不同浓度聚丙烯酰胺凝胶电泳胶的配置及DNA分辨率
聚丙烯酰胺凝胶电泳详解ppt课件
3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度（>1mmol/L) 大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1： 1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度（不>0.26) 低离子强度的溶液中，SDS单体才具有 较高的平衡浓度。
（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分
子才能被解聚，SDS才能定量地结合到 亚基上而给出相对迁移率和分子量对 数的线性关系。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE
一、什么是SDS？
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS)
是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在。
②G-250 二甲花青亮蓝，蓝绿色。
银染色 银染的机制是将蛋白带上的硝酸
银（银离子）还原成金属银，以使银 颗粒沉积在蛋白带上。
（7） 照相，凝胶干燥 （8） 定量测定
3、电泳过程中的不正常现象 （1）“微笑”现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线 形，说明凝胶的不均匀冷却，中间部 分冷却不好。
分离胶聚合之后
（3） 加样品
样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可引起以
下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形
①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。
SDS的作用
破坏蛋白质分子之间以及其他物 质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而 改变原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充 分结合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合 物。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳法1.仪器装置通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。
其电泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极，铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。
2.试剂(1)溶液A 取三羟甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml，再加水溶解并稀释至100ml,置棕色瓶内，在冰箱中保存。
(2)溶液B 取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀释至100ml,滤过，置棕色瓶内，在冰箱中保存。
(3)电极缓冲液(pH8.3) 取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释至1000ml，置冰箱中保存，用前稀释10倍。
(4)溴酚蓝指示液取溴酚蓝0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml 与90％乙醇5ml,微热使溶解，加20％乙醇制成250ml。
(5)染色液取0.25％(W/V)考马斯亮蓝G<[250]>溶液2.5ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
(6)稀染色液取上述染色液2ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
(7)脱色液 7％醋酸溶液。
3.操作(1)制胶取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混匀，抽气赶去溶液中气泡，加0.56％过硫酸铵溶液2ml，混匀制成胶液，立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使胶层高度达6～7cm, 然后徐徐滴加水少量，使覆盖胶面，管底气泡必须赶走，静置约30分钟，待出现明显界面时即聚合完毕，吸去水层。
(2)标准品溶液及供试品溶液的制备(3)电泳将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内，每管加供试品或标准品溶液50～100μl，为防止扩散可加甘油或40％蔗糖溶液1～2滴及0.04％溴酚蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04％溴酚蓝指示液数滴，玻璃管的上部用电极缓冲液充满，上端接负极、下端接正极。
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告一、实验目的1、学习聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE）的基本原理和操作方法。
2、掌握蛋白质和核酸在聚丙烯酰胺凝胶中的分离和检测技术。
3、运用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品的纯度和分子量。
二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成的三维网状结构。
这种凝胶具有分子筛效应，即不同大小和形状的分子在电场中通过凝胶时受到的阻力不同，从而实现分离。
蛋白质和核酸等生物大分子在一定的 pH 条件下带有电荷，在电场中会向与其电荷相反的电极移动。
分子的电荷量、大小和形状等因素共同影响其在凝胶中的迁移速度。
对于蛋白质，通常采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）。
SDS 能使蛋白质变性并与蛋白质结合，形成带大量负电荷的 SDS蛋白质复合物，消除了蛋白质原有的电荷差异，使得蛋白质的迁移速度主要取决于其分子量大小。
对于核酸，常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率更高，适用于分离小片段的核酸，如寡核苷酸和 RNA 片段。
三、实验材料和仪器1、材料标准蛋白质样品（如分子量已知的蛋白质Marker）待测蛋白质样品核酸样品（如 DNA 片段）丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺过硫酸铵（APS）N,N,N'，N'四甲基乙二胺（TEMED）十二烷基硫酸钠（SDS）三羟甲基氨基甲烷（Tris）甘氨酸盐酸溴酚蓝考马斯亮蓝 R-250 染色液脱色液琼脂糖2、仪器垂直电泳槽直流稳压电源移液器离心管微量进样器脱色摇床凝胶成像系统四、实验步骤（一）制胶1、安装电泳槽：将两块玻璃板洗净、晾干，放入电泳槽中，用夹子夹紧，确保玻璃板之间无空隙。
