聚合酶链式反应技术

聚合酶链式反应技术

引言：聚合酶链式反应（PCR）是20世纪80年代后期由K.Mullis 等建立的一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术。PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。由于反应循环可进行一定次数，所以在短时间内即可扩增获得大量目的基因。PCR技术具有灵敏度高、特异性性强、操作简便等特点。虽然PCR技术也存在出错倾向高、产物大小受到限制和必须预先有目标DNA序列等缺点，但仍被誉为20世纪分子生物学研究领域最重大的发明之一。Mullis也因贡献卓著而获得1993年度诺贝尔奖。目前，PCR技术已广泛应用于分子生物学的各个领域，在分子克隆、法医学鉴定、DNA序列分析、致病基因的检测及考古学等方面都发挥着重要作用。

操作过程：

聚合酶链式反应用于扩增一小段已知的DNA片断，可能是单个基因，或者仅仅是某个基因的一部分。与活体生物不同的是，PCR 只能复制很短的DNA片断，通常不超过10kbp。DNA是双链分子，因此用互补DNA双链的构造单位（核苷酸）来度量其大小，单位为碱基对（base pair, bp）。某些特定的方法可以扩增40kbp左右的片断，但是这种大小与真核细胞的染色体DNA相比仍然是很少的。例如，人的体细胞DNA含有大约30亿个碱基对。目前应用的聚合酶链式反应需要几个基本组成：

1、DNA模板（template），含有需要扩增的DNA片断。

2、2个引物（primer），决定了需要扩增的起始和终止位置。（见下面引物一节）

3、DNA聚合酶（polymerase），复制需要扩增的区域。

4、脱氧核苷三磷酸（dNTP），用于构造新的互补链。

5、缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。

聚合酶链式反应在热循环设备中进行。PCR仪可以将反应管加热或冷却到每步反应所需的精确的温度。为防止反应体系中液体产生蒸气，通常在反应管上加盖加热的盖子（比加热板温度来的高），或者在反应体系表面加入一层石蜡油。

引物

特定的引物决定了所扩增的DNA片断。引物是人工合成的短DNA片断，一般不超过50个碱基（通常18－25个），它们与所要扩增的DNA片断的起始和终止区域完全互补。在“黏合”时引物结合于DNA模板的起始和终止点，DNA聚合酶结合到这两个位置，开始合成新的DNA链。

选择引物的长度和熔点（Tm）要考虑许多条件。引物的熔点与聚合酶链式反应第一步中DNA的熔点不同，是指50％的引物与模板结合的温度，高于这个温度引物与模板就不能有效结合。这个温度随着引物长度的增加而升高。如果引物长度太短，就有可能与DNA模板的几个位置结合，造成非特异性复制。另一方面，引物长度也受限于Tm。如果Tm太高，即高于80℃，也会导致问题，因为DNA聚合酶在此温度下活性较低。引物最优长度通常为20到40个碱基，熔

点从60℃到75℃。

有时也用到简并引物，是一些相似但不相同的的引物的混合物。通常用于从不同的生物DNA中扩增相同的基因，因为这些基因通常都是近似但不相同的。应用兼并引物的另一种情况是根据蛋白质序列设计引物时，由于几个不同的密码子都能编码一个氨基酸，通常难以判断在DNA中究竟是哪个密码子编码的这个氨基酸。例如编码异亮氨酸的引物可能使用"ATH"，A是腺嘌呤，T是胸腺嘧啶，H可能是腺嘌呤，胸腺嘧啶或者胞嘧啶（关于碱基如何编码蛋白质，可查看遗传密码）。使用简并引物在很大程度上降低了聚合酶链式反应扩增等特异性，这个问题可以使用递减PCR（touchdown PCR）部分地解决。

基于上述考虑，设计引物可以采取以下原则：

1、GC所占比例为40％－60％

2、计算两个引物的Tm，使之不相差5℃，并且扩增产物的Tm与引物的相差不超过10℃。

3、黏合温度通常比计算的最低Tm低5℃，但是要根据经验为不同条件下的聚合酶链式反应选择不同的黏合温度。

4、内部的具有自身互补性的发夹结构不超过4个，其二聚体中不超过8个。

5、3'末端尤其重要，必须不含有与其他引物互补的序列，并且要与模板完全互补。

现有一些帮助设计引物的程序（见外部链接）。

步骤：

一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成，每个循环包括以下3个步骤：

1、高温变性

双链DNA模板在热作用下（一般在95℃），使氢链断裂，双链解离，形成单链DNA这一过程称之为变性。变性后的单链可以重新结合，形成双链，其他性质也同时复原。

2、低温退火

模板DNA经过变性，分解为两条单链。经过系统温度降低，引物退火与互补的DNA模板结合，形成局部的双链，这也是DNA复制的起点。

3、中温延伸

引物与模板结合后，在DNA多聚酶的作用下，从引物的5′端向3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性，退火和延伸，DNA含量即增加一倍。变性、退火及延伸。以上三步为一循环，每一循环的产物作为下一个的模板，这样经过九小时的循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，这样经过数上时的循环后，可得到大量复制的特异性DNA片段。反应条件一般为94℃变性30秒，55℃退火30秒，70-72℃延伸30-60秒，共进行30次循环左右，最后再延伸72℃5分钟，4℃冷却终止反应

优化聚合酶链式反应：

在实践中，聚合酶链式反应可以因各种原因而失败，部分原因是由于其对于污染的敏感性，导致扩增错误的DNA产物。正因为如此，

人们已经开发了一些技术和步骤来优化聚合酶链式反应条件。将聚合酶链式反应前的混合物与潜在DNA污染物分开的实验室方案和流程解决了外源DNA的污染问题。这通常包括从用于分析的区域分理出聚合酶链式反应的设定区域或者说聚合酶链式反应产物的纯化，一次性塑料制品的使用，及对反应装置之间的工作台面彻底清洁。引物的设计技术在改善聚合酶链式反应产物产率和避免杂产物的形成是很重要的。替代缓冲成分和聚合酶的使用有助于较长或存在其他问题的DNA区域的扩增。在缓冲体系中加入试剂，如甲酰胺，或会增加聚合酶链式反应的特异性和产量。可以利用计算机模拟理论聚合酶链式反应结果（电子聚合酶链式反应），以协助在引物设计。

应用：

1、基因图谱建立

2、亲子鉴定

3、侦测遗传疾病

4、复制特定基因

5、基因突变研究

6、NA遗传演化

7、基因表现比较

鉴定基因：

人体内的细胞共有有约为30亿个碱基对的DNA，每个人的DNA 会有差异，具有差异的碱基对数目达几百万之多，因此通过分子生物学方法显示的DNA图谱也因人而异，由此可以识别不同的人。所谓