NGAL原核表达及多克隆抗体的制备
多克隆抗体制备免疫小鼠 (2)
多克隆抗体制备免疫小鼠简介多克隆抗体制备是一种常用的实验技术，用于获得特定蛋白质及其表位的抗体。
免疫小鼠是多克隆抗体制备的常见动物模型之一。
本文将介绍多克隆抗体制备免疫小鼠的一般流程和关键步骤。
流程多克隆抗体制备免疫小鼠的流程主要包括以下几个步骤：1.抗原制备：准备目标蛋白质作为免疫小鼠的抗原，可以是纯化的蛋白质、重组蛋白质或合成的多肽。
2.免疫小鼠：将抗原与适当的佐剂混合，注射到小鼠体内，观察免疫反应情况。
3.收集抗体：采集小鼠的血液样本，离心分离血清，获得抗体。
4.抗体筛选：使用各种筛选方法（如酶联免疫吸附试验、免疫组织化学染色等）筛选出特异性较好的抗体。
5.抗体纯化：通过亲和层析、离子交换层析等技术，对抗体进行纯化，得到高纯度的抗体。
关键步骤抗原制备抗原制备是多克隆抗体制备的关键步骤之一。
抗原质量的好坏直接影响免疫小鼠及最终制备的抗体的质量。
以下是一些常见的抗原制备方法：•纯化蛋白质：通过基于亲和层析、离子交换层析等技术，从含有目标蛋白质的来源中纯化目标蛋白质。
•重组蛋白质：利用基因工程技术在大肠杆菌或其他表达系统中表达目标蛋白质，然后通过亲和层析或其他纯化方法纯化目标蛋白质。
•合成多肽：合成目标蛋白质的特定片段或多肽，用于免疫小鼠。
适当的佐剂适当的佐剂对于免疫小鼠产生良好的免疫响应非常重要。
佐剂的作用是增强抗原的免疫原性和稳定性，促进免疫细胞的活化。
常用的佐剂包括完全佐剂（如完全弗氏佐剂）和不完全佐剂（如不完全弗氏佐剂）。
免疫小鼠免疫将抗原与适当的佐剂混合后，通过皮下注射、腹腔注射等方式将抗原注射到小鼠体内。
注射后，可以观察小鼠的免疫反应情况，如产生抗原特异性抗体。
血液采集和抗体收集一段时间后，如一般在免疫小鼠体内产生可检测到的抗体，可以采用静脉采血的方式采集小鼠的血液。
血液离心后，就可以获得含有抗体的血清。
抗体筛选和纯化获得含有抗体的血清后，可以使用各种筛选方法对抗体进行筛选，如酶联免疫吸附试验（ELISA），免疫组织化学染色等。
小鼠骨桥蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定
小鼠骨桥蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定刘祥;陈春琳;王杨科;俱雄;吴三桥;张涛【摘要】为探索骨桥蛋白(OPN)调控骨代谢及与肿瘤的关系,本试验利用DNAMAN与Mega 5.02软件分析OPN蛋白系统进化关系;采用RT-PCR与分子克隆方法制备OPN蛋白表达载体;利用SDS-PAGE电泳切胶纯化、尿素浓度梯度复性获得OPN蛋白,免疫小鼠制备OPN蛋白多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体滴度,Westernblotting检测抗血清特异性.OPN序列的同源性比对分析发现,在不同进化层次动物中均存在Arg-Gly-Asp(RGD)短肽重复序列;OPN序列系统进化分析显示,OPN在动物间具有明显的进化趋势;提取小鼠肝脏RNA,OPN重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果及蛋白表达、纯化条带大小均与预测一致;ELISA法确认OPN抗血清滴度达1∶1 600;Western blotting证实抗血清具有很好的特异性.结果表明本试验对OPN序列进行了遗传进化分析,成功克隆、表达、纯化及复性OPN蛋白,并制备、鉴定了小鼠多克隆抗体.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)005【总页数】7页(P1069-1075)【关键词】OPN蛋白;RT-PCR;多克隆抗体;ELISA;Western blotting【作者】刘祥;陈春琳;王杨科;俱雄;吴三桥;张涛【作者单位】陕西理工学院生物科学与工程学院,汉中723001;陕西理工学院生物科学与工程学院,汉中723001;陕西理工学院生物科学与工程学院,汉中723001;陕西理工学院生物科学与工程学院,汉中723001;陕西理工学院生物科学与工程学院,汉中723001;陕西理工学院生物科学与工程学院,汉中723001【正文语种】中文【中图分类】Q786骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种分泌型的非胶原骨基质糖蛋白［1］，具有8 个α－螺旋和6 个β－折叠结构；存在与整合素受体结合的高度保守序列（Arg－Gly－Asp，RGD）［2］，介导细胞与细胞、细胞与基质之间的黏附作用［3］，调节胞内Ca2＋浓度、NO 水平［4］。
9、多克隆抗体的制备
（二）血清的分离
采血时一般不加抗凝剂，全血在室温中自然凝固， 在灭菌容器中使之与空气有较大的接触面。 先置于37℃ 1～2h，然后置于4℃冰箱过夜，次 日离心收集血清。 采血量大时，用自然凝固加压法 无菌的血清，组批分装，保存于之-15℃半成品 库，待抽检合格后交成品库保存。
