正常和肿瘤组织细胞的培养
原代细胞分离与培养，你都掌握了吗？
原代细胞分离与培养，你都掌握了吗？导语对于⼤部分科研⼈员来说，研究中⼀般⽤到均是现成的细胞系/株，我们只需要：进⾏细胞传代和保种。
然⽽，这些细胞系常常由于体外长期培养，⽽丢失原有⽣物学特性，对药物处理的反应差距越来越⼤。
因此，原代细胞的地位⽇渐凸显，Paper中若有了原代细胞的数据都会添⾊不少。
然⽽，就⼩编亲⽣经历，原代细胞分离着实是个技术活，今天我们就结合⾃⾝经验，为⼤家介绍：肿瘤组织和正常组织的原代细胞的分离与培养⽅法。
第⼀部分：原代细胞的基本知识1. 什么是原代细胞培养?原代细胞（Primary cells）：是指直接从机体取出的组织或细胞获得单个细胞并在体外进⾏培养的细胞。
这⾥的组织主要指：组织器官、外周⾎及胚胎等。
原代细胞培养：由于原代细胞⽣长缓慢，繁殖⼀定的代数停⽌⽣长（⼀般10代以内）。
所以⼀般认为：培养的原代的第1和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。
2. 原代细胞与细胞系（cell lines）的区别原代细胞和细胞系的⽐较：Primary cells Cell lines增殖能⼒较弱强繁殖代数⼀般只能传10代以内⽆限增殖，50代左右遗传物质完整性遗传物质未改变遗传物质发⽣改变⽣物特性最接近临床样本偏离临床样本培养容易程度⽐较复杂简单，易操作原代细胞和细胞系的⽐较3. 原代细胞的应⽤由于原代细胞⽣物学特性未发⽣很⼤改变，最接近和反映体内⽣长特性，因此是：(1) 研究⽣物体细胞的⽣长、代谢、繁殖提供有⼒的⼯具；(2)更好实现精准医疗的肿瘤诊治模式，实现个体化精准⽤药的⽬的。
第⼆部分：原代细胞分离和培养技术原代培养的原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常⽤胰蛋⽩酶/胶原酶)、螯合剂(常⽤EDTA)或机械⽅法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以⽣存、⽣长和繁殖，这⼀过程称原代培养。
主要包括取材——分离——培养等3部分；在原代细胞应⽤较多的包括：组织器官（如实体瘤、⽪肤等）、悬浮细胞的取材等。
细胞培养的一般过程
细胞培养的一般过程一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。
准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。
二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。
如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。
机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。
理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。
取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。
取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。
取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。
由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。
三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。
如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。
如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。
细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。
一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。
过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。
细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。
肿瘤细胞和正常细胞的遗传学和表观遗传学差异
肿瘤细胞和正常细胞的遗传学和表观遗传学差异从发育到衰老，遗传物质决定了细胞生命的每一个步骤。
但当肿瘤细胞进入人体时，它们的遗传和表观遗传特征受到了极大的改变。
肿瘤细胞的遗传学和表观遗传学差异具有广泛的影响，这不仅对癌症的治疗和预防具有重要意义，也拓宽了我们对细胞生命过程中的基因表达和调控的了解。
