项目五 对流免疫电泳试验
对流免疫电泳的原理
对流免疫电泳的原理
流免疫电泳（immunoelectrophoresis）是一种将免疫反应与电泳结合起来的方法，用于检测和定量分析特定抗原或抗体的存在和浓度。
其原理包括以下步骤：
1. 样品制备：将待测样品中的抗原或抗体进行提取和纯化。
2. 准备电泳板：将琼脂糖凝胶块放置在电泳板上，形成一条凹槽。
在凹槽两侧分别插入两个电极。
3. 样品加载：在凹槽中将待测样品和免疫球蛋白（常常是抗体）混合，形成样品准备。
4. 电泳：将电泳板放置在含有适当缓冲液的电泳槽中，通电使得样品准备在凝胶上进行电泳运动。
根据样品带电性质的不同，抗原和抗体会在电场作用下向正或负极运动。
5. 免疫沟槽：当样品准备在电场作用下运动时，抗原和抗体会形成一定的沟槽，其中抗原移动的远一侧为阳极端，抗体移动的远一侧为阴极端。
6. 静置：在电泳完成后，允许抗原和抗体在凝胶中进行免疫反应。
抗原与抗体之间的特异性结合会形成可见的免疫沉淀线。
7. 结果解读：根据免疫沉淀线的形状、长度和强度，可以判断待测样品中特定抗原或抗体的存在和相对浓度。
总的来说，流免疫电泳的原理是在电泳过程中，利用抗原与抗体之间的特异性结合作用使其在电场作用下形成免疫沉淀线，并通过观察和解读沉淀线的特征来进行分析和定量。
对流免疫电泳
对流免疫电泳概述对流免疫电泳（convection-enhanced immunoelectrophoresis，CEIE）是一种以免疫电泳技术为基础的新型免疫分析技术，也称作免疫对流电泳。
该技术利用特定的对流流动作用，使电泳操作更加稳定和方便，并能够大幅提高样品的灵敏度和准确性。
同时，对流免疫电泳也逐渐被应用于多项临床和实验室检测任务中。
原理对流免疫电泳是一种以聚丙烯凝胶为基质，将试验物聚焦于水平位移平衡的技术。
在试验过程中，聚丙烯凝胶中的样品水平运动会被一个垂直方向的空气流覆盖，形成对流效应，从而使凝胶样品的水平位移保持平衡。
该对流效应可以削减因重力差异而导致的样品层析效应，使得电泳分离更为稳定和准确。
此外，对流免疫电泳还采用一些辅助技术以增强其灵敏度。
例如，将电泳板倾斜，或者增加凝胶浓度都可以提高对流免疫电泳的敏感度。
这些辅助技术都能帮助样品快速进入凝胶中，并且更快速地与抗体结合。
应用对流免疫电泳在临床检测中已经得到了广泛的应用。
例如，对于一些癌细胞检测任务中，样品比较粘稠，传统的免疫电泳无法满足敏感度和特异性要求。
然而，通过使用对流免疫电泳技术，可以更加容易地进一步提高检测的精度和准确性。
此外，对流免疫电泳还可以应用于其他生物样品的检测中，如血清、尿液、脑脊液等。
因此，它在计量、生物药物、食品等许多其他领域也得到了广泛的应用。
优点和局限性对流免疫电泳技术有许多明显的优点。
首先，该技术能够提高样品的敏感度和特异性，从而确保测试结果更加准确和可靠。
其次，对流免疫电泳具有快速的操作速度，并且可靠性较高。
此外，这种技术对富含粘稠物的样品也非常适用。
因此，这种技术受到了广泛的青睐。
尽管对流免疫电泳技术存在很多优点，但仍然存在一些局限性。
例如，在一些情况下，可能会出现样品重叠和遮挡的现象，使得检测时出现误差。
此外，这种技术的设备和实验室条件要求较高，操作工作复杂，具有很高的技术门槛。
因此，在操作过程中必须掌握相关的技术。
对流免疫电泳的原理及应用