多克隆抗体 （高免血清）制备技术
一般是指利用微生物及其代谢产物等作为免疫原，
经反复多次注射同一动物体，所生产的一类高效
价抗体，主要包括高度免疫血清、卵黄抗体和牛 奶抗体等
高度免疫血清简称高免血清（hyperimmune serum），又称免疫血清（immune serum）或抗 血清（antiserum） 分为抗病血清和抗毒素
产蛋鸡（鸭和鹅）感染某些病原后，其血清和蛋 黄内均可产生相应的抗体。
蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预 防和治疗，称为卵黄抗体（yak antibody）。 卵黄抗体可以在一定程度上克服血清抗体成本较 高、生产周期较长的弱点，并且具有用同批动物 连续生产的优点。 有潜伏野毒的危险，对生产用鸡应严格检疫。
七、血液采集与血清提取
按照免疫程序完成免疫的动物，经采血检验 （试血），血清效价达到合格标准时，即可 采血。
不合格者，再度免疫，多次免疫仍不合格者 淘汰。
（一）采血次数和方法
效价高峰在最后一次免疫后的7～10d。
采血可以全放血或部分采血。
放血前，动物应禁食24h，但需饮水以防止血 脂过高。
制备多克隆抗体的流程
制备多克隆抗体的流程英文回答：The process of generating monoclonal antibodies involves several steps. Here is a general outline of the procedure:1. Immunization: The first step is to immunize an animal, typically a mouse or a rat, with the specific antigen of interest. The antigen can be a protein, peptide, or even a whole cell. The animal's immune system recognizes the antigen as foreign and mounts an immune response, producing a diverse population of antibodies.2. Cell Fusion: After a sufficient immune response is generated, the next step is to harvest immune cells, usually from the spleen, of the immunized animal. These cells, called B cells, are responsible for producing antibodies. B cells are fused with myeloma cells, a type of cancerous cell line that can divide indefinitely. Thisfusion creates hybridoma cells, which have the ability to produce antibodies and divide indefinitely.3. Selection: The fused cells are then cultured in a selective medium that allows only the hybridoma cells to survive. This medium usually contains a substance that prevents the growth of unfused cells and myeloma cells. The surviving hybridoma cells are then screened for antibody production.4. Screening: Screening involves testing the culture supernatants of the hybridoma cells for the presence of specific antibodies against the antigen of interest. Various techniques can be used for screening, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or immunofluorescence. Positive clones that produce the desired antibodies are selected for further analysis.5. Cloning: To ensure monoclonality, the selected hybridoma cells are