a-ACO1基因植物表达载体的构建及对烟草的共转化效果 [J], 魏兵强;赵长增;陆璐;王福兰;李伟民2.选择标记可去除的植物高效表达载体的构建 [J], 高尚;苏鸓;贾洪革;郭洪年;田颖川;方荣祥;陈晓英3.以木糖异构酶基因xylA为选择标记的Gateway系统植物表达载体的构建 [J], 阎淑滑;周波;赵霞;李玉花4.PMI基因作为选择标记的植物表达载体构建及其在雪柑转基因中的应用 [J], 曾黎辉;徐海峰;王会全;吴少华;朱艺萱5.无选择标记的植物表达载体的构建 [J], 辛翠花;刘庆昌;屈冬玉;黄三文因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
植物表达双价抗虫载体pCAMBIA3300-bt-pta的构建
植物表达双价抗虫载体pCAMBIA3300-bt-pta的构建杨俊杰【期刊名称】《齐鲁师范学院学报》【年(卷),期】2012(027)005【摘要】本研究将苏云金芽孢杆菌（bt）与半夏凝集素抗虫基因（pta）两类抗虫基因连接到具有高效性的植物表达载体pCAMBIA3300中，重组表达质粒分别经过ApaⅡ单酶切及xhoⅠ和KpnⅠ双酶切鉴定、分析后，实验结果表明含有双价抗虫基因pCAMBIA3300-bt-pta的植物重组表达质粒已构建成功。
%Two insect -resistant genes, Ternata leetin gene ( Pta ) and Bacillusthuringiensis ( bt ), were ligated into the plant expression vectors, pCAMBIA3300. The recombinant plasmids were confirmed by restriction enzyme analysis and the results showed that these recombinant plasmids were constructed successfully.【总页数】3页(P80-82)【作者】杨俊杰【作者单位】齐鲁师范学院生物系,山东济南250013【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.双价抗虫植物表达载体p3300-bt-pta的构建及转基因烟草的初步检测 [J], 范媛媛;庞永珍;吴为胜;姚剑虹;唐克轩;武天龙2.抗虫双价基因表达载体的构建及微束激光转化植物研究 [J], 郑巨云;陈正华;刘桂珍;苏秀娟;曲延英3.植物表达双价抗虫载体pCAMBIA3300-bt-pta的构建 [J], 杨俊杰4.双价抗虫植物表达载体p3300-bt-pta转化苜蓿的初步研究 [J], 熊恒硕;康俊梅;杨青川;孙彦;唐克轩5.双抗(抗病毒及抗虫)植物表达载体的构建及番茄的转化鉴定 [J], 梁小友;米景九;朱玉贤;陈章良因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
转PcLIPH8基因水稻的构建及其相关表型分析
转PcLIPH8基因水稻的构建及其相关表型分析李珅;王珂;林法明;李光豪;高俊峰;杜长青【摘要】利用黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶基因(PcLIPH8),构建植物双元表达载体35S∷PcLIPH8,并遗传转化水稻野生型品种Kitaake,对转基因水稻进行分子鉴定、酶活及木质素含量测定、表型观察等分析.结果表明:(1)成功构建了植物双元表达载体35S∷PcLIPH8,获得3个独立的转PcLIPH8水稻株系,但在苗期转基因水稻与野生型对照无明显表型差异.(2)酶活及木质素含量测定结果表明,转基因水稻的木质素过氧化物酶活性增加3.06％～5.07％,而木质素含量显著低于野生型对照,苗期降低11.44％～14.97％,成熟期降低13.83％～20.05％.(3)成熟期表型分析表明,转基因水稻较野生型对照的株高增加了28.37％～39.78％,穗谷粒数增多110％～120％,生物量增大18.61％～22.97％,而千粒重减小12.86％～13.34％,谷粒长度变短6.67％～7.15％.该研究结果为利用PcLIPH8基因降低木质素含量,提高生物产量,从而改善植物品质奠定了前期基础.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2018(038)011【总页数】7页(P1968-1974)【关键词】黄孢原毛平革菌;PcLIPH8基因;异源表达;水稻【作者】李珅;王珂;林法明;李光豪;高俊峰;杜长青【作者单位】河南农业大学农学院,郑州450046;河南农业大学农学院,郑州450046;河南农业大学农学院,郑州450046;河南农业大学农学院,郑州450046;河南农业大学农学院,郑州450046;河南农业大学农学院,郑州450046【正文语种】中文【中图分类】Q785;Q786;Q789木质素是重要的植物次生代谢产物之一。
在高等植物体内，木质素是仅次于纤维素的第二位最丰富的大分子有机物[1-2]。
木质素沉积在木质部导管及韧皮部纤维等组织中，参与调控植物生长发育、病虫害防御及环境适应性等过程[3-7]。
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双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的构建及转化石磊;周晓燕;甘晓燕;马洪爱;宋玉霞【摘要】【目的】构建双元植物表达载体,通过遗传转化提高植物的抗逆能力。