肿瘤细胞与正常细胞的遗传学差异肿瘤细胞与正常细胞之间的遗传学差异主要体现在基因组水平的变化。
大多数肿瘤细胞的基因组发生了明显的异常，包括染色体数目的变化、突变和重排。
这些异常会导致基因的表达水平发生变化，从而影响了肿瘤细胞的生长、增殖、凋亡和转移等生物学特性。
染色体异常是影响肿瘤细胞基因组稳定性的重要因素之一。
对于几乎所有癌症来说，都存在有染色体数目的变化，包括染色体的配对不完全、染色体丢失、染色体重复和染色体结构异常等。
这些异常不仅导致了某些基因的失活或激活、可能会跨越肿瘤细胞和正常细胞之间的边界，从而产生差异表达重构，同时还可能激活癌症产生行为的特征。
例如，肺癌中的染色体 3p 、5q 和 9p 区域的损失与九个恶性野生型的突变相关，提示这些染色体的变异导致了这些部位基因表达的失调。
突变可以对基因组的功能产生更加细微和复杂的影响。
抗癌基因和肿瘤抑制基因的突变可能影响到靶基因信号途径的正常通讯，直接导致细胞的转化和肿瘤的产生。
常见的突变机制有点突变、缺失、插入、删除、移位等。
例如，在乳腺癌中，BRCA1 基因突变可以导致 DNA 损伤修复的问题，从而增加癌症风险。
肿瘤细胞与正常细胞的表观遗传学差异表观遗传学是指影响基因表达和调控的非编码 DNA 上的化学修饰。
这些化学修饰可以是 DNA 甲基化、组蛋白修饰、非编码 RNA 介导的调节等，它们共同构建了广泛的表观调控网络。
实际上，在同一基因组水平分析中，癌细胞和正常细胞经常显示出明显的表观遗传学差异。
DNA 甲基化异常是影响癌症发展的主要表观遗传学改变之一。
细胞培养工艺介绍
细胞培养需要特定的条件以维持细胞的生存和生长。
详细描述
这些条件包括但不限于营养物质（如葡萄糖、氨基酸、 维生素等）、气体环境（如氧气和二氧化碳）、温度和 pH值等。这些条件的微小变化都可能影响细胞的生长 和分化。
细胞的质量控制
总结词
为了保证细胞的健康和实验结果的可靠性，需要对细胞的质量进行控制。
原代细胞的培养方法
总结词
原代细胞的培养需要采用特定的方法以确保细胞的生 存和生长。
详细描述
通常采用贴壁培养或悬浮培养。贴壁培养是将细胞接 种到固定的培养表面，如玻璃或塑料培养皿中。悬浮 培养则是将细胞接种到可以自由悬浮的培养介质中。 两种方法各有优缺点，需要根据具体的细胞类型和培 养需求选择。
细胞培养的条件
通过计算种群倍增时间，可以了解细胞增殖的速度，评估细胞的生长状态和适应能力。
细胞克隆培养技术
有限克隆代数
在克隆培养中，细胞分裂的代数是有限的，这有助于保持细胞的未分化状态。
无性繁殖
克隆培养技术可以实现无性繁殖，保证细胞的遗传背景的一致性。
细胞大规模培养技术
生物反应器系统
生物反应器系统是用于大规模培养细胞 的一种装置，可以提供适宜的细胞生长 环境，实现细胞的大规模扩增。
20世纪70年代，随着基因工程 、细胞工程等生物技术的迅速发 展，细胞培养技术得到了广泛应
用和深入研究。
细胞培养的应用领域
生物医药领域
细胞治疗领域
细胞培养是生物医药领域的重要支撑技术 之一，可用于药物筛选、药效评价、疾病 模型的建立等。
通过细胞培养技术，可以实现自体或异体 细胞的移植治疗，用于治疗肿瘤、神经性 疾病、心血管疾病等。
疫苗生产领域
其他领域
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告5篇
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告5篇篇1一、引言肿瘤细胞增殖实验是研究肿瘤发生、发展及其相关机制的重要手段。
随着科技的进步，体外检测肿瘤细胞增殖的方法逐渐成为研究热点。
本文将对体外检测肿瘤细胞增殖的实验方法、应用及优缺点进行综述，为相关研究者提供参考。
二、实验方法1. 细胞培养细胞培养是体外检测肿瘤细胞增殖的基础。
研究者需根据实验需求选择合适的细胞系，并掌握细胞培养的基本技术，如细胞的复苏、传代、冻存等。
2. 实验试剂与仪器在进行肿瘤细胞增殖实验时，需要使用一系列的试剂和仪器，如细胞计数试剂、酶标仪、显微镜等。
这些试剂和仪器的选择对实验结果的准确性至关重要。
三、实验技术1. MTT法MTT法是一种常用的检测细胞增殖的方法，其原理是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原MTT，生成蓝色结晶物并沉积在细胞中，从而反映细胞的增殖情况。
该方法具有操作简便、快速、准确等优点，在肿瘤细胞增殖实验中得到了广泛应用。
2. BrdU法BrdU法是通过检测细胞内BrdU的掺入量来反映细胞的增殖活性。
该方法需要预先在培养基中加入BrdU，然后通过特异性抗体检测BrdU的掺入量。
BrdU法具有较高的灵敏度和特异性，能够更准确地反映细胞的增殖情况。
3. 流式细胞术流式细胞术是一种能够同时检测单个细胞多个参数的技术，可以用于分析细胞的周期、凋亡、增殖等情况。
在肿瘤细胞增殖实验中，流式细胞术可以用于检测细胞的DNA含量、BrdU掺入量等指标，从而更全面地了解细胞的增殖情况。
