实验四 黑曲霉原生质体的制备及再生
黑曲霉菌体制备壳聚糖的工艺研究
黑曲霉菌体制备壳聚糖的工艺研究黑曲霉菌体制备壳聚糖的工艺研究可以包括以下步骤：
1. 菌种培养：选取适合的黑曲霉菌菌种，并在适当的培养基中进行培养，提供适宜的生长条件。
2. 菌丝培养：将培养好的菌种接种到含有壳聚糖基质的培养基中，进行菌丝的生长培养。
3. 培养基改性：通过调整培养基的组成、添加适宜的促进壳聚糖生产的营养成分，改善壳聚糖的合成效果。
4. 发酵过程控制：控制培养条件，包括温度、pH、氧气供应等因素，以促进菌体合成和壳聚糖产量的提高。
5. 分离和提取：将培养液中的黑曲霉菌体进行分离和纯化，以得到纯净的黑曲霉菌体。
6. 壳聚糖提取：通过适当的酶处理、酸碱处理等方法，将黑曲霉菌体中的壳聚糖提取出来。
7. 纯化和干燥：对提取得到的壳聚糖进行纯化、过滤、
洗涤和干燥处理，以得到可用于应用的最终产物。
以上是制备壳聚糖的一般工艺研究流程，具体的条件和步骤可能会因研究目的、设备条件等而有所调整和改变。
需要进行详细的研究和实验以确定最佳工艺。
黑曲霉原生质体转化效率影响因子研究
Ｇ Ｐ液体培养基 ：葡萄糖 ２ Ｍ ％，麦芽糖提取物 ２ ％，
Ｐ ｐｏ ． ｅｔ ０１ ｎ ％，Ｋ ２Ｏ ．％，玉 米粉 ０５ ＨＰ ４ ５ ０ ．％；Ｓ ２ ３ 液 Ｙ
体培养基 ：可溶性淀粉 ３ ． ％，酵母提取物 ２ ％，玉 米 粉 ０ ％。 ． ５
１ ．． ． ２ １ ＧＭＰ斜 面培养基 ３
１ ． 原 生质 体洗 涤液 ．４ １ Ｓ ｒｉ ｌ ｏｂ ｏ 液 （ ． ｍｏ ・ ～Ｓ ｒｉ ｌ ０ ｏｂｔ ：Ｓ ｒｉ ｌ ｏ ｔ １ ｌ Ｌ ｏｂｔ ，４ ２ ｏ
ｍｍ ｌ Ｌ Ｃ Ｃ２ １ ｍｏ ・ ～ Ｔ ｉ— Ｃ ） Ｎ Ｃ ： ｏ 。 ～ ａ １， ０ ｍ ｌ Ｌ ｒ Ｈ １； ａ １ ｓ
收稿 日期：２ ０ 一 １ Ｏ ０６Ｏ一 ５
作者简介：王敬国（ ７） １ ８ ，男，黑龙江人 ，硕士，助教 ，主要从 ９
１ ． 酶 裂解 液的 配制 ．１ ２
事作物遗传与育种方面的研究 。Ｅｍ ｉｗｇｔ ｒｉ ６．ｏ － ａ：ｊ ｈ ｂ ＠１３ｃｍ ｌ ａａ ｎ
｝通讯作者 Ｅ ｍａ ：ｏ ｄ＠１３ ｃｍ － ｉ ｚｕ ｔ ６ ．ｏ ｌ
其原生质体进行转化 ， 摸索原生质体制备和转化效 率的最佳条件和方法 ，为进一步提高丝状真菌在表
达 外源基 因的应用打下 基础 。
葡萄 糖 ２ ，麦芽 糖提 取 物 ２ ，Ｐｐｏ ．％， ％ ％ ｅｔｎ０１ ０８ｍｏ・＿蔗 糖 ，Ｋ ２Ｏ ．％，琼脂 １ ． ｌＩ Ｊ ＨＰ ４ ５ ０ ％。
结果表明 ，优化条件后每 １ ｇ质粒转化子 可达 ５ ０个左右。 ０ ０
关键词 ：黑 曲霉 ；原生质体 ；转化效率 ；影响 因子 中图分类号：Ｑ ５ ７ ５ ５ ；Ｑ ８ 文献标识码：Ａ
以大 肠 杆 菌 和 酵母 菌作 为 宿 主 的 微 生 物 表 达 系统 在 生产 外 源 的 蛋 白上 已经 取 得 显 著 成 就 ，但
微生物原生质体制备及再生的影响因素
文章篇号:1007-2764(2006)03-0263-093微生物原生质体制备及再生的影响因素谭文辉，李燕萍，许杨（南昌大学中德联合研究院 食品科学教育部重点实验室，江西南昌 330047） 摘要：原生质体的制备及再生，是原生质体技术的前提和基础。
本文较全面地介绍了影响微生物原生质体制备及再生的因素，以期在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体，为进一步实验打下良好的基础。
