植物细胞培养生物反应器研究进展
植物细胞的固定化培养
第１７卷第２期浙江：ｈ＂－Ｙ－学院学报！！！！篓！旦！！！塑！！！！三！墅！竺！些竺！墅丝！些！垒植物细胞的固定化培养王素芳（浙江万里学院。
宁波３１５１００）ｖ。
１．１７Ｎｏ．２Ａｐｒ２００４摘要；植物细胞培养己成为生产医药、食品、化妆品等重要化台物盯‘条新途径．在提高次级代谢物产龋的研究中，崮定化培养逐步硅示其优势文章重点介绍了崮定化培养的特点、固定化疗法、固定化反麻器和产物的释放四个方面的内容关键词：物细胞：固定化培养：固定化方法；产物释放；同定化反应器中田分类号：Ｑ８１３Ｉ“文献标识码：Ａ文章编号：１６７Ｉ－－２２５０（２００４）０２一００９６一０３收稿日期：２００３一ＩＩ－－０５作者镝介：于素芳，浙江万里学院生物与环境学院讲师．１９０２年．Ｈａｂｅｆｌａｎｄｔ在营养液中成功地培育了单个植物细胞，为植物细胞的培养翻开了新的一页．随厉，很多科学家对完善植物细胞培养技术展开了研究．１９７９年，Ｂｒｏｄｅｌｉｕｓ首次将高等植物细胞同定化培养以获得甘的次级代谢产物．此后，植物细胞的同定化培养得到不断的发展．逐步显示其优势．据币完全统计．约有５０多种植物细胞已成功地进行了固定化培养．１固定化培养的特点经过多年的研究发现，与悬浮培养相比，固定化培养具有很多优点：（１）提高了次生物质的合成、积累；（２）能跃时间保持细胞活力：（３）可以反复使用；（４）抗剪切能力强；（５）耐受有毒前体的浓度高；（６）遗传性状较稳定；（７）后处理难度小等特点．在近几年的研究巾，不少学者又发现了固定化培养的新优点．１．１更好的光台作用一般情况下。
由于在固定化细胞团中形成了光密度梯度，内部的细胞有了较好的生长，所以固定化有助于植物细胞的光台作用Ｋｕｒａｔａ等培养用海藻钙凝胶固定阿拉伯咖啡细胞，发现生物碱产量与光密度的变化一致，而且细胞的生长小被高的光密度抑制．１．２促进或改变产物的释放在固定化培养中，产物和对细胞生Ｋ有抑制作用的代谢物可被培养基带走，这样，一方面有利于产物的生成，另一方１：５【『也防ｆ』：了已生成产物的进一步降解转化．Ｓｈｉｂａｓａｋｉ．ＫｉｔａｋａｗａＮ等…实验证明烟草细胞的固定化促进了其产物酚醛塑料（ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ）的释放．而ＧｉｌｌｅｔＦ和ＲｏｉｓｉｎＣ等““发现包埋的烟草细胞（Ｎｉｅｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）和Ｓｏｌａｎｕｍａｖｉｃｕｌａｒｅ，能够将在悬浮培养时１ｉ释放的异东莨糟酵（Ｓｃｏｐｏｌｉｎ）释放到培养基中．２固定化方法２．１传统固定化方法包埋法是目前最普遍采用的固定化方法．特别是海藻胶包埋法，条件温和、价格便宜、方法简单，且特别适用于脆弱、敏感的植物细胞“’．吸附法ｉ乜是一种比较温和的同定化方法。
植物细胞培养
植物细胞培养一、定义●在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。
●植物中含有数量极为可观的次生代谢物质，是各种色素、药物、香精、酶等天然产物的主要来源。
●植物细胞培养具有以下优点：1、提高产率2、缩短周期3、提高产品质量4、易于管理，减轻劳动强度因此主要用于生产色素、药物、食品、酶、精细化工产品等次生代谢物。
二、培养基常用MS培养基，另外还有B5、N6、NT、AA、KM8p等培养基三、单细胞培养1、制备方法（1）机械法（机械磨碎、切割）（2）酶解法（目前最有效的获得单细胞方法）（3）愈伤组织诱导法（高频振动愈伤组织）2、培养方法（1）平板法（似微生物平板培养）（2）看护培养与饲养层培养法看护培养：将单个细胞接种到滤纸上再置于愈伤组织之上进行培养。
饲养层培养：用处理过（如X射线）的无活性的或分裂很慢、不具分裂能力的细胞来饲养细胞。
（3）液体浅层静置培养法：将一定密度的悬浮细胞在培养皿中形成浅薄层，封口静止培养。
（4）细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。