subjected to limiting dilution, where single cells are distributed into individual wells of a culture plate. This process allows for the isolation ofindividual clones derived from a single cell. Each clone is expanded and tested for antibody production.6. Antibody Production: The selected monoclonal antibody-producing clones are grown in culture to produce a large quantity of antibodies. The antibodies can be harvested from the culture supernatant or purified using various techniques, such as protein A/G affinity chromatography.7. Characterization: The generated monoclonal antibodies are characterized for their specificity, affinity, and functionality. This involves further testing, such as Western blotting, immunohistochemistry, or flow cytometry, to determine the antibody's ability to recognize the target antigen.8. Scale-up and Production: Once the monoclonal antibodies are characterized, they can be scaled up for production. This involves large-scale culture of the selected hybridoma cells to generate a substantial amount of antibodies for research or therapeutic applications.中文回答：制备多克隆抗体的流程涉及几个步骤。
多克隆抗体制备的技术_PPT幻灯片
• 纯化：盐析法
•
凝胶过滤法
•
离子交换层析法
•
亲和层析法
•
电泳分离法
• 浓缩：吸收浓缩
•
蒸发浓缩
•
超滤浓缩
• 研钵乳化法 • 直接在旋涡振荡器上乳化 • 组织捣碎器乳化 • 注射器乳化 • 胶体磨
二、动物免疫
（一）免疫动物的选择
选择动物时应考虑以下因素： ①抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫 动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越 好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。 ②动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的 正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用 家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选 用绵羊、山羊、马、驴等大动物。 ③抗原性质与动物种类
•
合成类载体：人工合成的多肽聚合
物
2.连接方法
半抗原与载体的连接有物理法和化学法。
• 物理法 是用物理吸附法将载体与半抗原连 接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原， 吸附载体主要有PVP和CMC等；
• 化学法 是利用某些功能基团把半抗原连接 到蛋白质类或多肽类聚合物载体上。不同的 半抗原应选用不同的方法进行连接。
（二）免疫方法
• 根据抗原的性质、免疫原性和动物的免疫 反应性来决定免疫途径、免疫次数和间隔 时间等肉注射
•
静脉注射
•
腹腔注射以及淋巴结内注射
• 注射间隔时间：
• 带佐剂的皮内、皮下注射，一般为间隔 2～ 4 周免疫一次。
• 不带佐剂的皮下或肌肉注射，一般为 1～2 周间隔时间；肌肉或静脉免疫的，可 5 天 左右的间隔时间。
抗原的提取与纯化
• 提取：
• 水溶液提取法 • 有机溶剂提取法 • 纯化： • 超滤，盐析，电泳，凝胶过滤，离子交换，
烟碱酰胺合成酶基因的原核表达及多克隆抗体制备
等 生理 生化 活动 中起 了至关 重 要 的作用 。