四、应用及优缺点1. 药物筛选与评价体外检测肿瘤细胞增殖实验可以用于药物的筛选与评价。
通过检测药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用，可以评估药物的抗肿瘤活性，为药物的进一步研究和开发提供依据。
2. 肿瘤病理学研究体外检测肿瘤细胞增殖实验还可以用于肿瘤病理学研究。
通过分析肿瘤细胞的增殖特性，可以了解肿瘤的发生、发展及其相关机制，为肿瘤的诊断和治疗提供理论依据。
3. 个体化治疗与预后判断体外检测肿瘤细胞增殖实验在个体化治疗和预后判断中也具有重要价值。
肿瘤细胞成球实验原理
肿瘤细胞成球实验原理
肿瘤细胞成球实验是一种常用的体外细胞培养技术，用于模拟体内肿瘤的生长和发展过程。
该实验可以通过培养肿瘤细胞成三维球体，更真实地反映肿瘤的特性和生物学行为。
实验开始前，我们需要从患者体内获取肿瘤组织，并将其分离出单个的肿瘤细胞。
这些细胞通常具有一定的肿瘤干细胞特性，包括自我更新和多向分化的能力。
我们将肿瘤细胞悬浮在含有适当培养基和营养物质的培养皿中。
培养基中的成分和浓度需要根据具体的实验目的进行调整，以提供细胞生长所需的营养和环境。
然后，我们将培养皿放置在恒温培养箱中，维持适当的温度和湿度，以模拟人体内的生理条件。
在培养过程中，细胞会自发地聚集在一起，形成三维的球体结构，称为肿瘤球。
肿瘤球的形成是由肿瘤细胞间的相互作用和通讯所驱动的。
在这个过程中，细胞之间会发生细胞黏附、细胞间信号传导和基质重塑等重要的细胞生物学事件。
通过观察和研究肿瘤球的形态、大小和结构，我们可以了解肿瘤细胞的增殖能力、侵袭性和抗药性等特性。
此外，肿瘤球还可以用于测试新药的疗效和评估抗肿瘤治疗策略的有效性。
肿瘤细胞成球实验的优势在于它更好地模拟了体内的肿瘤生长环境，相比于传统的二维细胞培养，更能保留肿瘤细胞的原始特性和生物学行为。
这使得肿瘤球实验成为研究肿瘤生物学和开发抗癌药物的重要工具。
肿瘤细胞成球实验通过培养肿瘤细胞形成三维球体结构，模拟体内肿瘤的生长和发展过程。
这种实验方法可以更真实地反映肿瘤的特性和生物学行为，为肿瘤研究和治疗提供重要的参考依据。
肿瘤细胞系的建立原理
肿瘤细胞系的建立原理肿瘤细胞系的建立是为了研究肿瘤生物学和治疗方法的开发，通过从患者的原发肿瘤或转移瘤中分离和培养细胞，形成可持续增殖的细胞系。
肿瘤细胞系的建立在肿瘤研究中扮演着重要的角色，它们可以用来研究肿瘤的生长机制、细胞信号转导通路、基因表达调控以及药物敏感性等。
肿瘤细胞系的建立主要分为以下几个步骤：1. 原发肿瘤样本的获取：原发肿瘤是指肿瘤起源的部位，通过手术、活检等方式获得肿瘤组织样本。
获取的样本要在临床医生的指导下进行，并尽量保持组织的完整性和洁净度。
2. 细胞分离和培养：将原发肿瘤组织进行体外分离，将组织切碎或通过酶消化等方法将肿瘤细胞从正常细胞中分离出来。
然后将分离的细胞转移到培养皿中，加入适当的培养基和生长因子，提供细胞生长所需的养分和环境条件。
3. 细胞增殖和扩增：在培养皿中，肿瘤细胞开始进行增殖。
通过适当的细胞密度、培养基成分的调整，可以促进肿瘤细胞的增殖和扩增。
为了获得可持续生长的肿瘤细胞系，需要反复传代和定期培养。
4. 细胞株的鉴定：通过形态学观察和免疫组化染色等方式，对细胞株进行鉴定，确认细胞的来源和纯度。
同时，用多种方法对细胞进行病毒感染和生物学特性的测试，以确保肿瘤细胞的稳定性和代表性。
5. 细胞的冻存和保存：为了长期保存肿瘤细胞系，通常将肿瘤细胞进行冻存。
冻存可以减缓细胞的生长活动，使其长期保存，并在需要时重新启动。
肿瘤细胞系的建立原理主要是通过分离和培养患者原发肿瘤组织中的肿瘤细胞，使其在体外条件下继续增殖，从而形成可持续生长的细胞株。
在细胞培养的过程中，肿瘤细胞可能会发生一定的改变，例如基因变异、表达水平的改变等，因此需要经常进行鉴定和验证。
肿瘤细胞系的建立对于肿瘤研究和治疗具有重要的意义。
一方面，肿瘤细胞系可以用来研究肿瘤生长的分子机制，通过研究其增殖、迁移、侵袭和转移等特性，可以揭示肿瘤的形成和发展机制。
另一方面，肿瘤细胞系也可以用来评估药物的敏感性和抗药性，帮助选择和优化治疗方案。
细胞培养必备知识
注意：
1.打开培养箱时尽量不要说话； 2.步骤9中培养瓶放入培养箱时，应把盖子拧开少许。
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传代
1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子； 2.观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在 倒置显微镜下观察细胞生长状况。 3.放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶 口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。 4.取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口； 5.拿出PBS瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞 子取出，烧瓶口（至少10圈）。