对流免疫电泳的原理及应用1. 引言对流免疫电泳是一种基于免疫反应原理的电泳技术，能够高效、高灵敏地检测特定的抗原或抗体。
本文将介绍对流免疫电泳的原理和应用。
2. 对流免疫电泳的原理对流免疫电泳基于电泳技术和免疫学原理，通过在电泳过程中，利用特定抗原与抗体间的免疫反应产生的沉淀来检测目标物质的存在与数量。
2.1 免疫反应免疫反应是机体对抗原刺激的免疫系统的反应。
在免疫反应中，抗原与抗体结合形成复合物，这种特异性结合是免疫反应的关键步骤。
2.2 电泳技术电泳技术是一种利用电场作用于带电粒子使其在电场中移动的技术。
在电泳过程中，带电粒子会根据其电荷和大小，在电场中产生移动。
2.3 对流免疫电泳原理对流免疫电泳将免疫反应和电泳技术相结合。
首先，将样品中的目标物与标记有荧光物质的抗体结合，形成复合物。
然后，将复合物置于电泳胶中，施加电场。
目标物与标记有荧光物质的抗体复合物会在电场作用下向电泳胶中移动。
在移动过程中，复合物会与其他成分发生免疫反应，形成可视化的沉淀带。
3. 对流免疫电泳的应用3.1 生物医学研究对流免疫电泳广泛应用于生物医学研究领域。
通过对特定抗原或抗体进行检测，可以研究疾病的发生机制，寻找新的诊断标志物以及监测疗效。
3.2 临床诊断对流免疫电泳在临床诊断中也有重要应用。
例如，可以通过对抗体的沉淀带进行定性和定量分析，检测出特定疾病的存在和严重程度，提供临床诊断的参考依据。
3.3 食品安全检测对流免疫电泳可用于食品安全检测。
例如，可以通过对食品中的特定抗原进行检测，及时发现并防止食品中的有害物质对人体健康造成的威胁。
3.4 环境监测对流免疫电泳还可以用于环境监测。
例如，可以检测水体中的污染物，帮助监测水质污染程度，保护环境和人类健康。
4. 结论对流免疫电泳是一种结合了免疫反应和电泳技术的高效、高灵敏的电泳技术。
它在生物医学研究、临床诊断、食品安全检测和环境监测等领域有着广泛应用。
对流免疫电泳的发展对于提高检测的灵敏度和准确性，推动科学研究和保障公众健康具有重要意义。
对流免疫电泳
对流免疫电泳对流免疫电泳（⼀）原理将抗原和抗体分别加⼊半固体琼脂孔内，在碱性缓冲液中进⾏电泳时，蛋⽩质抗原带负电荷，在电场中由阴极向阳极移动。
抗体等电点较抗原⾼，在此缓冲液中带阴离⼦少，分⼦量⼤，泳动较慢，同时因电渗作⽤（电渗是电场中溶液对于固体的相对移动，琼脂是酸性物质含有较多的硫酸根，在碱性缓冲液中带负电，⽽与它接触的溶液带正电，因此液体向阴极移动，产⽣电渗），反⽽向阴极泳动，这样就使抗原、抗体在电场中相对移动，⽽形成对流。
经过⼀定泳动时间后，在⽐例最适处，形成⾁眼可见的⽩⾊沉淀线。
由于电场作⽤，限制了抗原和抗体多⽅向的⾃由扩散，加速了泳动的速度，缩短了反应时间，提⾼了灵敏度。
（⼆）器材与试剂1．器材（1）电泳仪、电泳槽（2）载玻⽚（3）刻度吸量管（4）打孔器和图形卡（5）⽑细管（6）吸⽿球（7）煮沸消毒⽔浴箱2．试剂（1）1.2％琼脂凝胶（2）⽣理盐⽔（3）抗原（4）抗体（5）pH8.6 0.1M巴⽐妥缓冲液（三）操作步骤：1．取热熔的1.2％琼脂凝胶3.5ml，⽴即浇于载波⽚上，使琼脂平铺于整个玻⽚。
待⾃然冷却凝固。
2．⽤打孔器按图形打孔，再⽤针尖挑去孔内琼脂。
3．将抗原和抗体⽤⽣理盐⽔分别稀释成1:8浓度。
4．⽤⽑细管按顺序将抗原加⼊第1孔中。
将抗体加⼊第2孔中。