关键词：原生质体；制备；再生Factors Affect the Formation and Regeneration of Protoplasts ofMicroorganismTan Wen-hui, Li Y an-ping, Xu Y ang(The Key Laboratory of Food Science of Ministry of Education (Nanchang University); Sino-Germany Joint ResearchInstitute, Nanchang 330047, China)Abstract: Formation and regeneration of protoplasts is the precondition and foundation of protoplasts technology. The factors that affect the formation and regeneration of protoplasts from microorganism were investigated to find the optimum condition of formation and regeneration of protoplasts. It is important to make the good foundation for further research.Keywords: Protoplasts; Formation; Regeneration原生质是有组织的生活物质，是细胞生命活动的物质基础，所有的原生质有相似的基本组成成分和特性。
黑曲霉的诱变
黑曲霉的诱变
实验原理：紫外线的生物效应主要是由于它能引起DNA结构而造成的。
DNA分子强烈吸收紫外线，可引起DNA链的断裂、DNA分子内部和分子间的交
联、核酸与蛋白质的交联、嘧啶水合作用以及形成嘧啶二聚体。
DNA
两条链间的胸腺嘧啶形成二聚体，会妨碍DNA双链的正常解开与复
制；同一条链相邻胸腺嘧啶形成二聚体，会妨碍碱基的正常配对，从
而引起生物体的基因突变或死亡。
实验材料：黑曲霉麦芽汁培养基 0.01%溴酚蓝紫外线诱变箱培养皿恒温培养箱电冰箱
实验过程：
1.配制麦芽汁培养基，并加入0.01%溴酚蓝。
2.用生理盐水配制黑曲霉的孢子悬浮液，浓度为106个/ml，并在37℃条件下经过5个小时培养。
3.在诱变处理前，开启紫外灯，预热20分钟，使光波稳定。
4.将10ml经过培养的黑曲霉孢子悬浮液置于灭过菌的并带有磁力搅拌的直径90mm的培养皿中，放置在磁力搅拌器的载物台上，紫外线照射10分钟，进行培养皿的表面消毒。
5.开启磁力搅拌器，打开皿盖，边照射边搅拌，并计时。
6.照射15分钟后，，盖上皿盖，将培养皿取出。
在自然光下照射15分钟。
7.重复操作4和5，重复五次，每次比前次延长紫外线和光照时间5分钟。
8.取1ml处理液稀释涂于麦芽汁培养基中，于33℃培养3天，选择显色圈直径大的突变株进行培养，保存。
甜面酱中黑曲霉的分离及制曲条件的优化
甜面酱中黑曲霉的分离及制曲条件的优化甜面酱是一种以大豆、麦麸、小麦粉、糯米等为主要原料，经过发酵制成的传统食品。
甜面酱中含有丰富的营养物质，如蛋白质、多种氨基酸、矿物质等，具有增进食欲、健脾开胃、益气补血等功效。
而甜面酱中黑曲霉则是一种常见的发酵微生物，对甜面酱的品质和口感有着重要的影响。
因此，对甜面酱中黑曲霉的分离及制曲条件的优化具有重要的研究意义。
一、甜面酱中黑曲霉的分离1.1 采样和处理为了分离甜面酱中的黑曲霉，首先需要采集甜面酱样品。