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三、在肿瘤学中的应用
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肿瘤细胞生物特性学研究
–比较肿瘤细胞与正常细胞在体外培养条件下生 长行为的差异，研究肿瘤细胞生物学特性的改 变，对于建立诊断标准有益。 肿瘤细胞体外生长形态学研究 肿瘤细胞生长特性 细胞接触抑制实验
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肿瘤发病机制研究
–肿瘤产生诱发因素的研究 –肿瘤细胞侵润机制和过程的研究 –肿瘤与正常细胞 共同培养法
研究肿瘤药物筛选
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异种移植研究
裸鼠发现与应用 建立了动物移植瘤模型
抗肿瘤药物筛选
研究肿瘤细胞调亡以及肿瘤细胞体外分化 又成为新热点
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生物治疗
–活细胞---体细胞---体内
–活化细胞（LAK）---患者
–组织---悬液---培养---回输机体
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细胞培养：
一、原代培养
二、传代培养
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一
原代培养
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6. 烧瓶口，镊子和盖子；盖上盖子， 在倒置显微镜下观察。 7. 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内. 注意： 步骤2中，蒸馏水不要没过冻存管口 所有步骤结束过24小时后一定要换液；
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6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次。 7.拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取 出，烧瓶口（至少10圈）。 8.用吸管吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养 瓶口和盖子，盖上盖子； 9.拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5分钟 后取出；
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正常和肿瘤组织细胞培养 内容： 正常组织细胞培养： 上皮细胞的体外培养；血管内皮细胞的体外培养；
肾小管上皮细胞的培养； 巨噬细胞的培养； 淋巴细胞的培养 肿瘤细胞培养
不同组织细胞和器官的结构和功能、生长特性不同，在体外培养中所需的分离方法和生长条件也不同。
一、 上皮细胞的体外培养： 许多器官上的上皮细胞具有特定的功能，如肾和肠道上皮细胞具有吸收功能，肝和胰上皮细胞的分泌功能，肺上皮细胞的气体交换功能； 上皮组织还常发生肿瘤。
上皮细胞的基本特征： 1.上皮组织的形态结构： 群体依赖性（population dependence)；接触抑制（contact inhibition) 2.上皮细胞的极性 ： 贴壁依赖性细胞-贴壁生长 生长基质 3 . 上皮细胞间的连接
体外培养的上皮组织细胞的生长生物学 1. 形态学结构： 均质性、透明性很强，结构不明显 2. 体外培养上皮组织的生长与增殖特征 (1) 体外培养的特殊条件： 防范微生物污染； 生长基质的支持； 特殊的培养基（M199 RPMI1640 DMEM Fam F12 无血清培养基）；去成纤维细胞
防范微生物污染 根据上皮组织分布的特性，位于体表或衬贴消化道、呼吸道内等处的上皮组织，直接暴露或同外环境相接触，组织本身带有各种病原微生物或受其污染的机会较多。要求在组织取材时就严格灭菌；分离、种植、培养等诸多操作步骤上都要设法消除可能会出现的微生物污染。培养中所使用的各种液体，包括细胞保存液、分离液以及培养基等需添加抗生素，抗生素浓度比其它组织培养高。
生长基质的支持 皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓的贴壁依赖性细胞。
