人脂联素基因克隆及序列比较分析

　［收稿日期］２００９０５０６　［基金项目］福建省重大科技专题项目（２００８ＮＺ０００１－４）；福建省自然科学基金项目（２００９Ｊ０１０５８）；福建省科技项目（２００８Ｆ５０１０）；福建省科技创新平台项目（２００７Ｓ１００１）　［作者简介］刘峰（１９７６），男，河南固始人，助理研究员，博士生，从事品质生物技术研究。

ｄｏｉ：１０畅３９６９／ｊ畅ｉｓｓｎ畅１６７３－１４０９（Ｒ）畅２００９畅０２畅００１人脂联素基因的克隆及序列比较分析 刘　峰　（福建农林大学生命科学学院，福建福州３５０００２）

陈团生　（福建农林大学生命科学学院，福建福州３５０００２；福建农林大学医院，福建福州３５０００２）

郑金贵　（福建农林大学生命科学学院，福建福州３５０００２）

［摘要］目的：克隆人脂联素基因，为进一步重组蛋白表达和生物活性等基础研究与临床应用奠定基础。方法：应用ＲＴ－ＰＣＲ法自人大网膜脂肪组织的总ＲＮＡ中克隆人脂联素全长基因，采用Ｔ－Ａ克隆法重组到ｐＭＤ１８－Ｔ中，通过菌液ＰＣＲ鉴定阳性克隆后，测序鉴定。并采用聚类分析等对其序列进行比较分析。结

果：克隆人脂联素基因全长为７３５ｂｐ，并登录ＧｅｎＢａｎｋ（登录号：ＥＵ４２００１３）；其编码２４４个氨基酸，理论分子量为２６４１３畅６４Ｄａ，预测的等电点为５畅４２。邻接法聚类分析表明，人脂联素与已报道的其它哺乳动物的脂联素相似性达８３％～９６％。结论：成功地克隆了人脂联素基因全长序列，人脂联素与已报道的其它哺乳动物的脂联素序列具有很高的同源性。［关键词］人脂联素；基因克隆；序列分析［中图分类号］Ｑ７８１［文献标识码］Ａ ［文章编号］１６７３１４０９（２００９）０２Ｒ００１０４

近年来的研究表明，糖尿病患者血液中脂联素（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）水平降低会导致其对胰岛素敏感性的下降［１］。脂联素是Ｓｃｈｅｒｅｒ等［２］发现的一种由脂肪组织特异性分泌的约３０ｋＤａ的脂肪细胞因子［３］，能有

效促进脂肪酸氧化和减少糖异生，从而降低血糖和血脂水平［４，５］。对于２型糖尿病及心血管疾病患者，

其血浆中的脂联素水平远远低于正常人，且通常伴有胰岛素抵抗和高胰岛素血症。而增加脂联素水平则能显著增强胰岛素的敏感性，并能抑制肝糖元生成［６－８］。此外，脂联素水平的下降也是导致动脉粥样硬

化的重要因素［９］；利用转基因技术在机体高表达脂联素后可明显对抗ＡｐｏＥ基因缺陷小鼠动脉粥样硬化

的形成［８］。脂联素水平的降低还可致血管功能下降以及冠心病发病危险性增加［１，９，１０］。本研究从人大网

膜脂肪组织克隆脂联素编码区全长基因，并对其进行了序列比较分析，为进一步的重组蛋白表达和生物活性等理论研究与临床应用奠定基础。

１　材料与方法

１畅１　材料　取自于某省立医院胃肠外科胃溃疡患者行胃部分切除术中取出的大网膜脂肪组织，迅速将其装入ｍＲＮＡ保护液（大连宝生物公司），－８０℃低温冰箱保存备用。１畅２　菌种、质粒与主要试剂　大肠杆菌（Ｅ畅ｃｏｌｉ）ＤＨ５α由实验室保存提供；克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ、Ｅｘ－

Ｔａｑ酶、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ

１ｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ、各种限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶等购自大连宝生