采样时应选择不同产地、不同品牌、不同存放时间的甜面酱样品，以保证样品的代表性。
采样后，将样品放入无菌容器中，加入等量的无菌生理盐水，混匀后用无菌铂丝在琼脂平板上划线接种。
1.2 筛选和鉴定经过接种后，将琼脂平板培养在恒温培养箱中，温度为28℃，培养时间为3-5天。
在培养过程中，应注意观察菌落形态和颜色的变化，同时进行初步的筛选和鉴定。
1.3 确认分离在初步筛选和鉴定后，需要进一步进行确认分离。
确认分离的方法包括形态学鉴定、生理生化鉴定、分子生物学鉴定等。
其中，形态学鉴定是最常用的方法，可以通过显微镜观察菌落形态、菌丝形态、孢子形态等特征来进行鉴定。
二、甜面酱中黑曲霉的制曲条件的优化2.1 原料的选择和处理甜面酱的制曲原料包括大豆、麦麸、小麦粉、糯米等。
在选择原料时，应注意原料的品质和新鲜度，避免使用过期或变质的原料。
同时，在处理原料时，应注意清洗、消毒、烘干等步骤，以保证原料的卫生和质量。
2.2 发酵条件的控制甜面酱的发酵过程是甜面酱中黑曲霉生长繁殖的重要环节。
发酵条件的控制对于甜面酱的品质和口感有着重要的影响。
在发酵过程中，应注意控制温度、湿度、pH值等因素，以促进黑曲霉的生长和繁殖。
2.3 发酵剂的选择和添加发酵剂是指在甜面酱制曲过程中用于促进黑曲霉生长和繁殖的微生物。
发酵剂的选择和添加对于甜面酱的品质和口感有着重要的影响。
常用的发酵剂包括红曲、黄曲、黑曲等。
实验四 酵母菌原生质体细胞融合
实验四酵母菌原生质体细胞融合（一）实验目的学习以酵母菌为材料的原生质体细胞融合的方法。
（二）原理（略）（三）实验材料1.菌种：S.cerevisiae Y-1 a ade-，S.cerevisiae Y-2 his、leu、thr。
2.培养基：（1）完全培养基（YPAD）：葡萄糖2%，酵母膏1%，盐酸腺嘌呤0.04%，蛋白胨2%，pH5.5（2）基本培养基：葡萄糖2%，YNB0.67%，pH5.5，琼脂2%（处理琼脂）（3）再生完全培养基：每100毫升完全培养基中加入18.2g山梨醇。
固体再加入2%琼脂。
（4）再生完全培养基软琼脂：组分同再生完全培养基，加入0.8～1%琼脂。
（5）再生基本培养基：与基本培养基组分相同，加入18.2%山梨醇，再加入处理琼脂2%。
（6）再生基本培养基软琼脂：组分同再生基本培养基，加入处理琼脂0.8～1%。
（7）生孢子培养基3.溶液：（1）ST溶液：1mol/L山梨醇，0.01mol/Ltris-HCl（pH7.4）（2）Zymolyase酶混合液：10mLST溶液，0.2mL0.05mol/L EDTA（pH7.5），Zymolyase酶1mg，过滤除菌（3）STC溶液：ST溶液中，加入0.01mol/LCaCl2（4）PTC溶液：35%PEG-4000，0.01mol/L tris-HCl（pH7.4），0.01mol/LCaCl2（5）0.05mol/LEDTA溶液（6）0.5mol/Lβ-巯基乙醇（四）方法与步骤1.菌体前培养分别从斜面取1环菌种接种于装有20mL完全培养基的250mL三角瓶中，30℃振荡培养16～18h；分别取2mL培养物接种于装有20mL完全培养基的250mL三角瓶中，30℃振荡培养6～8h，呈对数生长状态。
将上述培养液分别离心（3500r/min，10min）收集菌体，用10mL 无菌水离心洗涤菌体两次，尽可能出去杂质。
2.原生质体制备（1）将两亲本细胞分别悬浮于10mL溶液（25mL0.05mol/LEDTA和1mL0.5mol/Lβ-巯基乙醇混合液）中，30℃振荡处理10min。