①低温法：冷处理可提高培养体系中细胞同步化程度。
②分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。
③饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。
④抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，如尿苷等，使细胞滞留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。
3、保存（1）继代培养（高等植物、海藻等）（2）低温（ 5℃～10℃）（3）冷冻（ -20℃或液氮）植物细胞冷冻保存方法：在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂，密封，继续冰浴15min，在-40℃停留2h后投入-196℃液氮罐中保存。
植物细胞工程(中国药科大学生物工程所有课件)
如何提高植物细胞工程的效率与效益
优化培养条件
通过优化培养基组成、气体交换、光照、温度等培养条件，提高 植物细胞生长和代谢的效率。
基因工程技术的应用
利用基因工程技术对植物细胞进行遗传改良，提高其生长速度、次 生代谢产物产量和品质。
生物反应器的设计优化
通过改进生物反应器的设计，提高细胞培养的密度、产物产量和分 离纯化效率。
诱导分化与植株再生
在适宜的条件下，诱导细胞分 化形成器官和组织，最终发育
成完整的植株。
植物细胞培养的常见问题与解决方案
污染问题
染色体变异
培养过程中可能出现的污染包括细菌、 霉菌等，解决方法包括严格控制无菌 操作、定期更换培养基等。
长期培养的植物细胞可能出现染色体 变异的现象，解决方法包括选择适当 的培养条件、采用低温保存等。
植物细胞工程(中国药科大学生 物工程所有课件)
目录
CONTENTS
• 植物细胞工程概述 • 植物细胞培养技术 • 植物基因工程在细胞培养中的应用 • 植物细胞工程在药物开发中的应用 • 植物细胞工程的前沿技术与发展趋势
01
CHAPTER
植物细胞工程概述
植物细胞工程的定义与特点
植物细胞工程定义
植物细胞工程是一门利用植物细胞进 行遗传操作和发育控制的生物工程技 术。
培养基成分
植物细胞培养需要含有糖、维生素、 氨基酸、无机盐、植物生长调节物 质等营养成分的培养基。
植物细胞培养的流程与操作
细胞分离
从植物组织中分离出细胞，常 用的方法有酶解法、机械法等
。
细胞筛选与培养
将分离出的细胞进行筛选，选 择具有生长优势的细胞系进行 培养。
细胞扩大培养
动物细胞和植物细胞培养反应器
六叶罗式搅拌器实物图
后来，有人使用锚式搅拌器和螺旋式搅拌器进行植物细胞的培养，
也取得了较好的效果。一般认为螺旋式搅拌器效果最优。
锚式搅拌器和螺旋搅拌器植物细胞培养反应器
吸筒式搅拌器和帆式搅拌器也常用于植物细胞的悬浮培养中， 其结构如下图所示。吸筒式搅拌器的结构原理在本章动物细胞培养 反应器中会有详细介绍，帆式搅拌器结构相对简单，由四片较大的 搅拌叶组成。这两种搅拌在使用时转速都不高，一般在30～80转/分。
吸管式搅拌器和帆式搅拌器
搅拌桨是用尼龙丝编织带制成帆形，搅拌轴用磁力驱动旋转， 转速为20~50r/min，氧气通过插入溶液中的硅胶管扩散到培养 液内，以维持培养液内一定的溶解氧水平。
带帆形搅拌器的连续灌注系统培养反应器
/sbs.asp?id=118
第
三
章
植物细胞和动物细胞 培 养 反 应 器
动植物细胞培养与微生物细胞培养有很大的不同。 动物细胞培养与微生物培养区别： • 动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固 体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、 葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。动物细胞对环境敏感，包括pH、 溶氧、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监 测和控制。 植物细胞培养与微生物培养区别： • 植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细胞培养一 般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物，以及植物细胞生 长较微生物要缓慢，长时间的培养对无菌要求及反应器的设计也提 出特殊的要求。
