球虫实验
鸡球虫病的诊断与防治
鸡球虫病的诊断与防治鸡球虫病是由球虫寄生于鸡的唾液腺和皮肤引起的一种寄生虫病。
该病具有较强的传染性和致死性，严重威胁了鸡的健康和养殖业的发展。
及时诊断和有效防治鸡球虫病对于保障鸡的健康，促进养殖业的稳定发展具有重要意义。
本文将介绍鸡球虫病的诊断和防治措施。
1. 临床症状鸡球虫病主要通过观察鸡的临床症状来进行初步诊断。
患病鸡的主要症状包括：唾液腺肿大、饮水困难、啄食无力、体温升高、羽毛蓬松、生长迟缓、消瘦和死亡等。
饲养密集的鸡群更容易发生鸡球虫病，对于密集饲养的鸡群需要加强观察，及时发现并进行诊断。
2. 实验室检测除了观察临床症状外，还可以通过实验室检测来明确诊断鸡球虫病。
常用的实验室检测方法包括：唾液腺组织切片检查，皮肤切片检查，唾液腺针吸检查和血清免疫学检测。
这些检测方法可以帮助饲养员明确鸡群是否患有球虫病，有针对性地进行防治工作。
3. 疫情调查在发现鸡球虫病病例后，需要及时进行疫情调查，了解疾病的传播情况、患病鸡的数量和分布等。
通过疫情调查可以帮助饲养员判断疫情的发展趋势，有针对性地采取防治措施，防止疫情扩大。
1. 环境卫生鸡球虫病主要是通过鸡舍和饮水器等环境传播的，保持鸡舍的清洁卫生和饮水器的清洁卫生是预防鸡球虫病的重要措施。
饲养员应定期清理鸡舍，清洁饮水器，保持环境卫生，减少球虫的传播。
2. 防疫措施饲养员在日常管理中需要加强鸡的防疫工作，定期进行疫苗接种，提高鸡的免疫力，预防球虫病的发生。
对于患有球虫病的鸡群，需要及时隔离治疗，防止疫情扩大。
3. 药物防治当发生鸡球虫病疫情时，需要根据实际情况选择合适的药物进行防治。
常用的药物包括：杀球虫剂、抗寄生虫药物和抗菌药物等。
在使用药物进行防治时，需要严格按照药品说明书上的使用方法和剂量进行施药，避免滥用药物导致药物残留和药物抗性的产生。
4. 合理饲养管理对于密集饲养的鸡群，饲养员需要注意合理的饲养管理，减少鸡群的应激反应，保持鸡的健康状态，降低鸡球虫病的发生风险。
动物粪便中球虫卵囊的检测方法
动物粪便中球虫卵囊的检测方法1 目的（适用范围）本方法适用于猪、禽、兔、犬、猫球虫病感染的检测。
2 依据（参考）标准《动物球虫病诊断技术》（GB/T 18647-2002）3 原理卵囊通常存在于宿主粪便中，从粪便中分离球虫卵囊最常用的方法为饱和食盐溶液漂浮法。
饱和食盐溶液密度高于卵囊密度，而低于粪便中大多数杂质，经离心或静置沉淀后，大部分杂质沉淀在容器底部，卵囊漂浮在悬浮溶液的表面，然后收集表层漂浮物；由于卵囊比重大于水的比重，所以表层漂浮物用自来水稀释离心后，卵囊沉淀富集于离心管底部即可得到大量球虫卵囊。
4 材料4.1 被检样品被检动物的新鲜粪便不少于30 g。
4.2 试剂耗材饱和食盐水、60目筛网、50 mL和100 mL烧杯、玻璃棒、15 mL离心管、自制铁丝吊环（或细菌接种环）、载玻片、盖玻片、香柏油、麦克马氏计数板。
4.3 仪器设备电子天平、托盘天平、低速离心机、1 mL移液器、显微镜、手动计数器。
5 检测方法5.1 定性检查5.1.1 取被检动物的新鲜粪便5 g，放入50 mL烧杯中，加入3倍体积的水，用玻璃棒搅拌均匀，经60目筛网过滤。