在培养器皿表面包被生长基质，如胶原或其它细胞外基质成分等，模拟体内的基膜结构，不仅特别有利于上皮细胞的贴附和生长，也有利于培养细胞的分化．使细胞极性表现更为明显。
特殊的培养基 M199和RPMI1640培养基仅适用于上皮组织的短期培养和维持其生存，对上皮组织的长期培养和促增殖作用并不明显。 DMEM和HamFl2培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。可促进上皮细胞的贴附；维持上皮细胞在体外培养状态的分化。HamFl2培养基的特殊性特别适用原代上皮细胞的培养，培养基成分中添加微量元素的无机离子，更加利于细胞的生长和代谢。
在实际培养时，将DMEM与HamFl2按一定比例混合用于上皮组织培养。 培养液特殊添加剂 常用的促细胞生长因子及使用的终浓度
添加剂 终浓度 添加剂 终浓度 BSA 10-5mol/ml EGF 5ng/ml transferrin 5-10 g/ml FGF 5ng/ml insulin 5 pg/ml NGF 5ng/ml 氢化可的松 10-5mol/ml
去除成纤维细胞 上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。取材分离细胞时会带入少量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮细胞混和生长。由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能力强的特点，很容易“疯长”为培养物中的优势细胞群，从而干扰或抑制上皮细胞的生长，成为上皮细胞的“细胞污染源”。
因此在上皮细胞的取材、分离、种植和传代的培养过程中，要特别注意上皮细胞的纯化，去除和抑制成纤维细胞的生长。
(2) 体外培养上皮细胞的形态学变化 体外培养上皮组织细胞的观察与检测 1. 一般形态学观察 光镜： 形态、轮廓、生长情况等。 细胞规则、明亮而饱满、细胞轮廓不清 电镜： 桥粒、形态结构特征、细胞间关系 培养液pH变化： 颜色变化？ 培养物的污染情况： 透明度变化？ 2. 组织化学与免疫组织化学观察与检测 酶类： 碱性磷酸酶； 琥珀酸脱氢酶 特异性抗原标记物： 角蛋白、上皮细胞膜抗原；VIII因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白
二、血管内皮细胞的体外培养 人脐静脉内皮细胞的培养 1.主要材料：组织来源： 婴儿脐带 培养用液： M199+20%FCS； D-Hanks； 0.1%胶原酶溶液 2.培养方法： 分离细胞培养法 1 ). 将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存。 （注：4℃下最多贮存24小时，室温下不超过6小时，否则废弃） 2 ). 用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的。PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。 3 ). 用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml 的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。 4 ). 消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50 ml无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。 5 ).将收集液离心（2000转/分）3分钟，去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置CO2培养箱中培养，两至三天可见细胞长成单层。
5.讨论： (1) 关于接种材料的制备 ： 取材与消化 ； 消化酶、浓度、时间 (2) 排除成纤维细胞：传代去除法 ： 加肝素培养法(90u/ml)； 刮除法 (3) 关于培养液 (4) 关于传代培养
6. 内皮细胞的鉴定： (1) 光镜检查 (2) 透射电镜检查：W-P小体 (3) VIII因子相关抗原的免疫组化检测
三、肾小管上皮细胞的培养 1. 主要材料： a. 细胞来源： b. 无血清培养液： 基础培养液： DMEM/HamF12(1:1) 添加物： 胰岛素 5g/ml；转铁蛋白5 g/ml；硒 5 g/ml；氢化可的松36ng/ml； T3 4 ng/ml； EGF 10 g/ml c. 消化液： 0.2%胰蛋白酶 d. 细胞筛网： 80和100目 2.原代培养： 切取1cm3外层肾皮质、剪碎成1mm3； 80目研磨冲洗、于100目上收集肾小管节段；0.2%胰蛋白酶消化、调整细胞数；接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶进行培养；每隔3~4天，更换培养液 3.传代培养： 4. 培养结果： 3d： 长出细胞； 5~7d ：进入对数生长期； 7~9d： 融合成单细胞层 5.鉴定： 抗角蛋白抗体染色（+） 6.注意事项： a. 分离方法：b. 鉴定方法：