目前研 究人 员 已从许 多植 物体 内克 隆 出 ＮＡＳ基 因 ， 大麦 （ ｒ ｅ ｍ ｖ ｌ ａ ｅ 、 麦 （ ｒｔ ｕ ｅｔ ｕ 、 如 Ｈｏ ｄ ｕ ｕ ｇ ｔ ） 小 Ｔ ｉ ｃ ｍ ａ ｓ ｖ ｍ） ｉ ｉ 燕 麦 （ ｅ ａｓｔ ａ 、 Ａｒ ｎ ｉ ） 水稻 （ ｒ ｚ ｔ ａ 、 ａｖ Ｏ ｙ ａｓ ｉ ） 玉米 （ ｅ ｙ ） 番 茄 （ ｙ ｏ ｅｓ ｏ ｓｕｅ ｔｍ） 拟南 芥 （ ａ ｉ ｏ ～ ａｖ Ｚ ａｍａ ｓ 、 Ｌ ｃｐ ｒｉ ｎ ｃ ｌｎｕ 、 ｃ ｅ Ａｒｂｄ ｐ ｓ ａｉｎ ） ｉ ｔ ｌ ａ 等植 物 ｓｈ ａ 。 。大麦 中 的 ＮＡＳ基 因 ＮＡＳ ＨＯＲ１已被成 功 克 隆嘲 ， 试 验拟 构建 该基 因的原 核表 达载 本 体 ， 制备 多 克隆抗 体 ， 并 旨在 检测 该基 因在草 坪草 中的表 达技 术手 段 ， 为其 功能 研究 奠定 基 础 。 并
现 转基 因烟 草 的幼 叶出现 脉 间黄化 、 畸形 、 育 ， 花 不 这些 现象 表 明烟 碱酰 胺在 植 物 的生 长 、 的发 育 中起着 重要 的 花
作 用 。因此认 为催 化 烟碱 酰胺 合成 的 烟碱 酰胺合 成 酶在 铁元 素 的 吸收 和运 输 、 氧 化胁 迫 、 抗 植株 正常 生 长和发 育
原核表达及抗体的制备
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。
转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。
42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。
将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。
然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。
感受态细胞的制备1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。
2．取50UL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。
以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行：3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。
在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。
注意：1mL的取液器设定在500mL。
悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。
4．将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。
细胞可以立即使用或储存。
5．将感受态细胞迅速转移到-20℃或更低的低温冰中。
注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。
转化：1．新鲜制备的或-20℃下保存的感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。
2．取200UL的感受态细胞，加入适量的重组子，轻轻混匀.3.冰浴30min.4．42℃水浴热激90秒。
5．冰上放置2-5分钟。
6．加400UL LB培养液，37℃振荡培养45分钟。
7．将适量的菌液涂布在Amp/LB（Amp50ug/ml）琼脂平板上。
纳豆激酶原核表达纯化及多克隆抗体的制备
纳豆激酶原核表达纯化及多克隆抗体的制备朱立成;张耀洲【期刊名称】《浙江大学学报（理学版）》【年(卷),期】2006(033)004【摘要】纳豆激酶是一种源于日本传统食品纳豆且具有强烈溶栓作用的丝氨酸蛋白酶.本研究将编码信号肽、前导肽和成熟肽在内的纳豆激酶基因克隆到原核表达载体pET28a+中,获得重组表达质粒pETNK.将此重组表达载体质粒转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达.SDS-PAGE结果显示纳豆激酶在大肠杆菌中成功表达,表达的纳豆激酶融合蛋白分子量大约为31kD.亲和层析法纯化表达产物,并以此纯化产物作为免疫原免疫新西兰大白兔,制备兔抗纳豆激酶血清,用ELISA和Western blotting对制备的兔抗血清中的多克隆抗体进行了鉴定.纤维蛋白平板实验显示,表达的纳豆激酶融合蛋白具有较好的溶纤活性.【总页数】4页(P447-450)【作者】朱立成;张耀洲【作者单位】浙江大学,生命科学学院,浙江,杭州,310029;浙江理工大学,生命科学学院,浙江,杭州,310018【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.卵形鲳鲹TNFSF6的原核表达、纯化与多克隆抗体的制备 [J], 王鹭;李海平;周永灿;孙云;曹贞洁2.