【方法】将从超旱生、耐盐植物梭梭（Haloxylon ammodendron）中克隆得到的HaBADH基因,定向导入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS中,以HaCMO替换pCAMBIA2300-HaBADH中的抗性基因NPTⅡ,构建双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并通过农杆菌介导法将其转入粳稻品种＂优引三号＂,对所获得的转基因植株进行PCR检验。
【结果】成功构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并获得了携带有pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的水稻阳性植株5株,经PCR检测,转入成功。
【结论】将梭梭抗逆基因HaBADH和HaCMO构建到一个表达载体中,并成功转化水稻,为转入基因后水稻植株内甜菜碱合成和积累过程的深入分析提供了条件。
%【Objective】The study was done to construct a binary expression vector to improve stress-tolerance of target plants by genetic transformation.【Method】 We introduced HaBADH directly into plant expression vector pCAMBIA2300-35S-OCS,and replaced NPTⅡ with HaCMO,and constructed a binary expression vector.HaBADH and HaCMO were both cloned by our laboratory and pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO was transformed into rice Youyin-3 by Agrobacterium-mediated transformation and transgenatic plants were detected with PCR.【Result】 We constructed the plant binary expression vector pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO successfully,and obtained 5 transgenic rice plants which contained the vector by PCRanalysis.【Conclusion】 This study introduces HaBADH and HaCMO to pCAMBIA2300-35S-OCS,and constructs a binary expression vector pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,and transforms it to rice,which prepares for study synthesis and accumulation of glycine betaine in transgenetic rice.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(040)006【总页数】8页(P210-216,223)【关键词】梭梭;甜菜碱醛脱氢酶;胆碱单加氧酶【作者】石磊;周晓燕;甘晓燕;马洪爱;宋玉霞【作者单位】宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002 宁夏大学生命科学学院,宁夏银川750021;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002【正文语种】中文【中图分类】Q782在盐渍、干旱等渗透胁迫情况下，许多高等植物会在细胞内大量合成并积累一些有机渗透调节物质，如山梨醇、甘露醇、脯氨酸、甜菜碱等，以提高自身抵抗盐渍、干旱等胁迫的能力。
植物中存在的甜菜碱主要有12种[1]，发现最早、研究最多的甘氨酸甜菜碱(glycine betaine，简称甜菜碱)是现今发现的最有效的渗透调节物质之一，在植物的耐盐抗旱过程中具有重要作用。
目前发现的催化甜菜碱合成反应的3个不同酶系统为：存在于部分微生物和哺乳动物中的胆碱脱氢酶(choline dehydrogenase,CDH)和甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase，BADH)；某些微生物体内的胆碱氧化酶(choline oxidase，COX)，能催化合成甜菜碱的2个连续的反应；在高等植物中，催化第1步反应的胆碱单加氧酶(choline monooxygenase，CMO)和催化第2步反应的甜菜碱醛脱氢酶。