悬浮培养瓶
小规模悬浮培养
3、固定化培养：是指采用吸附（固体吸附剂）、共价贴附 （与固相载体结合）、共价交连（用试剂处理使细胞间形 成桥而絮结）、包埋（将细胞包埋在多孔材料内）等方法 将细胞固定在支持物上，或将细胞嵌入微囊或高分子聚合 物的网络中进行培养。该方法对贴壁依赖性细胞与非贴壁 依赖性细胞均适用。
植物瞬时表达系统的研究进展
植物瞬时表达系统的研究进展植物瞬时表达系统（Plant transient expression system）是一种用植物作为生物反应器来表达外源基因的技术。
相对于传统的植物基因转化技术，植物瞬时表达系统具有操作简单、高效快速、适应性强等优点，因而在植物基因工程研究和产业化应用中得到了广泛应用。
近年来，植物瞬时表达系统在实验室中的应用日益增多，其研究进展也取得了很多重要的突破。
下面将就植物瞬时表达系统的研究进展进行详细的介绍。
一、植物瞬时表达系统的基本原理与方法植物瞬时表达系统是利用植物体内的洋结球病毒、冠状病毒等病毒载体，通过基因枪法、电穿孔法、冻融法等方法将外源基因或者载体转移到植物细胞中，然后通过植物细胞的生物机制来表达这些外源基因。
基本原理是：将目标基因的DNA序列插入病毒载体中，然后将这个病毒载体引入植物细胞，并利用植物细胞自身的转录和转译系统来表达目标基因。
植物细胞内的RNA聚合酶和核糖体可以识别和转录由病毒载体上的启动子引导的目标基因的RNA序列。
当前，植物瞬时表达系统主要包括两种方法：基因枪法（Gene gun method）和冷冻质子法（Cold protonema method）。
基因枪法是一种通过高速微粒束将外源基因转入植物组织或者细胞内的方法。
利用基因枪设备，通过调节高压氦气或者氮气，将导入的DNA颗粒射入目标组织。
该方法可以用于不同的植物组织、细胞和亚细胞的转化，适用性广泛。
而冷冻质子法则是利用电极直接将导入的DNA或RNA质子射向目标组织或细胞的方法。
冷冻质子法可以实现更高的转化效率，并可用于大规模的瞬时表达培养。
近年来，植物瞬时表达系统的研究进展迅速，主要体现在以下几个方面：1. 高效快速的基因转导技术：研究人员通过改进基因枪和冷冻质子等转导技术，提高了基因表达的效率和速度。
通过优化基因枪药剂的配方和冷冻质子的射击参数，可实现更高的表达效率。
2. 外源基因表达的调控：研究人员通过基因工程技术，构建了一系列的响应子集和调控元件，实现了对外源基因表达的调控。
第一章_生物反应器.
细胞的培养和代谢还是一个复杂的群体的生命 活动，通常每毫升培养液中含104-108个细胞。 而且，像任何有生命的东西一样，细胞也经历 着新生、成长、成熟直至衰老的过程，在其生 命的循环中，也存在退化与变异的问题。
细胞群体进行简化假设
是否考虑细胞内部复杂的结构
是否考非理想流动 两种理想流动模式
①全混式，即反应器内各点浓度及其它条件均一。
②活塞流式，即反应器内物质沿一定方向流动， 完全没有反向混合。
实际反应装置常常介于两者之间。
⑸细胞生长的特点及细胞群体的描述
细胞的生长、代谢是一个复杂的生物化学过程 与一般的化学过程不同，这个反应体系的特点 是，它是一种多相、多组分、非线性的体系。
二、细胞浓度及其测量
细胞浓度在培养过程中是一个十分重要的参数。
在定量研究生物反应之前，首先需要说明微生 物的浓度即菌体浓度的表示方法。 （g/l, kg/m3)
直接测定法
细胞干重法：测量细胞浓度的最基本方法。 显微计数法：显微镜和血球计数器。 平板计数法：生理盐水稀释，记录菌斑。 浊度法：波长600-700nm范围测量。
化学工程还包括下面几个重要的内容