双孢蘑菇中精氨酸酶的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 [J], 奚志嫒;杨可心;孟德梅3.牛病毒性腹泻病毒NS3蛋白原核表达纯化及多克隆抗体的制备 [J], 周子恒;张哲;肖盛中;蔡卓轩;李岩;张彦红;杨艳;陈创夫;盛金良4.Cpf1核酸酶的原核表达、纯化及多克隆抗体制备与鉴定 [J], 董彬;王君;孙静;王报贵;孙春龙;吴涛5.绵羊FHL2蛋白原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体的制备 [J], 聂晓宁;李闰婷;陈龙欣;李玉华;聂文营;张丽萌;王林青因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大鼠神经球蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
大鼠神经球蛋白的原核表达及多克隆抗体制备朱继【期刊名称】《第三军医大学学报》【年(卷),期】2008(30)4【摘要】目的克隆Wistar大鼠神经球蛋白(NGB)基因,通过原核表达制备其多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础。
方法从雄性Wistar大鼠脑组织中提取总RNA,经逆转录PCR得到cDNA,测序证明该基因序列正确后,亚克隆入pET-28a(+)载体中,通过双酶切和测序确定序列和阅读框正确。
转化大肠杆菌BL21菌株,获得可溶性表达产物,经鉴定、纯化后免疫新西兰兔,分离血清,ELISA法测定抗体效价。
结果神经球蛋白多克隆抗体效价达1∶100000,此多抗可以与293细胞内表达的重组蛋白发生很好的抗原抗体反应。
结论成功制备了兔抗NGB的多抗,为后续研究提供了重要的实验材料。
【总页数】3页(P326-328)【关键词】神经球蛋白;原核表达;多克隆抗体【作者】朱继【作者单位】重庆医科大学附属第一医院神经外科【正文语种】中文【中图分类】R341;R392-33【相关文献】1.灰飞虱原肌球蛋白的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备 [J], 徐秋芳;陈晴晴;倪海平;李硕;张金凤;周益军2.细粒棘球六钩蚴副肌球蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备 [J], 袁方园;贾斌;王绪海;杜迎春;孙丽蓉;李鑫;李亚强;沈文3.鳜鱼肌球蛋白重链基因的原核表达及多克隆抗体的制备 [J], 刘希良;王开卓;成嘉;蒙涛;陈敦学;李玉珑;张红芳;张建社;褚武英4.重组大鼠肝再生增强因子原核表达载体构建及多克隆抗体制备 [J], 刘正芳;王建明;王岚;曾晓云;熊玲;罗志秀;伍俊伊5.重组人HER3胞外域Ⅰ区183-227aa的原核表达及大鼠多克隆抗体的制备与鉴定 [J], 朱磊;袁平川;赵志刚;王鑫;王国栋;颜亮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
多克隆抗体的制备ppt课件
多克隆抗体的制备
根据化学基团不同，连接方法主要有以下几类：
带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐 法和碳二亚胺法与载体氨基形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与 载体羧基缩合。
带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与载体连接，需要用化 学方法如琥珀酸酐法、O-羧甲基、羟胺法等方法将之转变为带有羧基 的
半抗原衍生物后才能与载体连接。
带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮化的对氨基苯甲酸法， 生成带有羧基的半抗原衍生物。
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多克隆抗体的制备
多克隆抗体的制备及 抗体活性测定
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多克隆抗体的制备
主要内容
• 多克隆抗体制备的基本原理 • 多克隆抗体制备的操作步骤 • 抗体活性的实验原理、操作流程和结果判断
多克隆抗体的制备
原理
1、克隆(clone)： 是指无性繁殖细胞系，由单一个祖先细胞 分裂繁殖而形成的一簇细胞系。在这个家族的所有成员中， 如无发生突变其基因是完全相同的。
选择性沉淀：
选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境， 如：
核酸去除 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法