每孔加满为⽌，（注意防⽌溢出孔外）。
5．将琼脂凝胶玻⽚放⼈pH8.6 0.1M巴⽐妥缓冲液的电泳槽中，抗原端接负极，抗体端接正极，琼脂两端⽤四层纱布搭桥。
6．电泳，电压为110V，泳动时间30－45分钟。
7．关闭电源。
8．观察结果：从电泳槽内取出琼脂板，对光观察抗原与抗体之间有否⽩⾊沉淀线，出现沉淀线最佳⽐例和最⾼稀释度是多少，并绘出沉淀线的位置、数量、形态。
（四）注意事项1．浇板时，琼脂⾯要铺平。
2．加样时避免样品溢出孔外。
对流免疫电泳+血型鉴定
一.对流免疫电泳（1）实验原理带电的胶体颗粒可在电场中移动，移动的方向与胶体颗粒所带的电荷有关，抗原在PH8.6的缓冲液中带负电荷，故由阴极向阳极移动，抗体球蛋白的等电点为PH6-7，故在PH8.6的缓冲液中带负电荷少，且分子较大，移动缓慢，同时因电渗作用，反向阴极移动，于是形成抗原与抗体相对移动的情况，在二者相遇的最适比例处产生白色沉淀。
此种在双向免疫扩散的基础上加电泳的方法称为对流免疫电泳。
由于抗原、抗体在电场中做定向移动，限制了琼脂双向扩散时抗原、抗体朝各方向自由扩散，因而提高了实验的敏感度，且沉淀线出现较快。
可在1小时内观察结果，故可作快速诊断。
（2）材料1.抗体：甲胎蛋白（AFP）诊断血清2.抗原：甲胎蛋白3.0.05M巴比妥缓冲液（PH8.6）4.1.25﹪缓冲琼脂5.电泳仪一套6.玻片，打孔器，10ML微量加样器（3）操作步骤融化的缓冲液琼脂倒板↓微量加样器加抗原，抗体↓注意勿产生气泡电泳60min↓抗原接阴极，抗体接阳极观察结果（4）实验结果（用实验照片展示）（5）讨论1.血清蛋白在PH8.6条件下带负电荷，所以在电场作用下都向E极移动。
但由于抗体分子在这样的PH条件下只带微弱的负电荷，而且它的分子量又较大（为r球蛋白）。
所以游动慢。
更重要的是抗体分子受电渗作用影响较大，也就是说点渗作用大于它本身的迁移率。
所谓电渗作用是指在电场中溶液对于一个固定固体的相对移动。
琼脂是一种酸性物质，在碱性缓冲液中进行电泳，它带有负电荷，而与琼脂相接触的水溶液就带正电荷，这样的液体便向负极移动。
抗体分子就是随着带正电荷的液体向负极移动的。
而一般的蛋白质（如血清抗原）也受电渗作用的影响，使泳动速度减慢，但它的电泳迁移率远远大于电渗作用。
这样抗原体就达到了定向对流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的沉淀线。
2.影响结果的因素（1）抗原抗体的比例：抗原抗体比例适应时容易出现沉淀带，反之不易发生。
当抗体浓度恒定时，被检血清含甲胎蛋白浓度高时，作10倍、20倍或更高倍数稀释可以提高阳性率。
免疫电泳与对流免疫电泳实验设计缺陷
免疫电泳与对流免疫电泳实验设计缺陷免疫电泳和对流免疫电泳是常用的生物学实验方法，用于分离和鉴定蛋白质。
然而，这些实验存在一些设计缺陷，可能影响实验结果和结论的准确性。
免疫电泳是一种基于电泳原理的蛋白质分离方法，通过在凝胶中施加电场，将混合蛋白质分离成不同的带状条纹。
然后，通过与特定抗体结合，识别和鉴定目标蛋白质。
然而，免疫电泳存在一些设计缺陷，可能影响实验结果。
例如：1. 样品预处理不当样品的预处理是影响免疫电泳结果的一个重要因素。
如果样品预处理不充分或者处理过程中出现了问题，会导致蛋白质损失或者降解，从而影响实验结果的准确性。