2、配制分离胶：根据所需分离胶的浓度，计算所需丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TrisHCl 缓冲液（pH 88）、去离子水和 APS、TEMED 的用量。
《中国药典》(2020版)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE法）SDS-PAGE法是一种变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。
本法分离蛋白质的原理是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。
本法用于蛋白质的定性鉴别、纯度和杂质控制以及定量测定。
1.仪器装置恒压或恒流电源、垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂（1）水。
（2）分离胶缓冲液（4×，A液） 1.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷18.15g，加适量水溶解，用盐酸调节pH值至8.8，加水稀释至100mL。
（3）30%丙烯酰胺溶液（B液）称取丙烯酰胺58.0g、N,N-亚甲基双丙烯酰胺2.0g，加温水溶解并稀释至200mL，滤纸过滤（避光保存）。
（4）10%SDS溶液（C液）称取十二烷基硫酸钠10g,加水溶解并稀释至100mL。
（5）四甲基乙二胺溶液（TEMED，D液）商品化试剂。
（6）10%过硫酸铵溶液（E液）称取过硫酸铵10g，加水溶解并稀释至100mL。
建议临用前配制，或分装于-20℃可贮存2周。
（7）浓缩胶缓冲液（4×，F液）0.5moL/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷6.05g，加适量水使溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100mL。
（8）电极缓冲液（10×）称取三羟甲基氨基甲烷30g、甘氨酸144g、十二烷基硫酸钠10g，加水溶解并稀释至约800mL，用盐酸调节pH值至8.1~8.8之间，加水稀释至1000mL。
（9）非还原型供试品缓冲液（4×）称取三羟甲基氨基甲烷3.03g、溴酚蓝20mg、十二烷基硫酸钠8.0g，量取甘油40m1，加水溶解并稀释至约80mL，用盐酸调节pH值至6.8，加水稀释至100mL。
聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定不同蛋白质产品的纯度
聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定不同蛋白质产品的纯度一、基本原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂的作用下，聚合交联而成，具有三维网状结构，能起分子筛作用。
用它作电泳支持物，对样品的分离不仅取决于各组分所带电荷的多少，也与分子大小有关。
此外，凝胶电泳由于体系的不连续性，具有独特的浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH 梯度作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离效应用凝胶电泳分离血清样品时，除了与纸电泳一样具有电荷效应外，还有浓缩效应（不连续电泳发生于浓缩胶中）和分子筛效应（发生于分离胶中），故其分辨率比纸电泳高。
1、浓缩效应当样品胶和浓缩胶选用pH6.7Tris/HCI 缓冲液、电极液选用pH8.3Tris/甘氨酸缓冲液时，在电泳的开头，盐酸几乎全部解离释放出氯离子（Cl -），甘氨酸（pl 为6.0、pKa ’为2.34，pKa ”为 9.7）则只有1%～0.1%解离释放出甘氨酸根离子（NH 2-CH 2-COO -），而酸性蛋白质一般在浓缩胶中解离为带负电荷的离子。
这三种离子带有相同类型的电荷，并同时向正极移动，其有效泳动率按如下次序排列：-----∙〉∙〉∙-gly gly protein protein Cl a m am a m式中m 代表泳动率，a 代表解离度，ma 代表有效泳动率。
根据有效泳动率的大小区分，把最快的Cl -称为快离子（又称前导离子）；把最慢的 gly -称为慢离子（又称尾随离子）。
在电泳刚开始时，三层凝胶（样品胶、浓缩胶和分离胶）中都含有快离子，只是电极缓冲液中含有慢离子。
电泳进行时，由于快离子的泳动率最大，因此很快超过蛋白质，于是在快离子后边形成一离子浓度低的区域，即低电导区。
电场强度与电导成反比关系：ηIE =(伏/厘米)式中E 代表电场强度，l 代表电流强度，η代表电导率。
因此，在低电导区就产生了较高的电场强度。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳知识讲解
S D S-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳该技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。
一、原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。
这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。
由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。
SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。
本实验采用垂直板状不连续系统。
所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。
1．样品的浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。
在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：莱姆利(emmli)于1970年创建的含十二烷基硫酸钠(SDS)的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质方法。
向样品加入还原剂(打开蛋白质的二硫键)和过量SDS，SDS是阴离子去垢剂，使蛋白质变性解聚，并与蛋白质结合成带强负电荷的复合物，掩盖了蛋白质之间原有电荷的差异，使各种蛋白质的电荷／质量比值都相同，因而在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时迁移率主要取决于蛋白质分子大小。
是分析蛋白质和多肽、测定其分子量等常用的方法。