多克隆抗体的制备 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白；
超滤法： 利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小
的抗原物质进行滤筛。 电泳
多克隆抗体的制备
精分离
层析法： 凝胶过滤层析 离子交换层析 亲和层析 疏水层析 反相层析
改变抗体类型，使产生抗体由IgM型转变为IgG型；
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·论
著
·
ＮＧＡＬ原核表达及多克隆抗体的制备＊
王小中１，熊火梅１，黄 波１，李 静２，肖 芸１，章海斌１，刘 静１，王彩纹３
（南昌大学：１．第二附属医院检验科 ３３０００６；２．第一附属医院检验科 ３３０００６；３．江西省胸科医院检验科，南昌３３０００６）
摘 要：目的 构建人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（ＮＧＡＬ）的原核表达载体，制备兔抗人ＮＧＡＬ多克隆抗体。方
法 利用ＤＮＡ重组技术构建原核表达载体ｐＥＴ２８ａ－ＮＧＡＬ，诱导表达ＮＧＡＬ融合蛋白，分离该融合蛋白后，注射入免疫家兔制
备多克隆抗体。结果 成功获得ＮＧＡＬ，免疫动物所得抗血清效价为１∶４ ０００，该抗体能够识别原核表达的ＮＧＡＬ。结论 成功克隆ＮＧＡＬ基因并制备了特异性的兔抗人ＮＧＡＬ多克隆抗体。关键词：基因； 遗传； 融合表达； 多克隆抗体； 人中性粒细胞明酶相关脂质运载蛋白
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－４１３０．２０１１．１６．００２文献标识码：Ａ文章编号：１６７３－４１３０（２０１１）１６－１７８９－０３
Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ＮＧＡＬ＊Ｗａｎｇ Ｘｉａｏｚｈｏｎｇ１，Ｘｉｏｎｇ Ｈｕｏｍｅｉ１，Ｈｕａｎｇ Ｂｏ１，Ｌｉ Ｊｉｎｇ２，Ｘｉａｏ Ｙｕｎ１，Ｚｈａｎｇ Ｈａｉｂｉｎ１，Ｌｉｕ Ｊｉｎｇ１，Ｗａｎｇ Ｃａｉｗｅｎ３（１．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｎａｎｃｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，３３０００６，Ｃｈｉｎａ；２．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｎａｎｃｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，３３０００６，Ｃｈｉｎａ；３．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，ｔｈｅ Ｃｈｅｓｔ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｊｉａｎｇｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｎａｎｃｈａｎｇ３３０００６，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ２８ａ－ＮＧＡＬ ａｎｄ ｐｒｅｐａｒｅ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ－
ｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ＮＧＡＬ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ２８ａ－ＮＧＡＬ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＩＰＴＧ．ＴｈｅＮＧＡＬ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙｍａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ａｎｄ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ａｎｄ ｉｎｊｅｃｔｅｄｉｎｔｏ ｒａｂｂｉｔｓ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＮＧＡＬ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｅ ｔｉｔｅｒｓ ｏｆｔｈｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｗｅｒｅ ｕｐ ｔｏ １∶４ ０００．Ｔｈｉｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｕｌｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｔｈｅ ＮＧＡＬ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＮＧＡＬ ｉｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ＮＧＡＬ ｗａｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ｇｅｎｅｔｉｃ； ｆｕｓｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ； ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ
人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａ－ｔｉｎａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ，ＮＧＡＬ）是１９９３年在中性粒细胞的特殊颗粒中首先发现的，定位于染色体９ｑ３４，由７个外显子构成，属单拷贝，蛋白编码总长度５９１ｂｐ，为１９７个氨基酸残基编码，包括成熟肽段１７８个氨基酸残基和前导序列１９个氨基酸残基。ＮＧＡＬ不仅在多种癌组织中表达，而且可通过捕获细菌分泌结合铁的小分子铁螯合物，部分阻断细菌的铁摄取，抑制细菌生长，参与抗微生物的固有免疫应答［１］。ＮＧＡＬ还可作为慢性疾病的早期标记物［２］，是一种急性期反应蛋白。同时越来越多的证据表明血液和尿液中ＮＧＡＬ的测定可成为判断急性肾损伤的预测性生物学标志物［３］。本研究克隆并构建了ｐＥＴ２８ａ－ＮＧＡＬ的多克隆抗体，为进一步研究ＮＧＡＬ分子的功能奠定基础，现报道如下。１ 材料与方法１．１ 材料 限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、各种工具酶均购自于美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司；Ｔａｑ Ｐｌｕｓ ＤＮＡ聚合酶、三磷酸脱氧核糖核苷酸（ｄＮＴＰｓ）及引物等购自于上海捷瑞生物工程有限公司；总ＲＮＡ提取试剂盒、２×Ｔａｑ ＰＣＲ ＭａｒｓｔｅｒＭｉｘ、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒，均购自于天根生化（北京）科技有限公司；异丙基－β－Ｄ硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）、佛氏佐剂、Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白含量检测试剂盒均为Ｓｉｇｍａ公司产品；质粒ｐＥＴ２８ａ原核表达载体购于Ｎｏｖａｇｅｎ公司，感受态细胞Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ ＤＥ３购自于北京全式金生物技术有限公司；蛋白质相对分子质量标准预染蛋白质标记购自于Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司；辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的多克隆抗兔抗体购自于北京中杉金桥有限公
司；家兔（雄性，体质量１．５～２．５ｋｇ
）购自于南昌大学医学院动
物实验中心。１．２
方法
１．２．１ 原核表达载体的构建 根据ＮＧＡＬ基因的序列及ｐＥＴ２８ａ的克隆位点，利用引物设计软件设计ＮＧＡＬ的上下游引物５′－ＴＡＧ ＡＡＡ ＧＣＴ ＴＣＡ ＣＴＣ ＡＧＣ ＣＧＴ ＣＧＡ ＴＡＣ ＡＣ－
３′和５′－ＡＴＡ ＧＧＧ ＡＴＣ ＣＧＡ ＡＡＴ ＣＡＴ ＧＣＣ ＣＣＴ ＡＧＧ ＴＣ－
３′，其中斜体部分为酶切位点前加的保护碱基，划横线部分分
别为ＨｉｎｄⅢ，ＢａｍＨⅠ酶切位点。按Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒使用说明书提取人白血病细胞Ｋ５６２总ＲＮＡ
，并按逆转录酶说明书进
行逆转录，以Ｋ５６２细胞ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ
，扩增条件为：
９４℃５ｍｉｎ预变性；９４℃变性５０ｓ，５９℃退火４５ｓ，７２℃延伸５０ｓ，共３５个循环；最后７２℃延伸７ｍｉｎ。扩增片段与载体
ｐＥＴ２８ａ同时用ＨｉｎｄⅢ
和ＢａｍＨⅠ双酶切，回收后将目的片
段连接入原核表达载体ｐＥＴ２８ａ中，以双酶切、载体测序引物
进行测序。将测序结果和ｐＥＴ２８ａ载体多克隆位点及ＮＧＡＬ
基因的读码框序列进行同源比较，验证重组质粒ｐＥＴ２８ａ－
ＮＧＡＬ克隆。
１．２．２ 重组质粒诱导表达
将测序正确的ＮＧＡＬ重组质粒
转化到Ｅ．ｃｏｌｉ Ｒｏｓｅｔｔａ ＤＥ３中，挑选含有表达质粒Ｒｏｓｅｔｔａ ＤＥ３
单个菌落接至５ｍＬ培养液中，３７℃、２００ｒ／ｍｉｎ振荡过夜。按