微生物原生质体制备及再生的影响因素
文章篇号:1007-2764(2006)03-0263-093微生物原生质体制备及再生的影响因素谭文辉，李燕萍，许杨（南昌大学中德联合研究院 食品科学教育部重点实验室，江西南昌 330047） 摘要：原生质体的制备及再生，是原生质体技术的前提和基础。
本文较全面地介绍了影响微生物原生质体制备及再生的因素，以期在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体，为进一步实验打下良好的基础。
关键词：原生质体；制备；再生Factors Affect the Formation and Regeneration of Protoplasts ofMicroorganismTan Wen-hui, Li Y an-ping, Xu Y ang(The Key Laboratory of Food Science of Ministry of Education (Nanchang University); Sino-Germany Joint ResearchInstitute, Nanchang 330047, China)Abstract: Formation and regeneration of protoplasts is the precondition and foundation of protoplasts technology. The factors that affect the formation and regeneration of protoplasts from microorganism were investigated to find the optimum condition of formation and regeneration of protoplasts. It is important to make the good foundation for further research.Keywords: Protoplasts; Formation; Regeneration原生质是有组织的生活物质，是细胞生命活动的物质基础，所有的原生质有相似的基本组成成分和特性。
原生质体诱变方法
2.4 试验方法2.4.1 酶液配制称取适量固体酶（w/v)，溶于0.6mol/L渗透压稳定剂中，0.22μm微孔过滤膜过滤除菌后备用。
2.4.2菌丝培养取直径1cm的菌丝块接种于盛有100mL液体培养基的250mL三角瓶中，每瓶接种一块，25℃静置培养3-7d。
2.4.3原生质体制备与计数将培养好的菌丝置于离心管中，10000r/min离心15min，弃去上清液，用相应稳渗剂洗涤3次，无菌滤纸吸去多余水分。
每250mg湿菌丝加1mL酶液，在适当温度水浴中酶解一段时间，酶解过程中每隔一段时间震荡混匀一次，吸取少许酶解液，血球计数板计数。
原生质体制备是菌种选育及其遗传研究的一个重要组成部分，确定了滑菇原生质体形成的最适条件：以0.6mol/L的MgSO4为稳渗剂，在2%的蜗牛酶和纤维素酶的混合酶、pH6.5、酶解温度30℃的条件下对培养7d的菌丝进行酶解，在此条件下所得原生质体的产量为3.92×106个/mL。
1.5.3 原生质体再生1.5.3.1 原生质体纯化（崔宗强，2003）酶解后的原生质体悬浮液经脱脂棉柱（5mL 注射器中塞入0.5-1.0cm 高的脱脂棉，稍压实）过滤除去残余菌丝，滤液4200r/min 离心10min，去上清液，用渗透压稳定剂洗2 次，得到纯化原生质体。
吸取少许悬液，血球计数板计数。