可测定蛋白质分子量.其原理是带大量电荷的SDS结合到蛋白质分子上克服了蛋白质分子原有电荷的影响而得到恒定的荷/质比.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白质分子量已经比较成功,此法测定时间短,分辨率高,所需样品量极少(1～100μg),但只适用于球形或基本上呈球形的蛋白质,某些蛋白质不易与SDS结合如木瓜蛋白酶,核糖核酸酶等,此时测定结果就不准确.2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）(1)定义丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）(2)SDS的作用SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小(3) SDS-PAGE分类：SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类：连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳(4)聚丙烯胺凝胶的生成：聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
在电场的作用下，小分子蛋白质可以 容易地通过凝胶孔径，而大分子蛋白 质则受到较大的阻力，无法通过，从 而实现蛋白质的分离。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用
蛋白质组学研究
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白质 组学研究中常用的分离方法，可用于 蛋白质的表达、纯化、鉴定和功能研 究。
实时监测与数据分析
引入实时监测技术和数据分析软件，可以实时监测电泳进程并获 取更准确的数据，为后续分析提供有力支持。
应用拓展
临床诊断
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳在临床诊断中发挥着越来越重要的作用， 可用于检测和鉴别疾病相关的蛋白质标志物。
生物医药研究
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳在生物医药研究中广泛应用于蛋白质组 学、药物筛选和生物标志物发现等领域。
sds－聚丙烯酰胺凝胶电泳
目 录
• SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳简介 • SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳实验操作 • SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果分析 • SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的优缺点 • SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的发展趋势
01 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电 泳简介
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的定义
准备凝胶制备所需材料
根据实验需求，准备适量的丙烯酰胺、 N,N'-甲叉双丙烯酰胺、SDS、 TEMED等材料。
制备缓冲液
根据电泳条件选择适当的缓冲液，如 TAE或TBE，并配置适量的浓度。
准备样品
将待测样品进行适当处理，如超声破 碎或离心取样。
操作步骤
制备凝胶
点样
按照一定比例将丙烯酰胺、N,N'-甲叉双丙 烯酰胺、SDS、TEMED混合，加入适量的 水搅拌均匀后倒入电泳槽中。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。
3,6- 脱水
3,6- 脱水
1,４ 连结
1,3 连结
1,４ 连结
琼脂糖的基本结构是由 1,3 连结的 β-D- 半乳糖和 1,4 连结的 3,6- 脱水 α-L- 半乳糖相间联结而成。 琼脂糖在水中一般加热到 90℃ 以上溶解，温度下 降到 35 -40℃ 液体形成良好的半固体状的凝胶。 琼脂糖的凝胶性是由存在的氢键所致，凡是能破坏 氢键的因素都能导致凝胶性的破坏。
荧光染料的选择
溴化乙锭（ethidium bromide，EB）
SYBR Green
advantages
Inexpensive Less toxic No UV light required No hazardous waste disposal
disadvantages
Less sensitive More DNA needed on gel Longer staining/destaining time
2000bp 1200bp 750bp 500bp
200bp 80bp
注意事项：
✓ 上样要迅速准确，上样量不要过大以致漫出样品孔 ✓ 若样品要求无污染，可使用新的灭菌枪头上样 ✓ 若样品无严格要求(如用来做小量酶切鉴定的样品)，可用一个枪头多次上样，但每次上样前 在电泳缓冲液中洗几下 ✓ 电源接对正负极
不同类型琼脂糖的性质
琼脂糖类型
凝结温度/℃ 熔化温度/ ℃ 备注
标准琼脂糖
35~38 40~42
高强度琼脂糖 34~43
修饰的低熔点/ 25~35
凝点琼脂糖
35
PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)实验
PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)实验【实验原理】聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacryamide gel electropHoresis, PAGE)是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化作用下形成的三维网状结构物质。
在不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的制作是分层进行的，因此凝胶不仅有分子筛效应，还具有浓缩效应。
和琼脂糖凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶难于制备和处理。
它们的分离范围较窄。
但是它们也有突出的优点，由于是不连续的 pH 梯度，故样品被压缩成一条狭窄的区带，因而增强了分离效果，提高电泳分辨率。
尤其对小DNA 片段的分析(5～500bp)。
在这一范围内，仅差1bp 的DNA 分子也能清晰地分开。
其次，DNA 纯度很高。
从聚丙烯酰胺凝胶中得到的DNA 纯度很高以致于下步操作不用任何处理。
还有，它的负载容量高。
该胶的标准加样槽中可以加入高达10mL 的DNA 样品，而不影响电泳分辨率。
多应用于分离纯化和鉴定大小为5～500bp 的DNA 片段。
聚丙烯酰胺凝胶电泳有连续与不连续体系两种，前者指在整个电泳体系中的缓冲液pH值和凝胶孔径大小相同，主要用于核酸分析。
后者主要用于蛋白质样品的分离，它除了电泳槽中的缓冲体系和pH 值与凝胶中不同外，凝胶本身也由缓冲体系、pH 值和凝胶孔径不同的两种凝胶堆积而成。
以下主要介绍连续体系。
【仪器、材料与试剂】1.30% 的丙烯酰胺/N,N＇—甲基双丙烯酰胺(Acr/Bis)：29g 的丙烯酰胺，1g 的N, N＇—甲基双丙烯酰胺，加蒸馏水至100mL。
2.10% 过硫酸铵(Aps)：0.4g 过硫酸铵，4mL 蒸馏水，TEMED(N,N,N＇,N＇—四甲基乙二胺)。
3.1.5mol/L Tris-HCI(pH8.8)：量取3mol/L Tris 母液50mL，用盐酸调节pH 至8.8，用重蒸水定容至100mL(4℃存放)；0.5mol/L Tris-HCI(pH6.8)：量取1mol/L Tris 溶液50mL，用盐酸调节pH 至6.8，用重蒸水定容至100mL(4℃存放)。