荧光探针在蛋白质研究中的应用
荧光成像技术在生物学研究中的应用
荧光成像技术在生物学研究中的应用荧光成像技术是一种重要的生物学研究手段。
该技术通过利用荧光染料的特殊性质，在生物体内标记感兴趣的分子，并通过成像技术来研究这些分子在细胞和组织层面上的功能和动态变化。
随着技术的不断发展，荧光成像技术在生物学研究中的应用越来越广泛，不仅帮助科学家们深入了解生命科学的各个方面，同时也对临床医学和药物研究产生了重要的影响。
一、荧光成像技术的优势相对于其他成像技术，荧光成像技术具有以下优势：1. 非破坏性：荧光成像技术使用的荧光染料不会对生物样本造成破坏，可以在生物样本中实现实时检测；2. 高灵敏度：荧光成像技术可以探测到分子水平的变化，检测灵敏度高；3. 高分辨率：荧光成像技术可以实现在细胞和组织层面上的高分辨率成像，可以对分子的微小变化进行观察。
二、 1. 细胞成像荧光成像技术在细胞成像中得到了广泛应用。
对于许多生命过程，如细胞增殖、细胞运动、细胞分化等，荧光成像技术都可以提供非常有力的帮助。
例如，通过使用Green Fluorescent Protein（GFP）标记细胞，可以实现对细胞增殖、细胞运动、细胞分化这些生命过程的实时监测。
2. 蛋白质交互作用研究荧光成像技术可以用于研究蛋白质分子之间的交互作用。
例如，通过利用荧光共振能量转移（FRET）技术，可以研究蛋白质相互作用的动态过程和空间结构。
这种技术可以在活细胞内实现，非常适合研究蛋白质相互作用过程中重要的生命过程。
3. 分子传输研究荧光成像技术可以用于研究生物分子在细胞内部的运输路线。
例如，可以利用荧光标记来跟踪蛋白质运输的路线，从而深入了解分子转运过程中的分子动力学。
4. 癌症研究荧光成像技术在肿瘤研究中也起着重要的作用。
例如，通过荧光探针技术，可以实现对肿瘤组织及其血管的成像。
这种方法具有非常高的敏感性和亚细胞水平的分辨率，可以为肿瘤导向治疗提供重要的依据。
三、荧光成像技术的发展趋势荧光成像技术的发展正在向更高级别发展。
生物荧光探针的合成和应用
生物荧光探针的合成和应用随着生物学和医学研究的不断深入，对生物分子及其相互作用的研究也越来越重要。
其中生物荧光探针是非常重要的工具，它可以用来标记生物分子，以便于研究其分布、功能、相互作用等信息。
本文就生物荧光探针的合成和应用进行探讨。
一、生物荧光探针的种类及特点生物荧光探针的种类很多，主要分为荧光分子和荧光蛋白两大类。
荧光分子包括有机染料和无机荧光物质，其特点是荧光强度高、发光寿命短、激发光谱和发射光谱可调节，灵敏度高等。
荧光蛋白则是一类经过基因工程改造的天然蛋白质，其特点是发射光波长范围广、荧光强度高、发光寿命长、对细胞毒性低等优点。
二、生物荧光探针的合成生物荧光探针的合成方法有很多，常用的有化学合成法和基因工程法。
化学合成法通常是通过改变染料或荧光物质的结构来调节其激发和发射光谱，从而达到应用的目的。
基因工程法则是将荧光蛋白的基因序列克隆到靶细胞里，使荧光蛋白在细胞内表达，实现细胞内定位和生物过程的研究。
三、生物荧光探针的应用生物荧光探针广泛应用于分析、诊断和治疗等多个领域，下面简单介绍几个典型的应用案例。
1、细胞成像生物荧光探针可以用于细胞成像，对细胞转运、信号转导、代谢等生物过程进行实时监测。
例如，荧光蛋白可以用于跟踪细胞膜变化、蛋白质定位和表达等。
有机染料和无机荧光物质则可以用于跟踪细胞内的特定分子，如金属离子、离子通道、荷电分子等。
2、分子诊断生物荧光探针可以用于分子诊断，通过与生物分子的结合或酶催化反应等进行目标分子的检测和分析。
例如，乙酰胆碱酯酶荧光探针可用于检测乙酰胆碱酯酶水平，用于诊断阿尔茨海默病等神经系统疾病。
3、药物治疗生物荧光探针可以用于药物治疗过程的研究和分析。
例如，抗癌药物荧光探针可以用于跟踪药物在体内的分布和代谢过程，进一步指导治疗方案的制定。