2. 抗体选择不当抗体选择是影响免疫电泳结果的另一个重要因素。
如果使用的抗体不具有足够的特异性，可能会导致非特异性的反应，从而干扰实验结果的解释和鉴定。
3. 实验操作不规范中，如果电场强度过大或者施加时间不恰当，可能会导致蛋白质移动速度不一致，从而影响结果的解释。
对流免疫电泳是一种基于对流原理的蛋白质分离方法，它利用凝胶中的特定通道，通过对流的方式将蛋白质分离成不同的带状条纹。
然后，通过与特定抗体结合，识别和鉴定目标蛋白质。
然而，对流免疫电泳也存在一些设计缺陷，可能影响实验结果。
例如：1. 通道设计不当通道设计是影响对流免疫电泳结果的一个重要因素。
如果通道设计不合理，可能会导致蛋白质分离不完全或者分离效率不高，从而影响实验结果的准确性。
2. 抗体选择不当与免疫电泳类似，抗体选择也是影响对流免疫电泳结果的另一个重要因素。
如果使用的抗体不具有足够的特异性，可能会导致非特异性的反应，从而干扰实验结果的解释和鉴定。
3. 实验操作不规范过程中，如果通道长度不恰当或者液流速度过快，可能会导致蛋白质移动速度不一致，从而影响结果的解释。
综上所述，免疫电泳和对流免疫电泳存在一些设计缺陷，可能影响实验结果和结论的准确性。
因此，在进行这些实验时，需要严格控制实验条件和操作规范，以确保实验结果的可靠性。
对流免疫电泳的原理
对流免疫电泳的原理对流免疫电泳的原理1. 引言对流免疫电泳（Capillary Electrophoresis-Immunosorbent Assay，CE-ISA）是一种结合了电泳技术和免疫分析原理的高灵敏度生物分析方法。
其原理基于离子迁移和免疫反应的相互作用，可以快速、准确地检测和定量分析目标分子。
2. 原理介绍对流免疫电泳主要由免疫反应和电泳分离两个步骤组成。
在电泳毛细管内涂覆一个特定抗原或抗体（通常是抗体）的固相材料，以形成免疫反应界面。
当样品中的目标分子与固相材料上的特异抗体结合时，会形成抗原-抗体复合物。
通过施加电场，驱动这些复合物在电泳毛细管内进行迁移分离。
3. 免疫反应对于对流免疫电泳，关键的一步是选择和固定特异性抗体或抗原在固相材料上，以确保特异性的免疫反应。
这样可以确保目标分子与固相材料上的抗体结合，从而形成抗原-抗体复合物。
4. 电泳分离电泳分离是对流免疫电泳的核心步骤。
通过施加电场，使复合物在电泳毛细管内迁移。
复合物的迁移速度受到多种因素的影响，如电场强度、毛细管尺寸、载流液和样品pH等。
这些因素的调节可以实现目标分子的高效分离和定量测量。
5. 优势与应用对流免疫电泳具有许多优势。
该方法具有高灵敏度和高选择性，可以检测到极低浓度的分子。
对流免疫电泳快速、自动化，适用于大规模样品分析。
该方法可以分析多种复杂样品，如血清、尿液和细胞提取物等，并广泛应用于生物医学、环境监测和食品安全等领域。
6. 个人观点和理解对流免疫电泳是一种非常有潜力的生物分析方法。
其结合了电泳技术和免疫分析原理的优势，可以在较短的时间内准确地检测和定量分析目标分子。
这种方法在生物医学、环境监测和食品安全等领域具有广泛的应用前景。
然而，对流免疫电泳方法仍需进一步的改进和优化，以提高其灵敏度和稳定性，并解决样品预处理和复杂样品矩阵的干扰等问题。
总结对流免疫电泳是一种结合了电泳技术和免疫分析原理的高灵敏度生物分析方法。
对流免疫电泳
实验方法
制板（3－4ml琼脂）