5.1.2 将滤液移入离心管中，在天平上平衡，于离心机上以3000 r/min离心3 min，弃上清液，在沉淀中再加入适量水，将沉淀吹起，平衡离心同上，弃上清液，如此重复2~3次至上清液清亮，弃上清液。
5.1.3 在沉淀中加入5倍体积的饱和食盐水，用玻璃棒将沉淀搅拌均匀，在天平上平衡，于离心机上以3000 r/min离心5 min，小心快速用铁丝吊环蘸取液膜，抖于载玻片上，盖上盖玻片，于100~400倍镜下检查。
5.1.4 结果判定：（1）若发现球虫卵囊，判为阳性，说明该动物已感染球虫，并可根据附录卵囊形态特征，初步确定为哪一属的球虫。
（2）若未发现球虫卵囊，需重复检查5次，仍未见球虫卵囊，本粪样可判为阴性。
5.2 定量检查5.2.1 对定性检查中呈现阳性的粪样进行定量检查。
一例兔球虫病的诊治
兔球虫病是由多种艾美尔球虫寄生于兔的肝脏和肠道，引起以消瘦、贫血、下痢为主要症状的寄生虫病。
近年来，随着龙岩市规模兔场的增多，该病成为困扰养兔业发展常见且危害严重的疾病。
笔者现将一例兔球虫病的诊治情况报告如下。
1发病情况2010年3月20日，龙岩市某规模兔场450头50日龄左右的幼兔陆续出现食欲减退、消瘦、下痢。
发病3天后，食欲废绝，个别病兔出现四肢痉挛或麻痹，头向后仰，发出惨叫，迅速死亡。
场主认为发生急性胃肠炎，对病兔使用庆大霉素和环丙沙星等抗菌素治疗，未见明显好转，发病5天死亡幼兔75头，病情还有加重趋势。
2临床症状整个兔场的幼兔精神沉郁，食欲减退，剩料明显，轻赶伏卧不动，被毛粗乱，眼鼻分泌物增多，腹围增大，腹部臌胀，下痢，腹泻。
粪便呈褐色、有腥臭味，肛门和后肢的被毛粘着一些稀粪，部分笼底可见血痢粪便。
病兔虚弱、脱水、消瘦、贫血，可视黏膜苍白，对肝区触诊有痛感。
观察中发现有3只病兔突然出现转圈、翻滚、四肢痉挛划动、头向后仰等神经症状，尖叫几声倒地死亡。
3病理变化5只对已死兔和3只出现神经症状的病兔进行解剖，可见胃膨胀，内充满大量的液体和气体。
十二指肠、空肠、回肠和盲肠的肠壁血管充血，肠腔充气，呈急性卡他性肠炎，肠壁增厚，黏膜上可见充血、出血，肠黏膜有化脓性与坏死性病灶。
腹腔内有充满稀薄带有血色的液体。
肝脏肿大，肝表面及实质内有数量不等的白色或淡黄色，米粒至碗豆大结节性病灶，沿胆小管分布。
胆囊胀大，胆汁浓稠色暗，其他脏器未见病变。
4实验室检查无菌取病兔的肝、心直接涂片，经革兰氏染色后镜检未发现细菌。
无菌采集的肝、心病料接种于普通琼脂和麦康凯琼脂平板上，37℃培养24~48小时，镜检均未见细菌生长。
取病兔肝的结节病灶制成涂片，镜检可见大量不同发育阶段的球虫卵囊。
粪便中卵囊检查方法是取10克兔粪置于200亳升烧杯中，加饱加食盐水15亳升，用玻棒将粪便捣碎后，再加入180毫升饱和食盐水，混匀后用双层纱布过滤到其他烧杯内，静置45分钟后，用直径6~8毫米的小铁丝圈水平接触液面，沾取水膜，移放置载玻片上，盖上盖玻片，在40倍显微镜下观察，镜下可见有大量椭圆形，双层膜外壳，一端具有1个孔、中央内含1个原生质团块，大小为26~40微米×16~25微米不等的球虫卵囊。
球虫DNA及RNA提取方法汇总
粪便中卵囊的收集和纯化简介球虫感染鸡后，在宿主体内经裂殖生殖、配子生殖后形成带有卵囊壁的未孢子化卵囊，随粪便排出体外。
粪便中的卵囊由于密度小于饱和盐水，因而可以被后者漂浮起来；而卵囊的密度又大于稀释的盐水溶液，故而可以从稀释的盐水中沉淀下来。
根据此原理，利用饱和盐水漂浮粪便中的卵囊，然后将含卵囊的饱和盐水用水稀释后离心沉淀，即可将卵囊从粪便中分离和纯化。
材料塑料盆若干个（视所收集的粪便量而定）80目（60目、100目也可）和160目（或者180目）金属筛各一个搅拌用塑胶软铲一个不锈钢铲子一个1L塑料烧杯1-3个，100ml、500 ml塑料烧杯各一个离心罐（低速大容量离心机因平衡需要，需在任何离心时将6个罐平衡后全部放到支架上）报纸若干张尖头吸管玻璃棒（粗）或药品勺（不锈钢制）吹气软管（以上物品需在烤箱中80℃烘烤2h后使用）秤（婴儿秤）一台电子天平（普通天平也可）一台吹气设备饱和盐水（自来水加入过量食盐煮沸，冷却后分装至塑料桶或500 ml瓶中，注意防冬天温度过低造成盐水不饱和）2.5% 重铬酸钾溶液步骤1.用塑料盆收集接种后6.5-8天的粪便（本时间选取是针对柔嫩艾美耳球虫的，其他虫种请查阅文献，确定收集时间），搅拌均匀（若鸡只数目少，应在6.5天时在粪便收集盘中洒一些重铬酸钾溶液以保持粪便湿润），称重；2.称取2g粪便至塑料小烧杯中，加入60ml饱和盐水，搅拌均匀，充入改良麦克马氏板记数室，静止3min后在显微镜下计数；计算粪便的OPG（计数所的读数×200），估算粪便中卵囊总数；3.将粪便中加入5-10倍体积的自来水，搅拌均匀，然后用80目筛子进行过滤；此过程中需用塑胶软铲不停搅动，使大部分的水溶液滤过筛网，收集至一塑料盆；滤后的粪渣置于另一塑料盆；4.粪渣再加入自来水，如步骤3过滤；此过程重复2次（针对粪便量少者，可以增加一次以提高卵囊收集率），最后弃去粪渣；5.将所有的滤过液用160目的筛子进行二次过滤，滤液收集至塑料盆中；6.滤液静止3h或更长（不宜过夜，长时间浸泡对卵囊活力有影响；需过夜再继续操作者，应在滤液中添加重铬酸钾，至浓度在1-2.5%），然后快速倾去大部分上清（动作既快又稳，小心不得将沉淀倒掉）；7.将所得到的混悬液离心（3000rpm，8-10min或3600rpm，5min；以下离心均采用此设置），收集所有沉淀；8.用玻棒搅匀沉淀，加入少许饱和盐水，搅匀，再次添加并搅拌，至形成均匀的混悬液（一般加入的饱和盐水的体积为粪便沉淀的5倍，采用步骤10（2）时可以将加至离心罐容积上限）；9.离心漂浮卵囊；（后续的操作步骤10有两种，粪便沉淀量少者可采用第一种10（1），量大者可采取第二种10（2））10.（1）所得的含卵囊上清倒入一个大烧杯中，重复步骤8，离心后同样将上清收集至烧杯；并再重复一次，合并3次所得上清；将上清均匀分配至离心罐中，加入至少3倍体积的自来水，然后离心沉淀卵囊；10. (2) 用尖头吸管吸取上清表层漂浮的卵囊，所吸液体收集于一个烧杯中；至表层大部分卵囊漂浮物被吸走后，将剩余上清转移至另一大烧杯；沉淀搅匀后，倒回转移的饱和盐水，少量多次并搅拌，同步骤8，可补加盐水以弥补上清吸取转移走的盐水；如此再重复2次，合并3次所吸取的表层卵囊溶液，加入至少3倍体积的自来水，然后离心沉淀卵囊；11.所得卵囊沉淀因含有大量粪便等杂质，需再次用饱和盐水离心漂浮一次（若卵囊数量少于1千万，此步骤推荐用50ml离心管进行操作，以免丢失过多）；随后离心沉淀；12.两次漂浮沉淀后得到的卵囊沉淀用重铬酸钾溶液重悬，转移至小锥形瓶或盐水瓶中（重铬酸钾的体积根据卵囊的数量决定，每毫升所含卵囊不得超过100万，但可以多加）；13.接好吹气装置，置于28℃温箱或自制孵化箱中通气孢子化，时间为48小时（注意24h时添加水，补偿吹气孵化所蒸发的水）；孢子化完毕，将卵囊做好标记保存于4℃；14.做好善后事宜，如操作台和离心机的清洁、所用物品的清洁与归位、鸡只的剖杀与笼具的清洗等。
鸡场球虫病调查
为抗体阴性。
在进行阻断率检测时，每次检测血清为采血当天检测，多次检测结果均出现负值，可能是试剂盒
各厂家猪瘟疫苗免疫后抗体阻断率呈明显上升趋势。
各组平均抗体阻断率
上述实验中，D组为A厂猪瘟活疫苗+B厂稀释液，免疫效果与A组和B组相比没有明显的差别。
表明B厂稀释液并没有达到其所宣传的增强免疫效果的作用。
上述实验中，B厂猪瘟活疫苗为三种疫苗中病毒含量最高的，但在免疫效果上并没有明显的优势，因此对
鸡场球虫病调查
江苏省常州市金坛区金城兽医站
过的病鸡，长期不得康复，生长发育受到严重的影响。
一些感染鸡群不产生明显的临床型球虫病，造成的隐性感染所带来的损失可能更大。
据统计，我国每年用于防治鸡球虫病的药费达数亿元人民币，占鸡病全部防治费用的近三分之一，而全球养禽业每年因为球虫病造成的损失高达数十亿美元。
一、材料与方法
（一）粪样采集
笔者以群体采样法，在常州某畜禽有限公司5个养鸡场不同的点采集粪便(四周和中央共五点)，每个粪样重100～200 g，共采集5个鸡群5个粪样，按时间分两次采样，总计10个样品。
第1次采样鸡群日龄20～30 d，鸡群大小1～2万只，共7.7万只鸡；第2次采样鸡群日龄40～50 d，鸡群大小1～2万只，共7.7万只鸡。
（二）卵囊计数
每个样品取2 g粪便，加入10 ml水搅拌均匀,再加入50 ml饱和盐水，过滤至小试管中,滴一滴。
雏鸡球虫病的实验室诊断与防治措施
雏鸡球虫病的实验室诊断与防治措施高建新【摘要】鸡球虫病是由艾美尔属的球虫寄生在鸡体内引起的一种原虫病,该病主要发生在鸡的肠道,该病是危害养鸡业发展的重要传染病之一。
鸡球虫病是养鸡场常见的一种寄生虫病。
各种年龄的鸡均可感染该病,但雏鸡最易感。
近年来,该病在我市呈散发状态。
下面笔者结合临床病例就鸡球虫病的实验室诊断与防治体会介绍如下,仅供养殖户和同行们参考。
【期刊名称】《新农民》【年(卷),期】2019(000)003【总页数】1页(P96-96)【关键词】雏鸡球虫病;诊断;防治措施【作者】高建新【作者单位】[1]河南省武陟县动物卫生监督所,河南武陟454950【正文语种】中文【中图分类】S858.311 发病情况2018年8月10日，河南省焦作市陟县某一鸡场饲养的60日龄的雏鸡突然发生了一种以贫血、血便、消瘦和生长缓慢等为主要特征的疾病。
发病后该养殖户给发病鸡群应用了常用的土霉素等抗生素进行治疗几天后，效果不明显，而且发病鸡只和死亡鸡只不断增加。
该养鸡户共饲养3000只雏鸡，截止2018年6月15日，该场共发病500只，死亡300只。
经流行病学调查、发病情况、临床特征、病理变化和实验室诊断，确诊为鸡球虫病。
2 临床症状临床可见病雏鸡鸡冠和肉髯苍白，消瘦，羽毛凌乱，缩头；精神沉郁，食欲减退或废绝；间歇性拉稀，粪便暗红色；有的病雏鸡不喜欢运动，扎堆，双翅下垂，有的两肢轻瘫；个别病雏鸡出现神经症状，厌食，渴欲增强，嗉囊内有大量液体。