1、流体的输送及混合。核心问题是流体之间动量 的传递、机械能的转化。 2、热量的传递。生物反应器要考虑发酵热的传 出以及发酵罐温度的控制。 3、物质的传递。生物反应器内进行着各种物质 传递过程，这些传递过程的强度主要由浓度差 以及扩散的面积决定。
第二节 细胞生长及代谢过程动力学
如何使细胞生长的更快更好？
一、好的细胞株系 二、良好的环境条件
1、良好的物理环境：最主要的有温度、pH、溶氧量、合 适的混合强度以保证细胞与营养物的接触及细胞的悬 浮等。 2、合适的化学环境：要求有合适的各种营养物的浓度， 并限制各种妨碍生长代谢的有毒物质的浓度。
《生物反应器》课件
REPORTING
生物反应器的结构设计
结构设计原则
生物反应器的结构设计应遵循简 单、稳定、高效的原则，确保工 艺流程的顺畅和生产效率的提高
。
结构种类
常见的生物反应器结构包括搅拌槽 式、固定床式、流化床式、膜式等 ，应根据生产需求和工艺特点选择 合适的结构形式。
结构设计要素
结构设计需考虑进出料、换热、消 泡、搅拌等装置的配置，以及反应 器容积和放大效应等因素。
PART 04
生物反应器的应用实例
REPORTING
工业生产中的应用实例
微生物发酵
利用生物反应器进行微生 物发酵，生产酒精、抗生 素、酶制剂等产品。
动物细胞培养
通过生物反应器大规模培 养动物细胞，生产疫苗、 单克隆抗体等生物药物。
植物细胞培养
利用生物反应器进行植物 细胞培养，生产天然植物 次生代谢产物。
生物反应器的应用领域
生物制药
用于生产各类抗体、疫 苗、细胞因子等生物药
物。
农业领域
用于植物细胞培养、动 物细胞培养等，以生产
转基因作物和动物。
环保领域
用于处理废水、废气等 环境污染问题，以及资
源回收和再利用。
食品工业
用于生产各类食品添加 剂、调味品、酶制剂等
。
PART 02
生物反应器的工作原理
REPORTING
定律。
酶的活性受到温度、pH值、底物浓度等多种因素的 影响，因此在生物反应器的操作过程中需要密切关注
这些参数的变化。
生物反应器的物质转化涉及到各种化学物质的 合成和分解过程，这些过程通常是由酶催化的 。
酶是生物反应器中最重要的物质转化催化剂之一 ，它能够加速化学反应的速率并降低活化能。
植物细胞培养(Plant cell culture)
四、悬浮培养细胞的同步化
低温处理 提高培养体系中细胞同步化的程度
第二节 单细胞培养
细胞平板培养(cell 细胞平板培养(cell plating culture) 植板率: 植板率:能长出细胞团的单细胞在接种单 细胞中所占的比例. 细胞中所占的比例.
看护培养(nurse 看护培养(nurse culture)
四、悬浮培养细胞的同步化
分选法 通过细胞体积大小分级, 通过细胞体积大小分级,直接将处 于相同周期的细胞进行分选, 于相同周期的细胞进行分选,然后将同 一状态的细胞继代培养于同一培养体系 中. 梯度离心法 流式细胞仪
四、悬浮培养细胞的同步化
饥饿法 饥饿导致细胞分裂受阻, 饥饿导致细胞分裂受阻,使细胞不能合成 DNA,即不能进入S DNA,即不能进入S期;或细胞分裂不能进 行,即不能进入M期. 即不能进入M 抑制剂法(5-氟脱氧尿苷,羟基尿) 抑制剂法(5-氟脱氧尿苷,羟基尿) 通过一些DNA合成抑制剂处理细胞, 通过一些DNA合成抑制剂处理细胞,使 细胞滞留在DNA合成前期, 细胞滞留在DNA合成前期,当解除抑制 后,即可获得处于同一细胞周期---G1期的 即可获得处于同一细胞周期---G 同步化细胞. 同步化细胞.
三、悬浮细胞的生长动态
生长呈S 生长呈S形生长曲线 起始密度(x 起始密度(x0):0.5x105-2.5x105 生长速率(p) 生长速率(p) p=(lnxp=(lnx-lnx0)/t 单位体积细胞重量 鲜重:按一定体积取样, 鲜重:按一定体积取样,经真空过滤后称重 干重:真空过滤后, 80℃条件下烘干细 干重:真空过滤后,在80℃条件下烘干细 胞至恒重
植物细胞规模化培养体系的建立
半连续培养(semi半连续培养(semi-continuous culture) 两步培养法 生长培养基 合成培养基