打孔
加样
电泳（30min左右）
抗 抗 体 原
观察
实验结果
断电后，将玻板置于灯光下，衬以黑色背景观察。阳性者
则在抗原抗体孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。如
沉淀线不清晰，可把琼脂板放在湿盒中37℃数小时或置电 泳槽过夜再观察(为什么？)。
实验结果
① Ag为阳性 ② Ag为弱阳性 ③ Ag为强阳性 ④ Ag为强阳性
环状沉淀反应
絮状沉淀反应
实验原理
琼脂扩散实验:
可溶性抗原和抗体在琼脂中扩散，相遇，在适当比例下形成沉淀
线或沉淀环。
分类: 单向琼脂扩散实验: 仅抗原或抗体扩散 双向琼脂扩散实验: 抗原和抗体同时扩散
实验原理
单向琼脂扩散实验:
即将一定量的抗体混合于琼脂中，待琼脂凝固后打孔并加入 抗原，孔中的抗原向四周扩散，在抗原与抗体的比例合适处 呈现白色的沉淀环。沉淀环的大小与抗原的浓度成正比，故 该试验是定量试验。
实验材料
1. 抗原&抗体 2. 微量可调加样器、加样头、玻片、记号笔 3. 打孔器、针头、打孔样纸（均放平皿内） 4. 电泳液、电泳槽、电泳仪
5. 1.2℅琼脂糖(加热溶化）、5ml刻度吸管、吸耳球
电泳液 0.05M（pH8.6 ）巴比妥缓冲液：巴比妥1.84克，巴比妥钠 10.3克，加蒸馏水1000毫升。 1.2℅琼脂糖：以0.025M的巴比妥缓冲液配制，12g琼脂糖加入1L缓 冲液中，加热融化。
实验结果
注意事项：
1. 琼脂板一定平整、光滑 (无气泡) 。 2. 打孔的时候，保证加Ag和Ab的孔在同一水平线上。 3. 孔中液体(Ag,Ab)不宜过多。 4. 使用加样枪时，最好在其量程内使用；使用完毕后调
对流免疫电泳原理
对流免疫电泳原理对流免疫电泳是一种用于分离和检测蛋白质的方法，它结合了电泳和免疫学的原理。
在对流免疫电泳中，蛋白质首先在凝胶中进行电泳分离，然后通过免疫学技术进行检测。
这种方法可以用于研究蛋白质的结构、功能和相互作用，对于生物医学研究具有重要意义。
对流免疫电泳的原理基于蛋白质的电泳迁移特性和免疫学检测技术。
首先，蛋白质在电场作用下在凝胶中进行迁移，根据其分子量和电荷的不同，蛋白质会在凝胶中形成不同的带状。
然后，通过将凝胶与抗体反应，可以检测特定蛋白质的存在和浓度。
这种方法结合了电泳的分离能力和免疫学的高灵敏度，可以实现对蛋白质的高效分离和检测。
对流免疫电泳的步骤包括样品制备、电泳分离和免疫检测。
首先，样品需要经过处理，如蛋白质的提取和纯化，以确保样品的纯度和稳定性。
然后，样品被加载到凝胶中进行电泳分离，根据蛋白质的特性，可以选择不同类型的凝胶和电泳条件。
分离完成后，凝胶需要进行固定和染色处理，以便观察蛋白质的分离带。
最后，通过将凝胶与特异性抗体反应，可以检测特定蛋白质的存在和浓度。
对流免疫电泳具有许多优点。
首先，它可以实现对复杂混合物中蛋白质的高效分离和检测，对于研究蛋白质组学具有重要意义。
其次，对流免疫电泳具有高灵敏度和特异性，可以检测低浓度的蛋白质，并且可以选择特定的抗体进行检测。
此外，对流免疫电泳的操作简单，不需要昂贵的仪器设备，适用于实验室的常规操作。
总之，对流免疫电泳是一种重要的蛋白质分离和检测方法，它结合了电泳和免疫学的原理，可以实现对蛋白质的高效分离和检测。