物（ＴａＫａＲａ）公司。１畅３　人大网膜脂肪组织总ＲＮＡ的提取　采用Ｑｉａｇｅｎ公司ＲＮＡｅａｓｙｍｉｎｉｋｉｔ提取人大网膜脂肪组织的总

ＲＮＡ；各种ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ的枪头、离心管、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ超纯水均购置于百泰克生物工程公司。１畅４　ＲＴ－ＰＣＲ　使用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ１ｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（ＴａＫａＲａ）将１μｇ的总ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ。以Ｍａｅｄａ等［１１］报道的人脂联素基因序列为基础设计出一对特异性引物（划线部位为增加的

ＢａｍＨＩ与ＳａｃＩ酶切位点）：

Ａｃｒｐ３０Ｆ：５′－ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＢａｍＨＩ

ＡＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＴＴ－３′

・１・长江大学学报（自然科学版）　２００９年６月第６卷第２期：医学

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＹａｎｇｔｚｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔＳｃｉＥｄｉｔ）　Ｊｕｎ畅２００９，Ｖｏｌ畅６Ｎｏ畅２：Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ａｃｒｐ３０Ｒ：５′－ＣＣＧＧＡＧＣＴＣＳａｃｌ

ＴＣＡＧＴＴＧＧＴＧＴＣＡＴＧＧＴＡＧＡＧ－３′

以反转录获得的ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ反应。扩增条件为９４℃５ｍｉｎ，３５个循环（９４℃１ｍｉｎ，５６℃５ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ），７２℃１０ｍｉｎ。１畅５　克隆载体构建　ＲＴ－ＰＣＲ产物胶回收操作步骤参照百泰克生物公司多功能ＤＮＡ纯化回收试剂盒的

说明进行。参照ＴａＫａＲａ公司ｐＭＤ１８－ＴＶｅｃｔｏｒ试剂盒的说明将目的片段连接到ｐＭＤ１８－ＴＶｅｃｔｏｒ上。转化大肠杆菌ＤＨ５α，筛选抗Ａｍｐ菌落，同时进行菌落ＰＣＲ鉴定和测序，并命名为ｐＭＤ－ＡＤＰＮ。１畅６　克隆产物酶切鉴定　重组质粒ｐＭＤ－ＡＤＰＮ的提取参照百泰克生物公司质粒小量提取纯化试剂盒的

说明进行。采用ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ双酶切ｐＭＤ－ＡＤＰＮ，对其进行鉴定。１畅７　脂联素氨基酸序列比对、进化树的构建　使用ＣＬＵＳＴＡＬＸ２畅０程序将人脂联素的氨基酸序列与其

它哺乳动物脂联素的氨基酸进行多序列比对（其它哺乳动物的脂联素氨基酸序列分别来源于ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ和ＰＤＢ数据库等）。使用Ｐｒｏｓｉｔｅ软件分析其功能基团；利用ＭＥＧＡ４畅０程序，采用邻接法（１０００

ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ；ｓｅｅｄ＝６４２３８）聚类分析构建系统进化树。

２　结 果２畅１　ＲＴ－ＰＣＲ结果　应用Ｑｉａｇｅｎ公司ＲＮＡｅａｓｙｍｉｎｉｋｉｔ提取人大网膜脂肪组织获得高质量的总ＲＮＡ；采用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ１ｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ将总ＲＮＡ转录成ｃＤＮＡ后，ＲＴ－ＰＣＲ结果显示在７５０ｂｐ左

右出现目标条带（见图１）。２畅２　克隆产物酶切鉴定图谱　采用Ｔ－Ａ克隆方法将ＰＣＲ产物与ｐＭＤ１８－Ｔ连接、转化ＤＨ５α；提取质粒

ｐＭＤ－ＡＤＰＮ；酶切鉴定表明重组质粒为目的质粒（见图２）。

１为ＭａｒｋｅｒＤＬ，２０００； １为ＭａｒｋｅｒＤＬ，２０００；２为ＲＴ－ＰＣＲ回收的片段电泳； ２～７为特异性引物的ＰＣＲ扩增 ３为ＢａｍＨＩ，ＳａｃＩ双酶切ｐＭＤ－ＡＤＰＮ；　４为重组质粒ｐＭＤ－ＡＤＰＮ图１　ＲＴ－ＰＣＲ扩增全长脂联素基因 图２　重组质粒酶切鉴定结果