四、生物荧光探针的展望生物荧光探针的应用前景非常广阔。
随着生物学和医学研究的不断深入，对于功能更加多样化、高灵敏度、高稳定性的新型生物荧光探针的需求也越来越迫切。
荧光标记技术在生物分析中的应用研究
荧光标记技术在生物分析中的应用研究荧光标记技术是一种非常重要的生物分析技术，它被广泛应用于生物医学研究、药物研发、环境监测等领域。
本文将重点探讨荧光标记技术在生物分析中的应用研究，并介绍其基本原理、方法以及各种应用案例。
一、荧光标记技术的基本原理和方法荧光标记技术是通过将发光分子（荧光染料或荧光蛋白）与目标分子（如蛋白质、核酸等）结合，实现对目标分子的可视化检测和定量分析。
该技术的基本原理是利用标记分子的发射特性，通过荧光光谱的测量和分析，来获取与目标分子相关的信息。
在荧光标记技术中，常用的标记分子包括有机染料、荧光蛋白和量子点等。
有机染料具有较高的荧光发射效率和谱带宽度，适用于多种荧光标记实验；荧光蛋白则具有天然产生的优势，可通过基因工程技术实现靶向标记；量子点具有较好的光学性质和生物相容性，广泛应用于细胞成像和荧光探针。
荧光标记技术的方法多种多样，根据需要选择合适的标记方法。
常见的方法包括直标记和间接标记两种。
直标记是指将荧光染料直接与目标分子结合，常用于标记小分子荧光探针；而间接标记则是先将染料与载体结合，再与目标分子结合，适用于蛋白质和核酸标记。
二、荧光标记技术在生物分析中的应用案例1. 荧光标记技术在蛋白质分析中的应用蛋白质是构成生物体的重要组成部分，荧光标记技术在蛋白质分析中发挥着重要作用。
例如，在蛋白质表达和纯化过程中，荧光标记技术可用于检测目标蛋白质的表达水平和纯度；在蛋白质相互作用研究中，荧光标记技术可用于探测蛋白质间的相互作用关系。
2. 荧光标记技术在细胞成像中的应用荧光标记技术在细胞成像中的应用是其中最具代表性和广泛的应用之一。
通过将荧光染料或荧光蛋白标记到细胞的特定组分或靶标上，可以实现对细胞内分子的可视化观察。
例如，可将荧光标记物标记在细胞核、膜、内质网等特定位置，观察其形态变化和动态过程，获得与细胞功能、代谢和信号传导相关的信息。
3. 荧光标记技术在药物研发中的应用荧光标记技术在药物研发中的应用也是非常重要的。
荧光探针技术的发展及其在生物成像领域中的应用
荧光探针技术的发展及其在生物成像领域中的应用随着生物学研究的深入，科学家们对于生物体内各种分子的结构和功能了解越来越深，而荧光探针技术正是在这个过程中应运而生的。
荧光探针技术利用特定的化学结构和荧光发射机制来探测和识别生物体内不同分子的存在和行为，成为一种重要的研究手段。
本文将简要探讨荧光探针技术的发展历程及其在生物成像领域中的应用。
一、荧光探针技术的历史发展荧光探针技术的前身可以追溯到19世纪中期。
当时，科学家们用一种叫做“量子青春石”的荧光物质，发现在激光光源照射下，这种物质会发出强烈的荧光信号，因而最早探索了用光源驱动探测荧光信号的可行性。
20世纪60年代到80年代，荧光探针技术得到了快速的发展。
在这段时间里，科学家们发现了很多可作为荧光探针的分子，比如荧光染料、荧光蛋白、量子点和金纳米粒子等。
荧光探针技术得到广泛应用，为生物学研究提供了新的思路和方法。
二、荧光探针技术在生物成像领域中的应用荧光探针技术在生物成像领域中的应用是多方面的，可以用于病原体检测、生物分子成像和细胞活动追踪等。
1. 病原体检测病原体检测是荧光探针技术的一个重要应用方向。
利用荧光探针对病原体进行标记，可以快速、敏感地检测病原体的存在和数量。
例如，科学家们利用绿色荧光蛋白对大肠杆菌进行标记，在实验中成功检测到该菌存在的位置和数量。
2. 生物分子成像生物分子成像是荧光探针技术在生物学中的一个主要应用方向。
荧光探针可以与特定的生物分子结合，形成可以被识别的荧光信号，从而用于实时观察生物分子的空间分布和动态变化。
例如，科学家们利用荧光探针对蛋白质进行标记，成功地观察到了蛋白质在细胞内的分布和运动轨迹。
3. 细胞活动追踪荧光探针还可以用于追踪细胞的活动。
例如，利用荧光探针对细胞进行标记，可以跟踪细胞在组织中的迁移和增殖情况。
此外，荧光探针还可以用于跟踪特定细胞的生物学活动，比如神经元的突触活动或心肌细胞的收缩情况等。
三、结语总的来说，荧光探针技术的发展历程迅速而丰富多彩。
生物荧光探针的原理及应用综述
生物荧光探针的原理及应用综述1 生物荧光探针的基本原理荧光探针是指能够通过荧光发射产生信号的分子或化合物。
荧光分子能够吸收特定波长的光并以较长波长的荧光形式发射出来。
在生物研究中，荧光探针可用作分子标记，以跟踪生物分子（如蛋白质、核酸、糖类等）在细胞或组织中的分布、动态变化等。
荧光探针可分为非共价和共价两种类型。
非共价荧光探针一般应用于无细胞或无机物中。
共价探针则是通过共价键与目标分子结合并发出荧光信号。
生物荧光探针的共价基本原理包括：探针与目标分子产生共价结合，导致荧光氧化还原反应、光致断裂产生荧光等过程。
2 常见的生物荧光探针类型2.1 荧光染料荧光染料是指能够特异性地与目标分子结合从而发出荧光信号的化合物。
荧光染料可以自然地、共价地或靶向结合到特定的细胞结构或生物分子中。
常见且热门的荧光染料有荧光素、FITC、罗丹明、乙烯基荧光染料等。
2.2 荧光蛋白荧光蛋白原是从发光细菌中发现的蛋白质，是一种能发出强光的天然荧光染料。
在细胞或组织研究中，人工合成的荧光蛋白（如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白等）被广泛应用于荧光显微镜分析、蛋白质标记、酶观察等方面。
2.3 量子点量子点是一种具有独特光学特性的新型探针，是一种纳米级别的半导体颗粒。
量子点利用电子从价带到导带的跃迁，通过吸收和发射光来产生荧光。
由于其非常小的粒径和荧光能量可调性，量子点在分子标记、细胞成像、癌症诊断、药物递送等领域呈现出广泛的应用前景。
3 生物荧光探针在生物学领域的应用生物荧光探针在生物研究中具有广泛的应用，在许多领域都发挥着重要的作用。
3.1 细胞成像在生物领域，荧光探针广泛应用于细胞成像。
它们能够用来对细胞结构、蛋白质位置、细胞凋亡等进行标记，并通过荧光显微镜观察。
荧光探针能够让研究者追踪分子的位置和行为，显示环境的变化以及让人们更好地理解细胞如何工作。
3.2 蛋白质标记生物荧光探针可以连接到蛋白质上，使得研究者通过荧光显微镜观察特定蛋白质在细胞中的运动和位置。
荧光探针的研究及应用
荧光探针的研究及应用随着科技的不断发展，荧光探针逐渐成为生命科学研究领域中不可缺少的重要工具。
荧光探针是一种能够发射出荧光信号的分子，在分子生物学、生物医学和化学生物学等领域中有着广泛的应用。
它们可以被用来研究细胞内的分子相互作用、识别生物分子、分析细胞功能，并可以在体内用作活体成像和药物筛选的工具。
本文将简要介绍荧光探针的基本原理、常见的荧光探针类型和其在生物学研究中的应用。
一、荧光探针的基本原理荧光探针的基本原理是荧光共振能量转移（FRET），其通过将荧光分子与生物分子（生物样品）耦合，使两者之间发生相互作用，从而产生能量转移。
FRET 能量转移是从能量接受者的激发态到另一个分子的荧光染料的发射态的一种非辐射性能量转移。
在FRET中，激发荧光染料的光子会被共振耦合到另一个染料的激发态，从而使其发出荧光光子。
这样，在激发荧光染料的时候，可以用荧光染料的荧光光子来检测另一个染料的存在和位置。
荧光探针对于荧光光子的发射特征和其它的生化参数是很敏感的，所以它们可以被用来探测各种细胞和分子。
二、常见的荧光探针类型1. 荧光染料：荧光染料是最常见的荧光探针类型之一，它们有着广泛的应用，可以被用来标记蛋白质、核酸等生物分子。
常见的荧光染料包括荧光素、草铵膦、偶氮染料等。
2. 荧光蛋白：荧光蛋白是一种具有自发荧光性质的蛋白质，其最早源自于水母Aequorea victoria。
荧光蛋白可以用来跟踪胞内或胞外的重要过程，如蛋白质、核酸合成、信号传递等。
3. 量子点：量子点是一种半导体纳米粒子，具有窄的发射光谱、强的光稳定性和较大的荧光量子产率。
这些特点使得量子点成为新一代高亮度及高灵敏度的荧光探针。
三、荧光探针在生物学研究中的应用荧光探针广泛地应用于细胞内信息传递、化学生物学、生物传感、药物筛选和临床诊断等方面。
以下为举几个常见的案例：1. 细胞内信息传递：荧光探针可被用于研究细胞内信号转导、磷酸化和蛋白质相互作用等过程。
色氨酸残基荧光猝灭法
色氨酸残基荧光猝灭法色氨酸残基荧光猝灭法（Trp fluorescence quenching）是一种用于研究生物大分子的结构和功能的方法，尤其适用于蛋白质的研究。
在这种方法中，以色氨酸残基为荧光探针，探究蛋白质的结构和环境对其荧光强度的影响，进而探讨蛋白质的性质和功能。
在Trp fluorescence quenching方法中，荧光信号的猝灭是通过某些分子与色氨酸残基之间的电子转移过程实现的。
这些分子可能是溶液中存在的分子，如氧分子、甲醇分子等，也可能是蛋白质分子中的某些残基，如半胱氨酸、酪氨酸等。
这些分子与色氨酸残基之间的相互作用产生的荧光猝灭效应可以用来测量蛋白质的结构和环境等参数。
Trp fluorescence quenching的应用范围十分广泛，既可以应用于生物大分子的研究，也可以用于药物分子的筛选和研究。
在生物大分子的研究中，Trp fluorescence quenching可以用来研究蛋白质的构象和某些特定位点的环境。
同时，它还可以用来研究蛋白质与其他分子之间的相互作用，如蛋白质和DNA、 RNA之间的相互作用等。
在药物分子研究方面，Trp fluorescence quenching可以用来筛选和研究潜在的药物分子。
这是因为药物分子可能会与蛋白质中的某些残基发生特定的相互作用，从而导致荧光强度的变化。
利用这种现象，可以用Trp fluorescence quenching来筛选出对某种蛋白质具有特异性的药物分子。
总之，Trp fluorescence quenching是一种非常重要的生物物理学方法。
它不仅可以用来探究生物大分子的结构和性质，也可以用来筛选和研究潜在的药物分子。
在未来的研究中，Trp fluorescence quenching还有广阔的应用前景，有望为生物医学研究和药物开发提供更多有用的信息。
荧光探针的设计与应用实例
荧光探针的设计与应用实例荧光探针是一种用于检测、分析和监测生物分子、细胞和生物系统的工具。
它通过与目标分子产生特异性的相互作用，从而发生荧光信号的变化，进而实现对目标分子的定量或定性分析。
本文将介绍荧光探针的设计原理、常用的结构和应用实例。
一、荧光探针的设计原理荧光探针的设计基于分子间相互作用的原理。
通过选择合适的探针靶点和配体分子，可以实现对目标分子的高灵敏度和高选择性的检测。
常见的荧光探针设计原理包括荧光共振能量转移（FRET）原理、静态猝灭原理、电子转移原理等。
1. 荧光共振能量转移（FRET）原理FRET原理基于荧光分子间的能量传递。
当一个荧光分子（供体）与另一个荧光分子（受体）靠近并形成复合物时，供体吸收的能量可以通过非辐射的能量传递方式传递给受体，受体则通过辐射发出新的荧光信号。
FRET原理被广泛应用于蛋白质相互作用、细胞信号通路的研究中。
2. 静态猝灭原理静态猝灭是指非辐射能量转移导致荧光信号的猝灭。
当荧光探针与某种化学物质或生物分子结合时，它们之间的相互作用可以导致荧光信号的猝灭。
通过测量荧光信号的强度变化，可以得到目标分子的信息，如浓度、活性等。
3. 电子转移原理电子转移是指荧光分子和化学物质之间的电子转移过程。
当荧光探针与目标分子发生电子转移时，荧光信号的强度或波长会发生变化。
电子转移原理广泛应用于氧气、离子和分子的检测与测量中。
二、常用的荧光探针结构荧光探针的结构多种多样，常见的有有机染料、量子点、荧光蛋白和纳米粒子等。
不同的结构具有不同的荧光性质和应用特点。
1. 有机染料有机染料是最常用的荧光探针之一。
它们具有较高的荧光量子产率、较长的激发和发射波长范围以及较好的溶解性。
例如，吲哚染料家族是一类常用的有机染料，其结构简单、合成方法成熟，可用于蛋白质的荧光标记和细胞成像等应用。
2. 量子点量子点是一种具有特殊电子结构的纳米材料。
它们具有优异的荧光特性，如窄的光谱带宽、高亮度、抗光照衰减等。
荧光蛋白在细胞生物学中的应用
荧光蛋白在细胞生物学中的应用荧光蛋白（Fluorescent Protein,简称FP）是一种能够自发发射绿色光的蛋白质，被广泛应用于现代细胞生物学中。
它通过标记蛋白质、表达特定基因等方法，帮助科学家们观察细胞内分子的运动和互动，揭示生命的奥秘。
一、荧光蛋白的发现荧光蛋白最早发现于海葵，由日本科学家上田英寿于1961年发现。
上田利用UV光照射海葵的蛋白质，使其发射出绿色光芒。
这项研究开创了细胞标记的新时代。
后来，科学家发现荧光蛋白并不局限于海葵，许多物种都可以分泌这种神奇的蛋白质。
以青蛙黑脂肪细胞表达重组绿色荧光蛋白（recombinant green fluorescent protein，简称rGFP）为例，可以在细胞内直接观察蛋白质运动以及互相作用的行为。
这一发现在细胞生物学领域引起了巨大的反响，并在细胞物理学、分子生物学和神经生物学等多个领域得到了广泛的应用。
二、荧光蛋白的基本原理荧光蛋白是一种生物发光染料。
它由一个β桶型的结构组成，中心是一个色氨酸残基，周围有11种不同的丙氨酸染色基团。
当光照射到这些染色基团时，它们会吸收光的能量，并释放出一个高能电子。
该电子随后会被传递到色氨酸残基上，释放出一束特定波长的荧光光。
荧光蛋白的行为受许多因素的影响，如环境、 pH值、类似荧光素的色素和其它静电基团的存在。
但是，较为普遍的是，普通的荧光蛋白因环境的不同而发射的光是单一的绿色。
此外，在高温、低氧等恶劣环境下，荧光蛋白的荧光效率会下降。
三、荧光蛋白的应用1. 在体内标记某一分子荧光蛋白可以通过基因工程技术加入到动物或人体细胞内，作为某一个分子的标记。
比如利用绿色荧光蛋白标记肝带状病毒中的核酸，以便直接观察病毒的复制过程。
通过观察荧光信号的强度和时间变化，可以获得关于分子的很多信息，例如空间位置、分布情况和动态变化等。
2. 诊断疾病荧光蛋白在诊断疾病方面也有非常广泛的应用。
例如：可以通过将荧光蛋白与抗体结合，制成检测试剂盒，用于检测蛋白质或病毒的存在与否；或在很小很深的病灶内，通过荧光信号的强度来成像，辅助手术医生进行诊疗。
荧光分析技术在分子生物学中的应用
荧光分析技术在分子生物学中的应用荧光分析技术是一种利用特定的荧光标记物来探究生物分子相互作用和生物过程的工具。
作为一种强大的科研手段，荧光分析技术已经广泛应用在分子生物学领域，为生物学家们提供了有效的研究手段。
一、荧光探针荧光探针是荧光分析技术中的核心，其不仅仅可以被用来标记蛋白质、核酸、糖类等生物分子，还可以被用来探寻这些分子之间的相互作用。
常用的荧光探针包括荧光素、花青素、萤火虫荧光酶等化合物。
在分子生物学中使用最广泛的荧光探针是荧光素和荧光素衍生物。
这些化合物具有高度荧光发射效率和稳定性，并且可以通过小分子化合物或者蛋白质结合物的变化而产生荧光信号。
二、荧光共振能量转移技术（FRET）荧光共振能量转移技术是一种基于荧光信号传递的技术，用于探测蛋白质、核酸等生物分子之间的相互作用。
该技术基于两个特殊的荧光探针——受体和给体，这两种荧光探针分别发射不同波长的荧光信号。
当受体分子与给体分子靠近时，给体分子会通过荧光共振能量转移技术而发射出荧光信号，而这个荧光信号的能量来自于受体分子。
通过这种方式，研究人员可以得出有关分子之间的相互位置和相互作用的信息。
三、荧光显微镜荧光显微镜是荧光分析技术中最重要的工具之一，其可以在细胞水平上进行高分辨率成像，并进一步探究分子之间的相互作用。
与传统的显微镜不同，荧光显微镜通过使用荧光探针而不是普通的反射光来获得图像。
荧光显微镜通常具有高强度的光源和高灵敏度的摄像机，以及专用的荧光滤光片和物镜来获取高质量的图像。
可以通过在荧光显微镜中结合FRET技术来可视化细胞中分子之间的相互作用，并以此来更好地理解生物过程。
四、荧光酶标记技术荧光酶标记技术是一种将酶与荧光标记物结合的方法，用于检测蛋白质、核酸天然状态下活性的改变。
通过这种方法，研究人员可以更流程地监测生物分子的表达变化或活性的调整。
荧光酶标记技术是一个非常敏感的方法，可以用于监测微笑浓度的变化，从而支持癌症诊断和治疗过程的预测和监测。
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第13卷 第3期1998年6月荧光探针在蛋白质研究中的应用Ξ王守业 余华明 张祖德 刘清亮(中国科技大学化学系 合肥230026)大学化学 摘要 荧光探针技术是研究蛋白质在水溶液中构象的一种有效方法。
利用它可以测定蛋白质分子的疏水微区内两基团的距离以及酶与底物结合过程中蛋白质构象的变化等。
本文综述了荧光探针技术在蛋白质研究中的一些进展。
一、 引言 荧光探针技术是利用物质的光物理和光化学特性,在分子量级上研究在溶液中蛋白质构象的一种方法。
该方法的最大特点是具有高度的灵敏性和极宽的动态响应范围。
荧光探针物质之所以可被用来研究蛋白质的构象,主要是因为其具有特殊的光物理性质,如在不同极性介质中有着不同的光谱特性(即不同的峰值波长),不同的荧光量子产率和荧光寿命等。
因此,测定荧光探针物质和蛋白质分子结合后荧光峰波长、位移及量子产率的变化,就可探知其所处微环境的极性及其他有关性质。
利用荧光探针技术研究蛋白质在溶液中的构象有两种方法:一种是测定蛋白质分子的自身荧光,即“内源荧光”,另一种是利用荧光探测剂,即“外源荧光”。
若引人的荧光探测剂为有机分子,则该分子叫做有机荧光探针;若引入的荧光探测剂为稀土离子(如铽(Ⅲ)、铕(Ⅲ)等),则该离子叫做稀土离子荧光探针。
二、 荧光探针的某些光物理和光化学特征 1. 有机荧光探针的某些特征 最常用的有机荧光探针物质有12苯胺基萘282磺酸(ANS ),22对甲胺萘262磺酸(2062TNS )和12N 0N 2二甲胺基萘252磺酸(1052DNS )(dansyl acid ),其结构如图1:θθSO -3N θH θθSO -3N H θH 3C θθS O OClN H 3C CH 31,82ANS 2,62TNS 1,52DNS 2Cl图1 1082ANS,2062TNS 和1052DNS 2Cl 的结构 这些化合物在水溶液中基本不发荧光,量子产率低(低于0.1),但在非极性溶剂中,其量子产率大增,荧光峰蓝移,且能和许多蛋白质结合。
这种探针分子溶液的荧光光谱因溶剂极Ξ本文为国家自然科学基金资助项目。
性改变而变化的现象称为溶剂致变色效应(solventochromism).利用这些化合物在不同蛋白质分子中量子产率、峰位及谱带的变化,就可探测蛋白质分子结合区的极性、疏水性的大小,从而推论构象的稳定情况及变化等。
2. 稀土离子荧光探针的某些特征[1,2] 铕(Ⅲ)和铽(Ⅲ)是最常用的两种稀土荧光探针。
图2是铕(Ⅲ)和铽(Ⅲ)的荧光光谱[3]。
铕(Ⅲ)和铽(Ⅲ)的最大荧光峰分别出现在612nm和545nm处,分别对应于5D0→7F2和5D4→7F5跃迁。
图2 0.01mol/L Eu(Ⅲ)(a)和Tb(Ⅲ)(b)的荧光光谱 铽(Ⅲ)和铕(Ⅲ)f电子的激发方式有两种,即直接激发和间接激发。
488nm的激光光源可使铽(Ⅲ)发生7F6→5D4跃迁,这种激发方式为直接激发。
若通过激发邻近发色团,发色团将能量转移到铽(Ⅲ)和铕(Ⅲ)而使其激发的方式为间接激发。
铽(Ⅲ)和铕(Ⅲ)荧光光谱的高灵敏性和不同环境对荧光的影响等,使得铽(Ⅲ)和铕(Ⅲ)成为研究蛋白质的有效探针。
三、 利用荧光探针研究蛋白质活性部位微环境 作为一个好的荧光探针应满足以下条件[4]:①探针分子与蛋白质分子的某一微区必须有特异性的结合,并且结合比较牢固;②探针的荧光必须对环境条件敏感;③蛋白质分子与探针结合后不应影响其原来的结构和特性。
在满足这些条件的基础上可进行: 1. 在不均匀体系中结构类型分布的研究 ANS、TNS、DNS这一类极性荧光探针的荧光特性对周围介质的极性十分敏感。
根据这一特点,早期的研究曾用ANS作荧光探针研究了肌红蛋白和血红蛋白的血红素结合微区。
Prasad用Bis2ANS作荧光探针研究微管蛋白(Tubulin)[5],确定了Bis2ANS在微管蛋白上有两个结合部位,测得两个结合部位的解离平衡常数分别为217μm和2212μm。
Prasad的研究表明:当Bis2ANS等有机探针与蛋白质结合后,蛋白质上的Trp残基可将吸收的能量无辐射地转移到Bis2ANS等上。
除了ANS、TNS、DNS等对环境敏感的萘衍生物类探针外,Weber还合成出了另一类对环境敏感的萘衍生物探针[6]:62丙酰基222(N0N2二甲胺基)萘(FRODAN),22(N0N2二甲胺基)262萘酰242反2环己酸(DANCA)等。
其结构如图3:θθNCH3CH3C ORFRODAN:R=—CH2CH3DANCA:R=COOH 图3 FR ODAN和DANCA的结构 这些有机荧光探针就其结构而言,都有较大而明确的激发态偶极距。
Lasagna等用FRODAN和DANCA作荧光探针研究了辣根过氧化物酶的血红素结合部位。
Tolasa和Leah[7]最近设计并合成了一系列通式为Ar(2CH2)n2Q的荧光探针,这些具有双发色团的分子可与蛋白质形成氢键,产生疏水作用和静电作用,可用以研究这些探针的蛋白质结合性质,已用这些探针研究了血清蛋白和钙调蛋白。
当芘基探针PBAC(n=4,Q=N H+4)和钙调蛋白结合时,两芘基发色团分别结合在钙调蛋白的两相邻微区,引起钙调蛋白构象发生转变,此时PBAC形成一激态分子。
按照F ster偶极2偶极无辐射能量转移机理,结合在不同蛋白质上的铽(Ⅲ)与结合在同一蛋白质不同结合部位铽(Ⅲ)会有不同程度的铽荧光敏化。
正是这一特点可使我们利用稀土荧光探针研究蛋白质分子中金属离子结合部位的差异。
如含Trp残基的蛋白质内的钙(Ⅱ)结合的分类研究[8,9]。
铕(Ⅲ)的7F0→5D0跃迁为单线态到单线态的跃迁,若体系中所有的铕(Ⅲ)处于相同的环境,则对应于7F0→5D0跃迁激发峰为单峰,即监测激光诱导的7F0→5D0诱导激发峰形,可确定金属离子结合部位微环境是否相同。
如Mulqueen等利用Eu(Ⅲ)的7F0→5D0激发峰研究了钙调蛋白[10],结果表明Eu(Ⅲ)和钙调蛋白有两个强结合部位和两个弱结合部位。
2. 特定结合部位微环境研究 当一个分子的发射光谱和另一分子的吸收光谱相重叠时,通过分子间偶极2偶极的共振偶合可使能量从给体转移到受体。
按照F ster理论,能量给体和能量受体间距离r与能量转移效率为50%时所对应的临界能量转移距离R0及能量转移效率E之间有如下关系:r=R0(E-1-1)1/6(1)其中:R06=8178×10-25K2φn-4J(2) K2是和能量给体及受体跃迁矩相互取向有关的因子;n是溶剂的折射率;φ为当无受体存在时能量给体的荧光量子产率;J为光谱的重叠积分,且有:J=∫F(ν)ε(ν)ν-4dν∫F(ν)dν(3) F(ν)为能量给体的荧光强度;ε(ν)为能量接受体的摩尔消光系数,单位是(mol/L)-1 cm-1;ν是波数,单位是cm-1。
由临界转移距离R0(在计算R0时可认为能量给体与受体间相互取向是无规则的,此时因子K2=2/3)和实验测得的能量转移效率E就可测出能量给体与受体间的距离r。
在早期生化研究中曾对胰朊酶分子中的Trp与标记的丹酰(Dansyl)基两者之间的能量转移效率降低进行过研究。
这意味着在给体形成时,酶的构象发生了变化,导致它们间距离的增大,使能量转移效率降低。
又如Horrocks等测得嗜热菌蛋白酶中Trp残基与结合的铽(Ⅲ)间距离为0199nm[11],与X2ray衍射测得的0191nm很吻合;本课题组夏文胜等测定出皖南尖吻蝮蛇蛇毒中纤溶组份(FP)中Trp残基和结合的铽(Ⅲ)之间的距离为01566nm[12]。
水分子的振动可吸收铽(Ⅲ)和铕(Ⅲ)的激发能,即水分子使稀土离子激发能转移。
由于O—H的振动比O—D振动更有效地吸收铽(Ⅲ)和铕(Ⅲ)的激发能,在H2O和D2O的混合溶剂中,稀土离子激发态寿命随着H2O的摩尔分数的增加而缩短。
因此,比较稀土离子在H2O 和D2O中的激发态寿命可计算它们第一配位球上的水分子数。
Burroughs[13]比较了Eu(Ⅲ)结合caicineurin2B(CaN2B)后在H2O和D2O中激发态寿命,计算出Eu(Ⅲ)第一配位球上的水分子数为312±015和115±015,后者很可能代表4个Eu(Ⅲ)结合部位的平均值。
由于螯合剂与水合稀土离子络合时使稀土离子脱水,测定稀土离子的配位水分子数可确定蛋白质分子所提供的配位原子数。
另外,酸度影响Tb(Ⅲ)与蛋白质结合,通过观察p H对Tb(Ⅲ)荧光强度的影响,可得到蛋白质与Tb(Ⅲ)结合基团种类的信息。
3. 金属离子与蛋白质结合的计量化学 这方面的研究主要是利用稀土荧光探针。
通常利用Scatchard作图法处理荧光滴定数据,可解出蛋白质分子的金属离子结合部位数和结合常数。
如E pstein等对猪胰蛋白酶的研究[14],结果表明:稀土离子和猪胰蛋白酶有两个结合部位。
用Scatchard作图法测得Gd(Ⅲ)和猪胰蛋白酶的高亲和结合部位的结合常数为800mol-1・L。
从化学平衡过程来看,若蛋白质分子具有一个或一个以上相同的相互独立的稀土离子结合部位,由此得到的结合常数是可靠的;若蛋白质分子具有两个或两个以上不等价的稀土离子结合部位,由此得到的只是一个近似的估计结果。
如Breen等进行的各种离子在小白蛋白(parralbumin)中钙结合部位的结合以及关于钙调蛋白的类似研究[15],由各种稀土离子在钙调蛋白的钙(Ⅱ)结合部位的相对结合常数可知;稀土离子中钕(Ⅲ)的结合最牢固,这与钕(Ⅲ)的离子半径和钙(Ⅱ)的离子半径最接近这一事实相吻合。
四、 利用偏振荧光对蛋白质进行研究 荧光偏振在蛋白质荧光技术中是一个很重要的方面。
荧光偏振可用下式来计算:P=F∥-F⊥/F∥+F⊥(4)式中F∥和F⊥分别为与激发光偏振平面相平行和相垂直的偏振发光强度。
当P等于零时,即为完全不偏振;而当P在-1和+1之间时,即为部分偏振,这种去偏振现象可以说明发射体在激发态的信息。
当面偏振光与被叫做电偶极矩(electric dipole moment)的发色团的特定轴平行时,生色团对偏振的吸收最大,通常生色团是任意取向的,所以吸收偏振光的几率是和cos2θ成正比的,这里θ是偏振面和电偶极矩的夹角,发射荧光的面偏振不是用吸收偶极矩(absorption dipole moment)测定的,而是用跃迁偶极矩(transition dipole moment)测定的(跃迁偶极矩通常和吸收偶极矩不平行),所以P总是小于1,故被叫做荧光去偏振,增加去偏振程度的两个最重要的因素是吸收体的运动和生色团之间的能量转移。
通过去偏振的测量,可得到发射体分子的大小、形状等信息。