它在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用前景，对于揭示蛋白质的结构、功能和相互作用具有重要意义。
希望本文对对流免疫电泳的原理有所帮助，谢谢阅读！。
沉淀反应——对流免疫电泳
沉淀反应——对流免疫电泳沉淀反应是一种常用的实验技术，用于分离和富集特定的分子或蛋白质。
通过反应产生的沉淀可以进一步用于分析、鉴定等目的。
对流免疫电泳是一种结合了沉淀反应和电泳技术的新型方法，可以用于快速、高效地检测特定抗原或抗体在复杂混合物中的存在与浓度。
在下面的文中，我将介绍一些与对流免疫电泳相关的内容。
1. 对流免疫电泳的原理对流免疫电泳是一种将免疫学反应与电泳技术结合的方法。
该方法基于抗原和抗体之间的特异性识别，通过在电泳过程中形成免疫复合物，使目标物质在电场作用下沉淀成固定位置的条带。
该原理可以用以下步骤描述：样品中的抗原与标记化的抗体结合，形成抗原-抗体复合物；电泳平台上的固相区域覆盖着特定抗原或抗体的亲和剂，使复合物与固相结合；施加电场使复合物向电极移动，过程中，复合物和非特异性物质会发生竞争，仅有特异性物质能够形成沉淀条带。
2. 对流免疫电泳的优势对流免疫电泳具有许多优势，使其在生物医学研究领域得到广泛应用。
首先，对流免疫电泳是一种高度特异性的检测方法，能够对目标物质进行高效的富集和分离，同时避免非特异性的干扰。
其次，对流免疫电泳具有较高的灵敏度和准确性，能够在样品中检测到非常低浓度的抗原或抗体。
此外，对流免疫电泳是一种快速的分析方法，通过合理的实验设计和条件优化，可以在短时间内完成样品的检测和分析。
最后，对流免疫电泳不需要昂贵的设备和专门的实验技术，具备较低的成本和操作的简便性，使其具有良好的实用性和广泛的应用前景。
3. 对流免疫电泳的应用领域由于对流免疫电泳的优势，它在许多领域都得到了广泛的应用。
首先，对流免疫电泳在生物医学研究中常被用于分析和检测血清中的特定抗原或抗体，帮助诊断和监测各种疾病。
其次，对流免疫电泳在药物研发和生物制药领域也得到了应用，用于药物代谢产物、细胞毒性物质和蛋白质的分析。
此外，对流免疫电泳还可用于农业生物技术、食品安全和环境监测等方面的研究，用以检测农药残留、食品中的有害物质和环境中的污染物。
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项目五 对流免疫电泳试验
项目五 对流免疫电泳试验
(Counter immunoelectrophoresis test)
【实验原理】
在适宜缓冲液与电场条件下,由于琼脂凝胶中的抗原与相应抗体在电泳与电渗作用下能
相对移动,所以二者会在加样的两孔之间相遇,并在它们浓度比例合适之处形成白色沉淀线。
据此临床常用该方法检测抗原,以诊断某些疾病。
【试剂与器材】
1.AFP阳性血清、待检血清、抗AFP诊断血清。
2.pH8、6 0、05 mol/L巴比妥缓冲液。
巴比妥钠 10、3 g
巴比妥 1、84 g
先将巴比妥置于三角烧瓶中,加入200ml蒸馏水,加热溶解后再加入巴比妥钠, 最后加蒸
馏水至1000ml。
3.琼脂凝胶 按需要量称取琼脂粉,加入pH8、6 0、05mol/L巴比妥缓冲液,使琼脂浓度
为12g/L,沸水浴中溶解至澄清。
4.电泳仪、电泳槽、万用电表。
5.载玻片、绘图笔尖、吸管、滴管等。
【步骤与方法】
1.制备琼脂凝胶板 取溶化的琼脂3~4ml,浇于载玻片上,冷却后打孔。
2.打孔 用绘图笔尖按图1-6打孔,孔径约3mm,孔距4~5mm,挑去孔中凝胶。
3.加样 用滴管按图1-6分别加入抗血清、AFP阳性血清、待检血清,以加满孔为宜,注
意不要溢出。
4.电泳 将加好样的琼脂凝胶板置于电泳槽中,抗原孔侧置阴极端,抗体孔侧置阳极端,两
端分别以2~3层滤纸或纱布搭桥,使凝胶与槽中缓冲液相接。按通电源,将电压控制在
4~6V/cm长,或电流3~4mA/cm宽,电泳30~60min。
【结果判定】
电泳完毕后关闭电源,待15~30min后取出琼脂凝胶板观察结果,或照相、染色后保存。
阳性对照孔与抗血清孔之间必须出现沉淀线,否则试验须重做。待检血清孔与抗血清孔
之间出现白色沉淀线为阳性,不出现者为阴性。
Ag
AgAbAb
+
_
1
234
1 阳性对照孔
2~4 待检血清孔
图1-6 对流免疫电泳
【注意事项】
1.当标本为脂血症、陈旧血标本或由于α2-巨球蛋白可引起假阳性,它靠近阳极呈弧状。
为排除这种假阳性可用参比电泳鉴别,即阳性对照孔与待检孔间距为0、2cm,在两孔中间相距
0、4cm处打抗血清孔,加样后电泳,两沉淀线吻合为阳性,相交为阴性,其它试验条件与以上试
验相同。
2.电泳缓冲液的pH值、离子强度、电压与电泳时间对检测结果均有影响,应注意控制。
项目五 对流免疫电泳试验
3.电泳时间随孔间距的增大需适当延长。当两孔距离为1cm时,电泳时间为1、5～2h;
孔间距为0、6cm时,电泳时间为1h。
4.抗原与抗体浓度比例应适当,可通过稀释抗原适当调整,以免出现假阴性。
【方法评价】
1.简便、快速,敏感度比双相免疫扩散法高8~16倍。
2.必须使用高特异性、高亲合力的诊断抗体,否则结果难以解释。
3.必须选用有高电渗作用的琼脂作支撑介质。
【临床意义】
对流免疫电泳在临床常用于定性检测某些抗原,以对某些疾病或传染病作快速诊断。也
可用于抗原的半定量测定,或根据沉淀线位置、形状作抗原与抗体相对浓度的分析。由于该
方法分辨率差,当有多种抗原抗体反应系统存在时,形成的沉淀线常重叠,而难以分辨,所以不
用该方法作某种抗原或抗体组分的免疫化学分析。
【思考题】
1.对流免疫电泳试验原理如何?为何选用高电渗作用琼脂作为凝胶介质？
2.为何对流免疫电泳比双相免疫扩散试验敏感性高？
项目六 火箭免疫电泳试验
(Rocket immunoelectrophoresis test)
【实验原理】
抗原在含一定浓度抗体的琼脂板一端,在电场作用下,向另一端泳动时抗原抗体复合物形
成的沉淀呈圆锥形,状似火箭而得名。它实质上就是在电场作用下的凝胶内单相免疫沉淀试
验。当抗体含量不变时,沉淀峰的高度与抗原浓度成正比。因此用已知不同浓度标准抗原制
成标准曲线,即可求出标本中抗原含量,所以又称单相定量免疫电泳。
【试剂与器材】
1.pH8、6 0、05mol/L巴比妥缓冲液。
2.30g/L缓冲琼脂 称取3、0g琼脂粉置250ml三角烧瓶中,加蒸馏水50ml,沸水浴中溶
解,然后加入上述巴比妥缓冲液50ml混匀后,置4℃冰箱保存备用。
3.AFP诊断血清。
4.待检样品(脐带血清或肝癌病人AFP阳性血清)。
5.参考血清(已知AFP标准抗原)。
6.电泳仪、电泳槽、37~65℃水浴箱、万用电表。
7.载玻片、打孔器、微量加样器等。
【步骤与方法】
1.取30g/L缓冲琼脂,置水浴煮沸溶化,放52℃水浴平衡。
2.释释血清 根据抗体的效价,用0、025mol/L巴比妥缓冲液将抗体作适当稀释(一般作
1:20~1:50稀释),置52℃水浴保温。
3.浇板 将稀释抗血清与30g/L缓冲琼脂等量混合,注意保温,防止产生气泡(在水浴中操
作,动作要轻缓),用吸管吸取混匀琼脂迅速滴加于载玻片上,每片琼脂量3、5ml。 载玻片要放
在水平台上,使浇注的琼脂板厚度均匀。
4.打孔 取冷凝后的琼脂板,在距一端1、5cm处用打孔器等距离打3个孔,挑去孔内琼脂
(图1-7)。操作中防止孔四周出现裂纹或破损,否则将影响沉淀峰形状,结果不准确。
项目五 对流免疫电泳试验
图1-7 火箭免疫电泳图
5.加样 用微量注射器分别于孔内准确地加入待检样品以及不同浓度的标准抗原各
10l。
6.电泳 电泳槽内盛0、05mol/L巴比妥缓冲液。将加好样品的琼脂板置于其上,抗原孔
侧放阴极端,用缓冲液浸湿的双层滤纸两端搭桥进行电泳。开始电压为2~5V/cm,维持
15~20min,然后增加到25~30V/cm(需冷却装置),电泳1~3h至完全成峰;或5~10V/cm过夜。
7.电泳结束后取下琼脂板,如沉淀峰清晰即可直接判读测量结果,否则可将琼脂板浸泡于
10g/L鞣酸生理盐水中会使沉淀峰更明显。如欲永久保留标本,可将琼脂板进行干燥、染色处
理(见双相免疫扩散试验)。
【结果判定】
1.沉淀峰呈尖角火箭形则表示无游离抗原,泳动已到终点;如呈钝圆形或没有峰顶,前端云
雾状则表示还未到终点。
2.从抗原孔中心至火箭顶为沉淀峰高度。以已知标准抗原含量作横坐标,沉淀峰的高度作
纵坐标,绘制成标准曲线。根据待检样品沉淀峰的高度查标准曲线即可计算出待检样品中
AFP的含量。
【注意事项】
1.应选用低电渗作用的琼脂糖作凝胶介质,可避免电渗作用所引起的某些标本的火箭峰
倒退。
2.抗原过浓会使沉淀峰无峰顶,瞧不到终点;抗体过浓则沉淀峰太低,降低试验敏感度,甚
至沉淀峰无法测量;抗体与抗原浓度应适宜。
3.为防样品向四周扩散,加入样品后应尽快电泳,或在电压为2~3V/cm通过凝胶介质的情
况下加入样品,使结果判定更为准确。标本与标准抗原必须在相同的电泳条件下进行电泳。
4.高压电泳所需时间短,但需冷却装置。低压电泳方便,峰形清晰,但需时较长。
5.其它注意事项请参考单相免疫扩散试验。
【方法评价】
火箭免疫电泳就是在单相免疫扩散基础上发展起来的技术,操作简单,能定量,重复性较
好。灵敏度同单相扩散,可测得g/ml以上的抗原含量,需时短就是其优点。
为提高灵敏度,可用少量125I标记的标准抗原与被检抗原共同电泳,在含抗体的琼脂中形
成不可见的火箭峰,经洗涤干燥后,用X线胶片显影,可出现同位素显影的火箭峰,这就就是目
前采用较多的放射自显影技术。根据放射自显影示踪的峰高即可计算出待检抗原的含量,可
测出ng/ml抗原浓度,提高敏感度20~50倍,扩大了应用范围。可用于多种抗原的定量测定,如
AFP、HBsAg等。
【临床意义】
常用于血浆蛋白质、AFP、HBsAg及尿与脑脊液中Ig与补体成分的定量测定。
【思考题】
1.火箭免疫电泳试验原理与单相免疫扩散试验有何不同？
2.为使结果准确,加样时应特别注意什么问题？
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