２畅３　测序结果　测序表明，该ｃＤＮＡ全长为７３５ｂｐ，为一个完整的开放阅读框ＯＲＦ（见图３）；ＯＲＦ编码２４４个氨基酸残基，未修饰蛋白的理论分子量为２６４１３畅６４Ｄａ，预测的等电点为５畅４２。我们克隆的人脂联素基因的全长ｃＤＮＡ已在ＧｅｎＢａｎｋ登录，登录号为ＥＵ４２００１３。 ＡＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＴＡＣＴＧＣＴＡＴＴＡＧＣＴＣＴＧＣＣＣＧＧＴＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＡＡＡＣＣＡＣＧＡＣＴＣＡＡ ＭＬＬＬＧＡＶＬＬＬＬＡＬＰＧＨＤＱＥＴＴＴＱ ＧＧＧＣＣＣＧＧＡＧＴＣＣＴＧＣＴＴＣＣＣＣＴＧＣＣＣＡＡＧＧＧＧＧＣＣＴＧＣＡＣＡＧＧＴＴＧＧＡＴＧＧＣＧＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＧＧＣＡＴＧＰＧＶＬＬＰＬＰＫＧＡＣＴＧＷＭＡＧＩＰＧＨ

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・２・　刘峰等：人脂联素基因的克隆及序列比较分析第６卷第２期：医学 ＧＧＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＧＧＣＡＧＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＴＧＣＣＴＡＴＧＴＡＴＡＣＣＧＣＴＣＡＧＣＡＴＴＣＧＦＰＧＩＱＧＲＫＧＥＰＧＥＧＡＹＶＹＲＳＡＦ

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推导的氨基酸序列在核苷酸序列下面用单个字母列出，高度保守的ＧＥＫＧＥＫＧ、ＧＰＫＧＤ、ＧＲＫＧＥｍｏｔｉｆ用阴影及粗体标出，启始密码子和终止密码子分别用粗体与星号标出。

图３　人脂联素基因全长ｃＤＮＡ及其推导的氨基酸序列

２畅４　氨基酸序列比较与分析　将我们克隆的脂联素与已报道的其它哺乳动物的脂联素进行同源性分析，结果表明其与兔（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓｃｕｎｉｃｕｌｕｓ，Ｏｃ－Ａｃｒｐ３０：ＡＢＣ６００５２）、狗（Ｃａｎｉｓｌｕｐｕｓｆａｍｉｌｉａｒｉｓ，Ｃｌｆ－Ａｃｒｐ３０：ＸＰ＿５３５８３８）、灰狼（Ｃａｎｉｓｌｕｐｕｓ，Ｃｌ－Ａｃｒｐ３０：ＡＣＩ０１７６８）、家猫（Ｆｅｌｉｓｃａｔｕｓ，Ｆｃ－Ａｃｒｐ３０：ＮＰ＿００１０７８９０７）、狸（Ｎｙｃｔｅｒｅｕｔｅｓｐｒｏｃｙｏｎｏｉｄｅｓ，Ｎｐ－Ａｃｒｐ３０：ＡＡＸ７３２４６）、欧洲棕熊（Ｕｒｓｕｓａｒｃｔｏｓ，Ｕａ－Ａｃｒｐ３０：ＡＣＩ０１７６３）、北极狐（Ｖｕｌｐｅｓｌａｇｏｐｕｓ，Ｖｌ－Ａｃｒｐ３０：ＡＡＸ７３２４７）、欧洲臭鼬（Ｍｕｓｔｅｌａｐｕｔｏｒｉｕｓ，Ｍｐ－Ａｃｒｐ３０：ＡＣＩ０１７６６）、挪威鼠（Ｒａｔ－ｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ，Ｒｎ－Ａｃｒｐ３０：ＮＰ＿６５３３４５）、紫貂（Ｍａｒｔｅｓｚｉｂｅｌｌｉｎａ，Ｍｚ－Ａｃｒｐ３０：ＡＣＩ０１７６４）、小家鼠（Ｍｕｓｍｕｓ－

ｃｕｌｕｓ，Ｍｍ－Ａｃｒｐ３０：ＡＡＨ２８７７０）、牛（Ｂｏｓｔａｕｒｕｓ，Ｂｔ－Ａｃｒｐ３０：ＡＡＫ５８９０２）、猕猴（Ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ，