基于竞争性互补介导核酸恒温扩增技术快速检测沙门氏菌
环介导等温扩增技术在兽医中的应用
提高 疾 病检 测 的效 率和 有效 地控 制疾病 的传 播 。
５ 胚 胎 的性 别 鉴 定
基 于 Ｙ染 色体 上 特 异序 列 的检 测 ， Ｈｉ ｒ ａ ｙ ａ ｍａ等
利用 Ｌ Ａ ＭＰ检 测 牛胚 胎 的性 别 ，显微 切 割 胚胎 活 检
４ 在寄 生虫检测 中的应 用
Ｌ ｉ ａ ｎ ｇ 等同 建立 了溶组 织 内 阿米 巴 Ｌ Ａ ＭＰ检 测法 ，
检 出 限达 到每 个 反 应 管 １ 个 寄生 虫 ，与传 统 的 巢 式 Ｐ Ｃ Ｒ 比较 ，该 Ｌ Ａ ＭＰ法灵 敏度 ９ ２ ％ ，特异 性 １ ０ ０ ％。 Ｐ ｏ ｏ ｎ等［ ８ １ 建立 了恶性 疟 原虫 的 Ｌ Ａ ＭＰ检测 方 法 ， 相 比
［ １ １ Ｎ ｏ ｔ ｏ ｍ ｉ Ｔ ， Ｏ ｋ ａ ｙ ａ ｍａ Ｈ ， Ｍ ａ ｓ ｕ ｂ ｕ ｃ ｈ ｉ Ｈ， ｅ ｔ １． ａ Ｌ ｏ ｏ ｐ － ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｉ ｓ ｏ ｔ ｈ ｅ ｒ ｍ ａ ｌ ａ ｎ ＇ ｌ — ｐ ｌ ｆｅ ｉ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｄ Ｎ Ａ［ Ｊ 】 ． Ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｉ ｃ ａ ｃ ｉ ｄ ｓ ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ， ２ ０ ０ ０ ， ２ ８ ， １ ２ ： Ｅ ６ ３ ．
２在 细菌检测 中的应用
冯瑜菲等嘲 建立 的产志贺毒素 Ⅱ型变异体 大肠 杆菌 （ Ｓ ｔ ｘ ２ ｅ 大肠 杆菌 ） Ｌ Ａ ＭＰ检测 方 法对 Ｓ ｔ ｘ ２ ｅ大 肠杆菌 的最低检出量为 ３ ８ Ｃ Ｆ Ｕ ／ 管（ Ｃ Ｆ Ｕ是菌落形成 单位 ） ，敏感 性 高 于 Ｐ Ｃ Ｒ方 法 （ ３ ． ８ Ｘ １ ０ ｓ Ｃ Ｆ Ｕ ／ 管） 。 Ｌ Ａ Ｍ Ｐ和 Ｐ Ｃ Ｒ对 模 拟 样 品检 测 结 果 的符 合 率 为 １ ０ ０ ％。可 以检测 出不 同来 源 的 Ｓ ｔ ｘ ２ ｅ 大 肠杆 菌 ， 而 对 不耐热肠毒素、 耐热性肠毒素 、 Ｓ ｔ ｘ ２ ｅ 和大肠杆菌 的检 测 结 果 均为 阴性 。张 静 等【 ３ ］ 利用 Ｌ Ａ ＭＰ法快 速 检测 致 病 性 哈维 氏弧 菌方 法 ， 对 哈 维 氏弧 菌 Ｄ Ｎ Ａ 的最 小 检 出 量为 １ 飞克 ， 比Ｐ Ｃ Ｒ法灵 敏 度高 ３ 个 数量 级 。 选 择 哈 维 氏弧菌 、 副溶 血 弧菌 、 费 氏 弧菌 、 创伤弧菌 、 溶 藻
加环引物LAMP法快速检测沙门氏菌方法的研究
引言
沙门氏菌属（ａ ｏｅ ａ Ｓｌ ｎｌ） ｍ ｌ 是肠杆菌科 的一类革兰 氏阴性肠道杆菌， 是一种重要的人兽共患病病原茵， 可引起
伤寒、肠炎等多种疾病．肉、蛋、奶等畜产品中含有多种营养成分， 适合沙门氏菌的生长， 是该菌 的主要传播媒 介． 在我国细菌性食物 中毒中， ７．０ 有 ０８％是由沙门氏菌引起的， 而在 引起沙门氏茵中毒的食品中，肉、 蛋、 奶等
氏菌的 ｉ ａ 因为靶基 因，选择 Ｐ Ｒ 的特异性引物，并基于该基 因设计 出 Ｌ ＭＰ反应 的引物 ； 究对 Ｌ Ｐ体 系的 ｎ 基 ｖ Ｃ Ａ 该研 Ｍ Ａ 反应温度 、 ＮＴ ｄ Ｐ浓度和镁 离子浓度等扩增条件也进行 了优化，并检测 了 Ｐ Ｒ和 Ｌ Ｐ的引物特异性，比较 了 Ｐ Ｒ法 、 Ｃ Ｍ Ａ Ｃ Ｌ Ｐ法和加环 引物 的 Ｌ Ｐ法的灵敏度．结果表 明： Ｐ Ｒ法检 测的灵敏度为 ２２ ｘ０ｃ ／ ，未加环 引物的 Ｌ ＭＰ Ｍ Ａ Ｍ Ａ 普通 Ｃ ．８ ｌ ｆ ｍｌ ｕ Ａ
Hale Waihona Puke 物（Ｆ和 Ｌ ） 有助于该法提高扩增效率． Ｌ Ｂ， 虽然环引物和内引物都作用于环结构上， 但是环引物所杂交的 Ｌ ＭＰ Ａ 形成 的环结构是内引物杂交的环结构以外位置， 它们的扩增机制并不相同 ．目 Ｊ 前， 对环引物在进行 Ｌ ＭＰ Ａ 反应
中所起的作用的研究较少． 本次试验在 Ｌ Ｍ Ａ Ｐ反应中加入环引物， 并分别与普通 Ｌ Ｍ 和 Ｐ Ｒ进行 比较， Ａ Ｐ Ｃ 研究 加入环引物对 Ｌ Ｍ 法检测沙门氏菌检测的影响， Ａ Ｐ 从而建立一套高效的快速检测沙门氏菌的方法．
１ 材料与 方法
１ 材料 与试 剂 ． １
Ｌ ＭＰ反应试剂：ｓＤ Ａｐ ｙ ｒ ｅ ａ ｅ ｒｇ ｅｔ 自Ｎ ｗ Ｅ ｇ ｎ ｉｌ 公司； Ａ Ｂ ｔ Ｎ ｏｍｅ ｓ ｌ ｇ ａｍ ｎ 购 ｌ ａ ｒ ｆ ｅ ｎ ｌ ｄ ｏ ｂ ａ Ｂ ａ 甜菜碱（ｅ ｉ ） 自北 Ｂ ｔｎ ￣ ａ ｅｌ
沙门氏菌的检测技术进展
沙门氏菌的检测技术进展刘喆;张书萧;王少辉;陈晓平;马志永;郭欢欢;田明尧;金宁一【摘要】沙门氏菌是影响食品公共安全的重要因素之一。
目前沙门氏菌的检测方法主要包括传统方法、以分子生物学为基础的方法、以免疫学为基础的方法、电阻抗法、生物传感器法、噬菌体法以及联合检测方法。
本文主要对目前各种检测方法的原理、优缺点、应用情况以及发展前景进行了概述。
%Salmonella is implicated in human food-borne diseases and thus has a significant impact on public health.The traditional methods for detection of Salmonella are time-consuming,so there is a need for the development of innovative methods for the rapid identification.At present,many techniques have been developed to detect Salmonella including molecularbiology,immunology,impedance,biosensor,phage methods and their combinations.In this paper,the principle,advantage and weaknesses of each method are reviewed.【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2012(020)002【总页数】6页(P81-86)【关键词】沙门氏菌;检测;食源致病菌【作者】刘喆;张书萧;王少辉;陈晓平;马志永;郭欢欢;田明尧;金宁一【作者单位】吉林农业大学食品科学与工程学院,长春130118／中国农业科学院上海兽医研究所动物源性食品安全研究中心,上海200241;吉林农业大学食品科学与工程学院,长春130118／中国农业科学院上海兽医研究所动物源性食品安全研究中心,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所动物源性食品安全研究中心,上海200241;吉林农业大学食品科学与工程学院,长春130118;中国农业科学院上海兽医研究所动物源性食品安全研究中心,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所动物源性食品安全研究中心,上海200241;吉林农业大学食品科学与工程学院,长春130118／中国农业科学院上海兽医研究所动物源性食品安全研究中心,上海200241;中国农业科学院上海兽医研究所动物源性食品安全研究中心,上海200241【正文语种】中文【中图分类】S852.612沙门氏菌是一种可以引起沙门氏菌病的革兰氏阴性菌，是最常见的人畜共患型食源性致病菌之一。
环介导等温核酸扩增技术快速检测食源性致病菌应用进展
１／２—１／３。直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度 进行判断是否发生反应。ＬＡＭＰ技术具有高特异性、 高效率和便捷等特点１４１。 １．２引物设计ＬＡＭＰ引物的设计比常规ＰＣＲ要 复杂。一个反应至少包括４条引物，包括一对内引物 （ＦＩＰ和ＢＩＰ）和一对外引物（Ｆ３和Ｂ３）；外部引物限 定了扩增片段的大小范围，同时也为内部引物提供 了模板，如果再增加一对环引物（１００ｐ ｐｒｉｍｅｒ），会明 显加快等温扩增的速度，大大提高检测效率，检测率 比没有加环引物的高７个数量级１５，６１。国外已建立
６１
要的食源性致病菌，感染导致肠炎疾病，发病率呈逐 年上升趋势。副溶血性弧菌致病因子是其携带的ｔｄｈ 和ｔｄｌ编码毒力基因，采用常规检测方法无法解决风 险监测和评估。徐芊等“７首次报道了利用ＬＡＭＰ技 术检测副溶血性弧菌，针对副溶血性弧菌不耐热溶 血素基因（ｔｌＩＩ）设计４条特异引物进行ＬＡＭＰ扩增， 对扩增反应进行优化，最佳反应时间为６０ｍｉｎ，反应 温度为６０℃，特异性为１００％，且副溶血性弧菌基因 组ＤＮＡ和纯培养物的检测灵敏度分别为９０ｆｇ和 ２４ｃｆｕ／ｍＬ，对模拟样品检测，检测限为８９ｃｆｕ／ｇ，整个 过程ｌ小时能完成检测。 ２．５阪崎肠杆菌检测２００２年国际食品微生物标 准化委员会（ＩＣＭＳＦ）把阪崎肠杆菌列为“严重危害 特定人群，危害生命或慢性实质性后遗症或长期影 响”致病菌［１８１，该菌能引起严重的新生儿脑膜炎、菌 血症和坏死性小肠结肠炎，并可能遗留严重的神经 系统后遗症，死亡率２０％一５０％Ｉｔ９ Ｊｏ贺楠等∞参照 阪崎肠杆菌标准株（ＡＴＣＣ５１３２９）１６ＳｒＲＮＡ基因设计 ４条特异性引物。方法最低检测限可达到 ０．３ｐｇＤＮＡ，当稀释度１０５时才检测不到扩增产物，而 ＰＣＲ方法稀释度１０２时就检测不到扩增物。而胡莲 霞ｍ１则以１６Ｓ。２３Ｓ ｒＲＮＡ间区序列作为靶序列，采 用带有２条环引物（ＬＦ和ＬＢ）的改良ＬＡＭＰ方法检 测婴儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌，灵敏度为 ０．１０１ｃｆｕ／ｍＬ，人工污染阪崎肠杆菌的婴儿配方奶粉 的检出限为１．１ｅｆｕ／ｇ，而对照ＰＣＲ方法检测阪崎肠 杆菌的灵敏度为１０１ｃｆｕ／ｍＬ，人工污染阪崎肠杆菌的 婴儿配方奶粉的检出限为１ １００ ｃｆｕ／ｇ，改良ＬＡＭＰ 方法比较ＰＣＲ方法，其灵敏度提高了ｌ ０００倍，检测 耗时仅为ｌ～３ｈ。 ２．６金黄色葡萄球菌检测 金黄色葡萄球菌是一 种常见的致病菌，导致感染性疾病是其产生的肠毒 素造成的，且耐药性金黄色葡萄球越来越广泛。申 建维等勉荆用多重ＬＡＭＰ法同时扩增金黄色葡萄球 菌耐药基因ｍｅｃＡ和ｆｅｍＡ，在反应过程中，两种分子 信标荧光探针分别与ｍｅｃＡ和ｆｅｍＡ基因的扩增产物 序列互补结合，最后检测反应管中的两种荧光值。 结果显示该方法的检测下限为１０ｃｆｕ／ｍＬ，与传统的 Ｍ２Ｈ培养基苯唑西林药敏实验结果比较，灵敏度为 ９９．９％，特异度为９０．９％。适用于直接快速检测临 床标本中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。 ２．７单核细胞增生李斯特氏菌单核细胞增生李 斯特氏菌是一种能够引起人畜共患疾病的食源性致 病菌，ＷＨＯ已将其列为２０世纪９０年代食品中四大
恒温扩增技术及其在病原生物学中的研究进展
D! 区组成 (' 下游内部引物 %A%,! 由 FHG 区和 F! 区 组 成 (' 上 游 外 部 引 物 %DE! 由 DE 区 组 成 ( 及 下 游 外
部引物 %FE!由 FE 组成 (" 整个扩增过程分为起始阶段和循环扩增阶段 " %H( 起始阶段 )D%, 的 D! 序列首先和模板 D!G 结合 ! 引导合成互补链 * 随后 !DE 与模板 DEG 结合 ! 在 A/'
?@), 的核心是具有链置换活性的 A/' 1:@ 聚
合酶的应用以及基于靶核酸 B 个特异性片段 % 即 C& 端的 D# 'D! 和 DE 区和 E& 端的 FEG'F!G 和 FHG 区 ! 其中 D! 区和 A! 区为目的扩增片段 ( 的 $ 条特殊引 物 的 设 计 ! 分 别 为 上 游 内 部 引 物 %D%,! 由 DHG 区 和
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LAMP
LAMP（环介导等温扩增）技术2011-07-28 11:46 来源：北京蓝谱点击次数：1341 关键词：LAMP PCR技术环介导等温扩增分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网PCR方法在人类及动植物疾病基因诊断、食品分析和环境监测等领域发挥着举足轻重的作用，其灵敏度高、特异性好，是目前最精准的基因诊断方法。
然而PCR方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适合基层或现场快速诊断，因此在国内的推广速度并不是很快。
2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即LAMP (L oop-mediated isothermal amplification),中文名为“环介导等温扩增反应”，受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在这次甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学公司接受WHO的邀请进行H1N1 LAMP试剂盒的研制。
通过荣研公司近十年的推广，LAMP技术已广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中，并得到了欧美国家的认同。
LAMP方法的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。
可以预见，在未来的基因诊断领域，LAMP方法将占据大壁江山。
目前，在万方数据库搜索LAMP文章500多篇。
详见：/paper.asp x?q=loop-mediated+isothermal+amplification&o=sortby+CitedCount+CoreRank+date+relevanc e%2fweight%3d5&f=top&n=10&p=11. 优缺点介绍：LAMP方法优点：灵敏度高（比传统的PCR方法高2～5个数量级）；反应时间短（30～60min就能完成反应）；临床使用不需要特殊的仪器（试剂盒研发阶段推荐用实时浑浊仪）；操作简单（不论是DNA还是RNA，检测步骤都是需将反应液、酶和模板混合于PCR管中，置于水浴锅或恒温箱中63℃左右保温30～60min，肉眼观察结果）。
沙门氏菌 LAMP 检测试剂盒说明书
沙门氏菌 LAMP检测试剂盒使用说明书Loop-mediated Isothermal Amplification Method（使用前请详细阅读本说明书）前言本试剂盒采用LAMP方法结合荧光染料显色的体外扩增和检测技术，适用于食品或环境中沙门氏菌快速检测。
试剂盒组成组成成份（20 test/kit）规格DNA提取液 1.6mL×1管反应液Sal440μL×1管稳定液600μL×1管Bst酶10μL×1管阳性对照DNA Sal50μL×1管阴性对照50μL×1管显色液40μL×1管储存方法及有效期本试剂盒储存于-20℃下有效期为一年（请在有效期内使用）。
实验前准备培养基（前增菌用）移液器吸嘴移液器（0.5-10μL,10-100μL,100-1000μL） 1.5ml无菌离心管金属浴或者水浴锅0.2mL PCR反应管高速离心机工作服及一次性手套碎冰样品采集及存放1.采集本试剂盒适用于增菌液或可疑菌落样本。
样品制备、增菌培养和分离按照GB/T 4789.4标准方法进行。
2.存放待测样品在2-8℃保存不应超过24小时；-20℃长期保存，应避免反复冻融。
使用方法1.样品处理增菌液模板DNA的制备，对于标准方法培养的增菌液：a) 直接取该增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，10000r/min离心2min，尽量吸弃上清；b) 加入80μL DNA提取液，混匀后沸水浴10min，置冰上10min；r/min离心2min，上清即为核酸模板；取上清置-20℃可长期保存备用。
c) 10000可疑菌落模板DNA的制备：对于标准方法分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，加入80μL样品预处理液，再按照上述步骤b)制备模板DNA 以待检测。
2.核酸扩增a) 试剂盒内反应液Sal使用前建议室温融化振荡混匀后，2000r/min离心10sec；其余室温融化后，2000r/min离心10sec即可。
食品中微生物快速检测方法的研究进展
２ ０ １ ３ ， １ ９ （ ６ ） ： １ ５ — １ ８
Ｆ ｏ ｏ ｄ ａ ｎ ｄ Ｎ ｕ ｔ ｉ ｒ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ
食 品中微 生物快 速检 测方 法 的研 究进展
洪 炳财 ，陈 向标 ，赖 明 河
（ 揭 阳市质 量计 量监督 检 测 所 ，广 东揭 阳 ５ １ ５ ３ ０ ０ ）
术对副溶血性弧菌等 ８ 种 常见致病菌进 行检测 ，结果显
Ｐ Ｃ Ｒ、反转录 Ｐ Ｃ Ｒ等。
李光伟 等建 立 了检测 食 品中沙 门菌 的 Ｒ Ｔ Ｑ ． Ｐ Ｃ Ｒ 方法 ，所设计特异引物和探针 针对沙 门氏菌 ｆ ｉ ｍ Ｙ基因 ，
实验表明 ，该方法检测灵 敏度为 １ ８ ０ ｅ ｆ ｕ ／ ｍ Ｌ ，检 出的阳
来测定 沙门氏菌。对食品样 品中的 ２ １ 种 已知沙 门氏菌
１ 分 子 生物 学 技术
１ ． １ 基 因芯 片 技术
基 因芯片的原理是杂交测序 方法 ，即在一块基 片表 面固定数以万计核酸探针 ，与，并 用计算机迅速分 析得 出所要 的信息 ；与传统的检测方法相 比，它 不仅可
以在一张芯片上同时对多个微生物进行检测 ，而且可 以
球菌、乳酸杆菌 、小肠结肠炎耶尔森氏菌 、肉毒梭菌等
食品中常见的微生物。Ｐ Ｃ Ｒ还经发展而衍 生出许多 Ｐ Ｃ Ｒ 优 良技 术 ，如 荧 光 定 量 Ｐ Ｃ Ｒ 、多 重 Ｐ Ｃ Ｒ、Ｒ ｅ ａ ｌ — ｔ ｉ ｍ ｅ
使检测人员在短时间内掌握大量微生物 的信息。基 因芯 片技术具快速 、高效 、自动化 的特点 ，广泛应用 于食 品 微生物的检测 、环境监测 等领域 。陆长 勇…等采用该技
变化情况可实现对待测微生物 的鉴定 。通过建立 电导率 的时间曲线与微生物生长曲线二者之 间关系 ，就能通过
交叉引物等温扩增技术检测沙门氏菌
检测分析 食品硪究与拜发 Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２０１３年１月
第３４卷第２期
交叉引物等温扩增技术检测沙门氏菌 ６７＝＝Ｉ
祁军 ，左峰 ，刘国红 ，刘红梅 ，徐高连：，张霞ｔ・’ （１．天津出入境检验检疫局，天津３００４６１；２．杭州优思达生物技术有限公司，浙江杭州３１００５３）
摘要：建立一种新型沙门氏茵快速筛选检测方法一一交叉引物恒温扩增检测方法。针对沙门氏茵设计特异性引物及 探针，建立交叉引物等温扩增法进行检测。用１９株沙门氏茵，３５株近源菌进行特异性试验；通过定量ＤＮＡ、纯茵液计 数检测进行灵敏度验证。建立方法具有很好的特异性；增菌液检测灵敏度为１０２ｃｆｕ／ｍＬ，ＤＮＡ检测灵敏度为１０ ｆｇ／ｔｅｓｔ。 建立的交叉引物恒温检测方法特异性好、灵敏度高，不需要复杂仪器，对口岸快速筛查、基层或偏远经济不发达地区 顺利开展检测具有实际意义。 关键词：沙门氏菌；交叉引物，等温扩增技术
Ａ Ｃｒｏｓｓ Ｐｒｉｍｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ＱＩ Ｊｕｎ ，ＺＵＯ Ｆｅｎｇ ，ＬＩＵ Ｇｕｏ－ｈｏｎｇ ，ＬＩＵ Ｈｏｎｇ—ｍｅｉ ，ＸＵ Ｇａｏ—ｌｉａｎ ，ＺＨＡＮＧ Ｘｉａ ， （１．Ｔｉａｎｊｉｎ Ｅｎｔｒｙ—Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３００４６１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｕｓｔａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ｈａｎｇｚｈｏｕ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００５３，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｎｅｗ ｒａｐｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ—ｃｒｏｓｓ—ｐｒｉｍｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｂｅ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ，ｗｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｃｒｏｓｓ—ｐｒｉｍｅｒ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ １ ９ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ａｎｄ ３５ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｖ ｔｅｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＤＮＡ，ｐｕｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｏｕｎｔｅｄ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ａｒｔｉｃｌｅ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ．Ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｃｅｔｉｏｎ ｗａｓ １０ ｆｇ／ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ．１０。ｃｆｕ／ｍＬ ｆｏｒ ｐｕｒｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｅａｓｙ ｔｏ ｏｐｅｒａｔｅ ａｎｄ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｒｅｑｕｉｒｅ ａｎｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ．Ｉｔ ｉｓ ｖｅｒｙ ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｒｔ ｏｒ ｕｎｄｅｒｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ａｒｅａｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ；ｃｒｏｓｓ ｐｒｉｍｅ；ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
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基于竞争性互补介导核酸恒温扩增技术快速检测沙门氏菌陈旭;毛瑞;李堂正;乔宇;彭晴;杜昱光【摘要】食源性致病菌污染是食品安全问题的重要隐患之一,沙门氏菌是食品中最常见的食源性致病菌.为快速检测食品中的沙门氏菌,满足食品生产过程中实时检测监控的需要,基于竞争性互补介导核酸恒温扩增(competitive annealing mediated isothermal amplification,CAMP)技术,建立一种操作简便/准确性高/灵敏度高的沙门氏菌快速检测方法.以沙门氏菌invA基因保守区域片段为靶序列,利用DNAMAN设计特异性引物,并在己筛选获得沙门氏菌的CAMP引物基础上,应用CAMP引物设计推荐规则及作用位点,进行加速引物的设计和筛选,评估加速引物对扩增反应的影响;并且对建立的方法进行特异性及灵敏性的检测评估.同时与PCR方法进行比较.结果表明:以沙门氏菌invA基因为目标核酸所设计的一对CAMP引物可以实现对沙门氏菌的快速检测,而且在反应体系中引入加速引物可以将检测时间缩短15min;PCR方法的检测限为103 CFU?mL-1,而本研究所建立的方法在65℃恒温条件下80min内检出沙门氏菌,检测限为10CFU?mL-1,检测效率和灵敏度均优于传统PCR方法,而且操作简便,无需精密/复杂的变温仪器;对3株沙门氏菌和10株非沙门氏菌进行特异性检测,3株阳性对照株检测全部为阳性,10株阴性对照菌检测全部为阴性,说明本试验所建立沙门氏菌快速检测方法具有良好的特异性,而且对沙门氏菌无漏检,具有较好的通用性.【期刊名称】《沈阳农业大学学报》【年(卷),期】2019(050)002【总页数】6页(P174-179)【关键词】沙门氏菌;竞争性互补介导核酸恒温扩增;快速检测【作者】陈旭;毛瑞;李堂正;乔宇;彭晴;杜昱光【作者单位】沈阳农业大学食品学院,沈阳110161;中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京100190;黑龙江大学生命科学学院,哈尔滨150080;中国农业科学院饲料研究所,北京100081;中国农业科学院饲料研究所,北京100081;中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京100190【正文语种】中文【中图分类】TS251.7民以食为天，食以安为先。
食源性疾病，是食品安全的头号问题，其主要是由致病性微生物所引起，如大肠杆菌、李斯特菌、沙门氏菌等。
在世界各国的各类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒最为严重[1-2]。
沙门氏菌属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌，目前已发现的沙门氏菌血清型已达2500多种，其中约1400多种能感染人类。
所以针对食品原料、产品等进行沙门氏菌检测是我们国家食品监管部门及食品相关企业必不可少的检测项目。
虽然我国建立了国家食源性致病菌监测网络，但是食源性致病菌的检测技术还相对滞后。
目前，沙门氏菌检测的国标检测方法（GB4789.4-2010）依然是培养分离法[3]，该方法操作繁琐复杂，周期较长，需要大约4～7d的时间才能做出最终鉴定，难以满足对食品生产过程进行实时监测的需求，这种方法主要有5个步骤，包括前增菌、选择性增菌、选择性平板分离、生化鉴定及血清学鉴定。
在这种情况下，作为常规检测的一个重要补充，食源性致病菌快速检测发挥着常规检测不可替代的作用。
目前，免疫检测技术和分子检测技术是沙门氏菌快速检测中普遍采用的方法。
其中，免疫检测技术以抗原抗体为基础[4-5]，具有耗时短、操作简单及不受场地制约等优势，但其灵敏度不高，易产生假阳性、假阴性结果，应用具有一定的局限性。
分子检测技术中PCR技术在沙门氏菌检测中得到了广泛的运用[6-7]，但该技术需要精密、复杂的变温仪器，需配备专业操作人员，难以满足快速检测的应用需求。
而恒温扩增技术能够在恒定的温度下实现对目标分子的体外扩增，仅需一个水浴锅或热块即可实现温度控制，大大简化了核酸检测的操作步骤。
当前的恒温扩增技术主要包括：基于核酸序列的扩增（NASBA）[8]、滚环扩增(RCA)[9-10]、链取代扩增（SDA）[11]、重组酶聚合酶扩增（RPA）[12-13]、聚合酶螺旋扩增（PSR）[14]以及环介导等温扩增（LAMP）[15-18]等。
LAMP方法由于具有反应条件要求低、快速、高特异性和高灵敏度的优势，目前已成为用途最为广泛的核酸恒温扩增方法，但其引物设计复杂，同时其产物的自扩增能力导致假阳性问题较为严重，一定程度上限制其应用。
竞争性互补介导核酸恒温扩增（CAMP）是毛瑞等[19]研发的一种恒温扩增方法，相较于LAMP方法，所需的目标核酸片段较短，引物设计原理更简单，且同样具有很高的特异性及灵敏度[20]。
因此，本研究拟基于CAMP技术，以沙门氏菌的invA基因序列为保守靶序列设计引物，建立沙门氏菌的快速检测方法，并对其灵敏性和特异性进行研究，以期能够满足食品安全对致病菌快速检测的需求。
1 材料与方法1.1 菌种本研究所涉及到菌株包括3株沙门氏菌和10株非沙门氏菌。
其中的标准菌株分别购买于中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC），其他菌株为中国科学院过程研究所糖生物工程课题组提供（表1）。
1.2 材料及试剂dNTP Mixture(10mM)、DNA maker购自碧云天（上海）生物技术有限公司；Eva Green、Gel Red购自biotium 公司；Bst 2.0 DNA 聚合酶、10×ThermoPol反应缓冲液（包括 200mM Tris-HCl、100mM KCl、100mM(NH4)2SO4、20mM MgSO4及 1%Triton X-100）购自纽英伦生物技术（北京）有限公司；核酸提取试剂盒购自康宁生命科学有限公司；DEPC水、蛋白胨、酵母提取物购自索莱宝（北京）科技有限公司；甜菜碱购自阿拉丁（上海）生化科技股份有限公司。
其他试剂均为分析纯试剂。