目前，胆碱单加氧酶编码基因CMO已从藜科植物菠菜(Spinacia oleracea)、山菠菜(Atriplex hortensis)、甜菜(Beta vulgaris)、辽宁碱蓬(Suaeda liaotungensis)、翅碱蓬(Suaeda salsa)、盐角草(Salicornia europaea)、戟叶滨藜(Atriplex prostrata)、大洋洲滨藜(Atriplex nummularia)、盐穗木(Halostachys caspica)、梭梭(Haloxylon ammodendron)，禾本科植物水稻(Oryza sativa)，十字花科植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)，百合科植物麦冬(Ophiopogon japonicus)，杨柳科植物小叶杨(Larix leptolepis)等植物中克隆得到[2-9]；甜菜碱醛脱氢酶编码基因BADH已从藜科植物菠菜(Spinacia oleracea)、甜菜(Beta vulgaris)、山菠菜(Atriplex hortensis)、辽宁碱蓬(Suaeda liaotungensis)、中亚滨藜(Atriplex centralasiatica)、三角叶滨藜(Atriplex triangularis)、梭梭(Haloxylon ammodendron)，禾本科植物水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、高粱(Sorghum bicolor)、大麦(Hordeum vulgare)，马鞭草科植物海榄雌(Avicennia marina)，苋科植物千穗谷(Amaranthus hypochondriacus)，菊科植物甘菊(Dendranthema lavandulifolium)、盐穗木(Halostachys caspica)等植物中得到分离和鉴定，并用以转化其他植物以提高抗逆性[10-26]。
盐胁迫或干旱胁迫会引起许多植物尤其是禾本科、藜科植物细胞内甜菜碱的累积[27]。
梭梭隶属于藜科梭梭属，是一种旱生、超旱生植物，主要分布于亚非大陆温带和亚热带干旱区的流动沙丘、盐渍土及砾质戈壁上[28]，其耐盐、耐寒、耐高温、耐干旱贫瘠的能力均很强[29]。
研究表明，梭梭幼苗甜菜碱含量会随干旱胁迫程度的加重而增加，且干旱可以促进梭梭幼苗体内甜菜碱的积累[30]。
构建重组植物表达载体并进行遗传转化，是植物基因改良最便捷有效的方法。
为了充分利用梭梭的抗旱、耐盐基因对其他植物进行基因改良，本研究克隆了梭梭的CMO编码基因HaCMO(GenBank ID：GQ379204)和BADH编码基因HaBADH(GenBank ID：GQ227730)，构建了植物表达载体pCAMBIA2300-HaCMO-HaBADH，并通过农杆菌介导法转化水稻，以期为基因功能的深入分析以及中生植物尤其是作物的基因改良奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料梭梭幼嫩同化枝自行培养；大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌GV3101由宁夏农业生物重点实验室保存；宁夏粳稻品系“优引三号”种子由宁夏农林科学院作物研究所提供。
植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS为CAMBIA公司产品；Trizol Reagent为Invitrogen产品；反转录试剂盒、离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、T4 DNA连接试剂盒，均为Promega公司产品； pMD-18T载体试剂盒、5′RACE试剂盒、3′RACE试剂盒、限制性内切酶KpnⅠ和PstⅠ，均为Takara公司产品；Taq DNA聚合酶为天根公司产品；引物由北京奥科公司合成；DNA分子量标准参照物为Transgen公司产品；其余试剂均为分析纯。
1.2 方法1.2.1 梭梭总cDNA的反转录合成使用Trizol法提取梭梭总RNA。
取2 μg梭梭总RNA，以Oligo(dT)16为引物，进行总cDNA的反转录反应。
反应体系为20 μL：MMLV RT buffer 4 μL，总RNA 2 μL，dNTP 2 μL，反转录酶MMLV 1 μL，Oligo (dT)16 1 μL，RNA酶抑制剂RNasin 0.5 μL，用DEPC处理的H2O补充至20 μL。
反转录反应：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，3 ℃ 3 min。
1.2.2 HaBADH和HaCMO克隆载体的构建根据宁夏农业生物重点实验室克隆得到的HaBADH序列，设计带有酶切位点(引物序列中以下划线标出)的上下游引物，P1：5′-GGTACCAATGTCGATCCCAATACCA-3′，P2：5′-CTGCAGCATAGCCTTCAAGGAGACT-3′。
以反转录产物为模板进行扩增，获得带有限制性酶切位点的HaBADH完整ORF序列。
根据宁夏农业生物重点实验室克隆得到的HaCMO序列，设计带有酶切位点(引物序列中以下划线标出)的上下游引物，P3：5′-CTCGAGCTTTGCTTGATGGCTGGTG-3′，P4：5′-CTCGAGTTACTTCAAAATTTGGTGCA-3′。
以反转录产物为模板进行扩增，获得带有限制性酶切位点的HaCMO完整ORF序列。
将带有限制性酶切位点的HaBADH和HaCMO完整ORF序列分别与pMD-18T载体于16 ℃连接1 h，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性单克隆，提取质粒，获得重组克隆载体pMD-18T-HaBADH和pMD-18T-HaCMO。
1.2.3 表达载体pCAMBIA2300-HaBADH的构建根据所设计的酶切位点，用限制性内切酶KpnⅠ和PstⅠ对重组载体pMD-18T-HaBADH与pCAMBIA2300-35S-OCS分别进行双酶切，37 ℃恒温3 h。