四、巨噬细胞的培养 巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。 巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。 巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。 培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，以小鼠腹腔取材法最为实用。
1、实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml（勿注入肠内！），以刺流产生大量的巨噬细胞。 2、引颈处死小鼠。 3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3－5秒。 4、置动物于解剖台，用针头固定四肢，持镊撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜壁，把皮肤拉向上下两侧，暴露出腹膜壁。 5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同时用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。 6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。 7、小心拔出针头，把液体注入离心管。 8、4℃下250g离心10分钟后，去上清，加10ml DMEM培养基。 9、计数细胞。每只鼠可产生20一30×106细胞，其中90%为巨噬细胞。 10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。 11、接种数小时后，除去培养液，可去除其它白细胞，纯化培养细胞，用DMEM液冲洗1一2次，再加新DMEM培养液置CO2温箱中。
巨噬细胞的培养 动物： 小鼠、大鼠、兔、人 培养基： Eagle ；MEM ；RPMI1640； HamF12 常用的巨噬细胞： 肺泡和腹腔巨噬细胞
获取巨噬细胞的方法 （一）肺泡巨噬细胞 支气管肺泡灌洗法； 支气管镜肺泡灌洗法 （二）腹腔巨噬细胞 1. 小鼠腹腔巨噬细胞的获取： (1)主要材料：实验动物: 6周龄小鼠 ； 培养液： 10%FCS RPMI1640
巨噬细胞的纯化 1、原理： 巨噬细胞黏附能力强、贴壁快特点 2. 方法： 用帖壁法纯化巨噬细胞 ； 用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞
用帖壁法纯化巨噬细胞 1．用含20％～40％小牛血清的RPMI-1640培养液将巨噬细胞配成2×106～4×106/ml的浓度。以每平方厘米2×105～4×105个巨噬细胞的密度将细胞悬液接种到玻璃培养皿（瓶）或塑料培养皿（瓶）中。37℃ 5％ CO2培养箱中培养1小时或24小时。1小时培养节省时间但会丢失一些粘附力弱的巨噬细胞，而24小时可以得到较多的巨噬细胞。20％～40％的小牛血清可以减少B淋巴细胞的粘附。 2．摇晃培养皿（瓶），悬浮未粘附细胞，吸出细胞悬液。用预温的Hanks液洗涤细胞3～4次。悬浮细胞可重复粘附，得到更多巨噬细胞。用适量含2.5mM EDTA的无钙镁Hanks液消化细胞37℃ 15～30分钟。用吸管吹打分离细胞，离心250×g 10分钟，去上清液。 3．用预冷Hanks液洗涤细胞3～4次，每次离心250×g 10 min，去上清。最后用含10％FBS的RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并测细胞活力，将细胞配成所需浓度。
用不连续密度梯度离心纯化巨噬细胞 1．取15ml离心管，将制备好的各浓度密度梯度材料按下浓上淡的顺序依次分层加在离心管中，每个浓度2ml。最后加上上述巨噬细胞悬液3～5ml（约含2×107～5×107细胞）。 2．4℃中，水平离心1000×g 30分钟，垂直取出离心管，小心吸出各交界面的细胞。分别用预冷的含1％小牛血清RPMI-1640培养液洗涤各交界面细胞2次，每次200×g 10分钟。用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成所需的浓度。
巨噬细胞的接种和培养 一）主要材料： 培养液： RPMI1640 等+10~40%FCS+抗生素 （二）实验步骤： a. 冷分离 b. 调整细胞浓度：2~4×106/ml c. 接种培养