表 1 试验所用菌株Table 1 Strains used in the experiment序号No.1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13菌种名Strain沙门氏菌Salmonella沙门氏菌Salmonella沙门氏菌Salmonella金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus志贺氏菌Shigella志贺氏菌Shigella单增李斯特菌Listeria monocytogenes大肠杆菌Escherichia coli大肠杆菌Escherichia coli 大肠杆菌Escherichia coli大肠杆菌Escherichia coli绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa菌株编号Strain number CVCC1789 CVCC2139 GBG-B-0031 CVCC1884 GBG-B-0033 CVCC3926 GBG-B-0034 CVCC1597 CVCC1491 CVCC1299 CVCC3367 GBG-B-0032 GBG-B-00351.3 仪器与设备实时荧光定量PCR仪（ABI公司，美国）；小型高速离心机（Eppendorf公司，德国）；掌上离心机（大龙兴创实验仪器有限公司，北京）；NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific公司，美国）；Tanon-1600凝胶成像分析系统（天能科技有限公司，上海）；DYY-6C型电泳仪（六一仪器厂，北京）；电热恒温水浴槽（析达仪器有限公司，上海）；生化培养箱（天翎仪器有限公司，江苏）；恒温培养震荡摇床（赫田科学仪器有限公司，上海）；高压蒸汽灭菌锅（科瑞永兴化玻仪器有限公司，沈阳）。
1.4 细菌培养、计数及DNA模板制备本研究按照GB 4789系列标准对沙门氏菌进行培养增菌，然后将菌液用灭菌的生理盐水按10倍梯度依次稀释，取100μL涂于平板，37℃过夜培养18～24h，然后进行细菌计数。
本试验按照商业化的核酸提取试剂盒的使用说明，取1mL细菌培养液制备细菌DNA模板。
1.5 引物的设计与合成针对沙门氏菌的 invA基因序列（GenBank：EU348368）确定保守靶序列（图1），采用引物设计软件DNAMAN分别针对靶序列上的7个区域设计1套3对CAMP 引物，包括 1 对内引物（NF，NR），1对外引物（F2，R2）和 1 对环引物（Fin，Rin）。
同时利用美国NCBI提供的BLAST在线软件进行序列比对，从理论上对所设计引物的特异性进行验证。
本试验所用引物由北京六合华大基因科技有限公司合成（表2）。
1.6 沙门氏菌CAMP检测的反应体系CAMP的基本反应体系为25μL，体系中引物：1.6μM NF，1.6μM NR，0.8μM Fin 和0.8μM Rin，0.2μM F2，0.2μM R2；其他试剂：2.5μL 10×Thermopol buffer，8U Bst 2.0 DNA 聚合酶，1.4mM dNTP Mixture，6mM MgSO4，1M 甜菜碱，1μL Eva green，1μL模板 DNA；反应条件：65℃ 反应60min并应用实时荧光PCR仪监测反应过程，80℃反应10min灭活酶终止反应。
图1 invA基因序列保守片段及引物区段Figure 1 Conservative fragments of invA gene sequence and primers表2 沙门氏菌引物序列Table 2 Primer sequence of Salmonella序列(5′-3′)Sequences(5′-3′)CCGAAAT ACCGCCAATAAAGTAAAGGTGACGCTATTGCC ACTTTATTGGCGGTATTTCGGGCGGAGGACAAATCCATAC GGCATCATTATTATCTTTGTG CATGGCGGGTCATCCCCA ACGGTTCCTTTGACGGTGC GGTCAGCATG GTATAAGTAG GenBank登记号GenBank No.EU348368引物Primer SL-NF SL-NR SL-Fin SL-Rin SL-F2 SL-R2 1.7 特异性试验本试验为了证明所建立的沙门氏菌快速检测方法的通用性和特异性，分别对表1中3株阳性菌提取的模板DNA进行检测，证明方法的通用性，同时对10株阴性菌提取的DNA样本进行特异性检测。
1.8 灵敏度试验本试验以沙门氏菌（CVCC2139）不同菌液浓度提取的DNA作为模板进行方法灵敏度研究。
对沙门氏菌CVCC2139菌液进行平板计数，并用灭菌处理的生理盐水对菌液进行10倍稀释浓度至10CFU·mL-1，然后提取DNA，应用本研究所建立的CAMP方法进行灵敏度检测。