1.5.3.2 原生质体再生将适量原生质体悬液稀释到一定浓度后，吸取0.1mL 涂布再生固体平板。
同时用无菌水涨破原生质体后，以同样方法涂布再生固体平板，以消除非原生质体所形成的菌落带来的误差。
原生质体再生率的计算：再生率（％）＝（原生质体再生菌落数－对照组再生菌落）/原生质体总数×100％。
1.5.3.3 再生培养基的选择在30℃、pH6.0、1.5%酶液条件下，以0.6mol/L KCl 作为稳渗剂，酶解3h 得到冬虫夏草原生质体。
将所得原生质体过滤、纯化后吸取0.1mL 分别涂布 5 种不同再生培养基，25℃培养5d。
制备原生质体+细胞裂解
1、酶解将撕去下表皮的叶片剪成小块，放在盛有5mL酶液的小培养皿中，让去除下表皮
的一面接触酶液，辅满一层，在25~28℃下酶解60~90分钟。
2、酶液配制为：1.5%(w/v)纤维素酶，0.3%(w/v)果胶酶，5mmol/LMES，0.6mol/L甘露醇，
5mmol/L氯化钙；pH 5.8。
离心浓缩细胞悬浮液，将细胞放到培养皿中进行酶解。
材料和酶液体积是1：10，时间3~6小时，因为是细胞所以酶解3小时怎么样？或者让它过个夜，温度25摄氏度。
在暗光或避光条件下进行。
还要用到你的小摇床…
3、收集纯化
（1）用吸管将酶解液吸至5mL离心管中，以600rpm离心5分钟以上，使原生质体沉降
（2）将上清（酶解液）回收，剩下原生质体及残渣于管底
（3）加氯化钙液约2mL，轻轻吹打均匀
4、A.用液氮冻融三四次，细胞冻住后，37摄氏度水浴。
溶解后震荡再冻。
B.至少三次以上冻融。
C.-20摄氏度一下冻融再室温溶解，反复几次，细胞结构破裂。
原生质体制备与融合
Thanks!
• 渗透压稳定剂对原生质体制备的影响
细胞壁脱去后，原生质体必须在高渗环境中保存及生长，否则会 因为渗透压而破裂。因此，渗透压稳定剂也是影响原生质体制备的重 要因素。
0.5% 纤维素酶+1mol/L 的 山梨醇处理Lecanicillium sp.
高倍显微镜下酶解前 Lecanicillium sp. 菌丝
混合酶液处理 Lecanicillium sp. 制得原生质体（×200）
原生质体的融合
原生质体的融合的不同产物
电诱导融合法： 短时间强电场作用， 质膜发生可逆性电击 穿，促使原生质体融 合
原生质体融合的方法
激光诱导融合法： 让原生质体先紧密 贴在一起，后用激 光对接触处照射， 使细胞融合
化学诱导融合法
• 酶解时间、温度、pH值对原生质体制备的影响
酶解时间的长短直接影响原生质化的效果，处理时间过短，脱壁 不完全，处理时间过长，会导致原生质体脱水皱缩，再生率显著降低 。而且不同的的酶都有各自的最适酶解温度。酶解时温度选择的原则 是既有利于原生质化，又能防止原生质体被破坏。酶解时的pH值随 酶和物种有一定的差异，需根据实际情况对pH值进行优化。
影响原生质体融合的因素
• 无机离子对原生质体融合的影响
原生质体融合过程中需要一定量的Ca2+和Mg2+促进融合，而 K+、Na+会显著降低融合率。
• 融合剂PEG对原生质体融合的影响
仅将原生质体混合在一起融合率并不高，需要添加融合剂来提高 融合率。PEG较常使用。PEG的相对分子质量和浓度高低对融合都有 较大的影响。PEG浓度过高会导致原生质体皱缩甚至是中毒，过低导 致原生质体破裂。
融合子的筛选
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实验四黑曲霉原生质体的制备及再生
一、实验目的
1、掌握黑曲霉培养的方法；
2、熟悉黑曲霉原生质体的制备方法；
3、懂得原生质体的再生原理。
二、实验原理
获得有活力、去壁较为完全的原生质体对于随后的原生质体融合和原生质体再生是非常重要的。
制备原生质体的脱壁酶只能采用滤菌器去菌，对于细菌和放线菌，主要采用溶菌酶；对于酵母菌和霉菌，则一般采用蜗牛酶和纤维素酶。
影响原生质体制备的因素有许多，主要有以下几个方面。
⑴菌体的预处理在使用脱壁酶处理菌体以前，先用某些化合物对菌体进行预处理，有利于原生质体制备。
例如用EDTA(乙二胺四乙酸)、甘氨酸、青霉素或D-环丝氨酸等处理细菌，可使菌体的细胞壁对酶的敏感性增加。
EDTA能与多种金属离子形成络合物，避免金属离子对酶的抑制作用而提高酶的脱壁效果。
甘氨酸可以代替丙氨酸参与细胞壁肽聚糖的合成，其结果干扰了细胞壁肽聚糖的相互交联，便于原生质体化。
⑵菌体的培养时间为了使菌体细胞易于原生质体化，一般选择对数生长期后期的菌体进行酶处理。
这时的细胞正在生长、代谢旺盛，细胞壁对酶解作用最为敏感。
采用这个时期的菌体制备原生质体，原生质体形成率高，再生率亦很高。
⑶酶浓度一般地说，酶浓度增加，原生质体的形成率亦增大，超过一定范围，则原生质体形成率提高不明显。
酶浓度过低，则不利于原生质体的形成；酶浓度过高，则导致原生质体再生率的降低。
为了兼顾原生质体形成率和再生率，有人建议以使原生质体形成率和再生率之乘积达到最大时的酶浓度为最适酶浓度。
⑷酶解温度温度对酶解作用有双重影响，一方面随着温度升高，酶解反应速度加快；另一方面，随着温度升高，酶蛋白变性而使酶失活。
一般酶解温度控制在20～40℃。
⑸酶解时间充足的酶解时间是原生质体化的必要条件。
但是如果酶解时间过长，则再生率随酶解的时间延长而显著降低。
其原因是当酶解达到一定的时间后，绝大多数的菌体细胞均已形成原生质体，因此，再进行酶解作用，酶便会进一步对原生质体发生作用而使细胞质膜受到损伤，造成原生质体失活。
⑹渗透压稳定剂原生质体对溶液和培养基的渗透压很敏感，必须在高渗透压或等渗透压的溶液或培养基中才能维持其生存，在低渗透压溶液中，原生质体将会破裂而死亡。
对于不同的菌种，采用的渗透压稳定剂不同。
对于细菌或放线菌，一般采用蔗糖、丁二酸钠等为渗透压稳定剂；对于酵母菌则采用山梨醇、甘露醇等；对于霉菌则采用KCl和NaCl等。
稳定剂的使用浓度一般为0.3～0.8 mol／L。
一定浓度的Ca2+、Mg2+等二价阳离子可增加原
生质膜的稳定性，所以是高渗透压培养基中不可缺少的成分。
三、实验试剂
马铃薯，葡萄糖，琼脂，NaNO3，K2HPO4，MgSO4•7H2O，KCl，FeSO4•7H2O，蔗糖，NaCl，蜗牛酶、纤维素酶，无菌蒸馏水。
四、实验仪器
摇床，离心机，倒置显微镜，普通显微镜，超净工作台，培养皿，离心管，载玻片，刀片，镊子，过滤漏斗，0.45um滤膜，吸管，灭菌锅，镊子。
五、实验方法步骤
1、斜面活化
PDA培养基：马铃薯60g，葡萄糖2 g，琼脂2g（100 mL）
配置方法：取新鲜马铃薯60g，去皮切成细丝状，加入适量蒸馏水，置于蒸煮锅内煮沸并不断用玻璃棒搅拌至快成糊状，用八层纱布过滤取滤液，依次加入用天平称取的葡萄糖2 g、琼脂2g，搅匀，最后用蒸馏水定容至100 mL，加热溶解。
分装于试管中，约至试管的三分之一，然后加塞包扎灭菌，灭菌温度为121℃，压强为0.1 Mpa，灭菌20 min。
灭菌结束后摆斜面冷却待用。
在无菌操作台中，将实验室保藏的黑曲霉菌种接入已灭菌的斜面培养基中。
置于30℃恒温培养箱中培养三天。
2、孢子悬浮液的制备