·９８７１·国际检验医学杂志２０１１年１０月第３２卷第１６期 Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１１，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１６
＊基金项目：江西省科技厅科技支撑项目（赣科发计字［２００７］１９６号）；江西省教育厅科技项目（赣教技字［２００７］１００号）。１∶１００的量扩增过夜培养的菌液，３７℃振荡培养至Ａ６００＝０．４～０．６时，加入终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ诱导表达。于诱导后３ｈ离心，收集菌体，１５０ｇ／Ｌ的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）电泳检测目的蛋白表达情况。１．２．３ 目的蛋白的凝胶电泳纯化 细菌总蛋白经５０ｇ／Ｌ积层胶，１５０ｇ／Ｌ分离胶进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，倒积层胶时不插梳子，让积层胶的顶端和玻璃板的顶端之间有１ｃｍ的距离（便于大量上样），电泳完毕后，用预冷的０．２５ｍｏｌ／Ｌ的ＫＣｌ溶液染色５～１０ｍｉｎ，参照同样条件下用考马斯亮蓝Ｒ２５０染色的凝胶，仔细辨认融合蛋白条带后，用洁净的手术刀片切下目的蛋白所在的凝胶块，用ＰＢＳ洗３次后，将凝胶块切成０．１～０．３ｍｍ左右的小颗粒，加入适量ＰＢＳ反复冻融３～４次，再经过４℃浸泡过夜，使目的蛋白释放到溶液中，１０ ０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ收集上清液，用１２０ｇ／Ｌ的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ对纯化效果进行鉴定，用Ｂｒａｄｆｏｒｄ测蛋白浓度。１．２．４ 抗ＮＧＡＬ多克隆抗体的制备和纯化 首次免疫，将含目的蛋白的ＰＢＳ液与等体积的弗氏完全佐剂混匀乳化，鉴定完全乳化后多点注射于实验兔背部皮内，每点１００μＬ，每只兔约注入３００μｇ的目的蛋白。分别于首次免疫后的第４、６、８周末进行加强免疫。第１次免疫前采血并分离血清作为空白对照，末次免疫１０ｄ后颈动脉采血分离血清，免疫血清于－７０℃保存。用标准的ＥＬＩＳＡ方法测定抗体效价，抗原为通过凝胶纯化的ＮＧＡＬ蛋白，一抗从１∶１００至１∶２０ ０００开始作倍比稀释，每孔重复３次，二抗为ＨＲＰ标记的山羊抗兔ＩｇＧ（１ ０００倍稀释），显色底物为四甲基联苯胺（ＴＭＢ）。将抗血清于４℃，１２ ０００ｒ／ｍｉｎ，离心２０ｍｉｎ，上清液用０．０１ｍｏｌ ＰＢＳ稀释４倍，加饱和硫酸铵到５０％饱和度、４℃搅拌２ｈ，离心去上清液，０．０１ｍｏｌ ＰＢＳ溶解沉淀并４℃透析，每次４ｈ共４次。再离心，上清液过羊抗兔ＩｇＧ亲和柱，流速１５ｍＬ／ｈ，通过完毕用０．０１ｍｏｌ ＰＢＳ清洗柱子，蛋白检测液检测到无蛋白流出，用０．２ｍｏｌ甘氨酸洗脱液洗脱部分收集液，测蛋白浓度后合并，再次透析后离心，上清液用０．２２μｍ滤膜过滤后分装，置于－２０℃保存。１．２．５ 免疫印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）检测 ＩＰＴＧ诱导前后融合蛋白ｐＥＴ２８ａ－ＮＧＡＬ的总蛋白及凝胶纯化后的融合蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后电转移（３００ｍＡ，１１０ｍｉｎ）至硝酸纤维膜上，磷酸盐吐温缓冲液（ＰＢＳＴ）数次洗膜后，５％脱脂奶粉封闭４ｈ，分别滴加自制的ＮＧＡＬ抗血清１∶５００、１∶１ ０００、１∶１ ５００，１∶２ ０００，４℃过夜，ＰＢＳＴ洗膜３次，每次１０ｍｉｎ，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔ＩｇＧ（１∶５ ０００室温反应１ｈ）后，ＰＢＳＴ洗膜３次，每次１０ｍｉｎ，ＥＣＬ显色。１．２．６ 免疫组织化学检测乳腺癌组织中ＮＧＡＬ的表达 参照ＥｌｉｖｉｓｉｏｎＴＭ Ｐｌｕｓ免疫组化染色步骤，石蜡切片脱蜡及水化后，高压修复２ｍｉｎ，加ＮＧＡＬ一抗（１∶３００稀释），４℃冰箱孵育过夜，滴加聚合物增强剂，室温孵育２０ｍｉｎ，再滴加酶标记二抗，室温孵育３０ｍｉｎ，ＤＡＢ显色。２ 结 果２．１ 原核表达载体的构建 提取人白血病细胞Ｋ５６２的总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增出约６２５ｂｐ的目的片段，与预期结果一致（图１），常规方法连接得到的重组质粒ｐＥＴ２８ａ－ＮＧＡＬ，经ＨｉｎｄⅢ、ＢａｍＨＩ双酶切后，分别在５ ３６９ｂｐ和６２５ｂｐ处有两条清晰的条带，与质粒ｐＥＴ２８ａ和ＮＧＡＬ基因片段的分子量一致（图１），测序结果与ｐＥＴ２８ａ载体多克隆位点和ＮＧＡＬ序列进行同源比较后，证明融合区域的读码框正确，并有正确的方向，表明质粒ｐＥＴ２８ａ－ＮＧＡＬ克隆正确。