将已活化的黑曲霉孢子从试管中刮到装有生理盐水的三角瓶中，置于30℃摇床上，150 r •min-1，10 min。
取出用4层擦镜纸过滤，将滤液用3000 r•min-1离心，弃上清液，用生理盐水洗涤1-2次，然后对悬浮液进行镜检和计数，调整孢子浓度约为5×108个/mL。
3、菌丝体的培养
（1）制备PDA平板培养基，于大烧杯中按照培养基配方配置300mL，平均分装于三个容量为250mL的锥形瓶中，加塞包扎，与包扎好的平皿、涂布棒、枪头、试管、玻璃纸、蒸馏水、镊子、离心管、小烧杯等所实验需仪器一起灭菌。
在无菌操作台上，将锥形瓶中的培养基分倒入平板中，每100mL约能倒六个平板，冷却待用。
（2）在无菌操作条件下，取8个平板培养基，用镊子将玻璃纸平铺到培养基上，用移液枪将已制备好的孢子悬液滴到培养基上，每皿0.1 mL，用涂布棒涂布均匀。
置于28℃培养箱中培养24小时，可见薄层菌丝，供制备原生质体用。
（3）取原菌悬液0.1 mL用无菌水稀释到10-6、10-7，分别将这两个梯度的菌悬液滴到未加玻璃纸的PDA培养基平板上，每皿0.1 mL，涂布均匀，每个梯度做三个平行。
置于30℃培养箱中培养至可见白色单菌落，计数，算出原菌数A。
4、酶解、原生质体的形成
（1）采用高渗溶液即0.8mol/LNaCl溶液配制0.5％蜗牛酶和1％纤维素酶的混合酶液20
mL，用无菌微孔滤膜过滤除菌，取10mL置于已灭菌的空培养皿中。
挑选一皿长得最好的菌丝体（菌丝体白嫩，菌丝完全伸展铺张在玻璃纸上），用无菌镊子将玻璃纸揭下置于酶液中，然后将平皿置于30℃培养箱中酶解2h。
酶解过程中间歇摇动使酶解充分。
高渗溶液配制方法：称取4.68 g NaCl，在超净工作台上，用无菌水定容至100mL。
混合酶液配置方法:称取1 g蜗牛酶、2 g纤维素酶，在超净工作台上，用已制备好的
高渗溶液定容至20mL。
（2）将酶解好的的酶液离心（1000 r•min-1，10min），弃去上清。
沉淀用高渗溶液洗涤两次，再用10mL高渗溶液悬浮，吹打均匀，离心（500 r•min-1，5-10min），取上清则得到原生质体悬液。
（3）吸取0.1mL已制备好的原生质体悬液于已灭菌的离心管中，再加入0.9mL的无菌水，盖上摇匀，此管编号为10-1，依次类推稀释到10-4、10-5，吸取0.1mL滴加到PDA培养基平板上，涂布均匀，每个梯度做三个平行。
培养计数为未形成原生质体的原菌数B。
并按下式计算原生质体的形成率。
原生质体的形成率= (A - B) /A×100%
5、原生质体再生
将上述纯化的原生质体悬浮液1mL，用高渗溶液稀释至10-4，10-5，10-6，10-7个/mL，每个梯度取0.1 mL滴于再生培养基上，用涂布玻璃轻推使之均匀，然后将培养皿置于28℃的培养箱中培养2-3天后观察菌落数。
再生培养基（RM）：琼脂20 g，NaNO3 3 g，K2HPO4 1 g，MgSO4•7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4•7H2O 0.01 g，蔗糖30 g，高渗溶液定容至1000mL，pH自然。
六、实验记录
1、原生质体的形成率，再生率
A /个
B /个C/ 个原生质体形成率/% 原生质体再生率/%
A——酶处理前的菌悬液经无菌水系列稀释，于完全培养基平板上培养出的菌落数
B——酶处理后得到的原生质体用无菌水适当稀释，在完全培养基平板上培养出的菌落数C——酶处理后得到的原生质体用高渗液适当稀释，在再生培养基平板上培养出的菌落数
2、按镜下观察绘制黑曲霉的原生质体
七、实验报告
1、简述黑曲霉原生质体制备的方法步骤；。