3 病理变化剖检可见病死雏鸡尸体消瘦，全身皮下、浆膜和黏膜有出血点和出血斑；血液稀薄，凝固不良；小肠中段气胀，肠壁增厚，并有白色斑点和瘀斑，肠黏膜充血、出血或有坏死；肠内容物血样，内含碎片或脱落的黏膜，其它内脏器官病理变化不明显。
4 实验室检验根据发病情况、临床症状和病理变化可作出初步诊断，确诊需要借助实验室。
（1）直接涂片镜检法将病鸡的粪便或病变部位的肠粘膜刮取物少许，放载玻片上与甘油饱和盐水（即500ml水加食盐180g等量混合波）1～2滴混匀，再加盖玻片，置显微镜下观察，球虫的卵囊呈圆形或椭圆形，卵囊壁有两层厚薄不一的轮廓，卵囊内有一团球形原生质，根据卵囊这些特征，可初步鉴定为球虫。
不同抗球虫药物对球虫的敏感性试验
笼初 重 笼 末 重 ＧＲ Ｓ
关键词：岭南黄鸡；球 虫；敏感性 中 图 分 类 号 ：８ ５． ２３ ８２７＋ 文 献 标 识 码 ：Ａ
文章 编 号 ： ｌＯ — ５ ７ ２ １） ３ ０ ２ － ３ Ｏ５ ８ ６ （０ ２ ０ — ０ ７０
随着 集 约化养 鸡 的发 展 ，鸡 球虫 病 的危 害越 来 越 大 。我 国每 年用 于 防治 鸡球 虫病 的药 费达数
（ 感染 不用药 组 ＧＲ 不 Ｓ 一感 染 不 用 药 组 Ｇ Ｒ ： Ｓ ） 以 Ｐ Ａ ￣５ ％； Ｏ Ａ ｏ Ｎ为耐药性 ， ０ 为敏感 。 ＞５ ％ ＧＲ Ｓ ＝笼末 重 ／笼初 重 ×１ ０ 。 ０ ％ Ｏ Ｇ 每 克粪 便卵 囊数 。 Ｐ：
由 ＰＡ Ｏ Ａ测 定 的球 虫 耐药 性结 果见表 ５ 。由表
球痢灵， ０ｇ Ｔ ５ ０ ／ 马杜霉素 ＋尼卡巴嗪 ，０ ｇ Ｔ ２ ０ ／ ４０／＋４ｇＴ
禽安 ＋ 尼卡 巴嗪，０ ｇＴ ２ ０ ／ ４０／＋４ｇＴ
球 虫 散 ，Ｏ ０ ／ ｌ ０ ｇＴ
Ａ Ｉ（ Ｃ ＝ 相对 增重 ＋存 活率） （ 一 卵囊值 ＋肠道 病
变值 ） Ｃ ＞１０为 敏感 ，２ ～ １９为部 分敏 感 ， 。Ａ Ｉ ６ ｌ０ ５ ＜１０为完 全耐 药 。 ２ 相 对增 重 ＝试 验 组 末重 一试验 组 初重 ） （ （ ／ 空
分 组及 处 理 空 白对 照 组 攻 毒对 照 组 癸 氧 喹 酯 组 ，０ ｇＴ ５０ ／
不同抗球 虫药物对球虫的敏感性试验一李重生 ，等
表 ２ 用 ＡＣ 测 定 球 虫 耐药 性 结果 ｌ
马杜霉素组，０ ｇ Ｔ ５０ ／ 莫能霉素组，０ ｇＴ ５０ ／
肠艾美尔球虫纯种分离及18SrDNA部分序列测定
．
４ — ０—
中 国动 物 检 疫
２１ ０ ０年 第 ２ ７卷 第 ８期
肠 艾 美 尔球 虫纯 种 分 离 及 １ Ｓ ｒ ＮＡ 部 分 序 列测 定 Ｄ ８
崔 平， 顾小龙 ， 方素芳， 刘红彬 （ 河北北方学院动科院， 河北 张家 口 ０ ５ ０ ） ７ ０ ０
摘 要： 采用单 卵囊分 离技 术， 离肠 艾美尔球 虫。 分 根据 ＧｅＢ ｎ ｎ ａｋ中发表 的肠 艾美 尔球 虫 １ＳｒＮ ８ Ｄ Ａ序列 ， 设计 对 引物 ， 建立 Ｐ Ｒ方法对其基 因片段扩增并测序 、 Ｃ 比对。 结果成 功分 离肠 艾美 尔球 虫，Ｐ Ｒ扩增 出清晰条 带， Ｃ 大小 为 ５ ８ ｐ 最低 能检 出 ２ 个孢子化 卵袭。该序 列测定结果与 Ｇｅｅａｋ 发表 的肠 艾美 尔球 虫 １Ｓ ｒ Ｎ ２ ， ｂ ７ ｎｂ ｎ ８ Ｄ Ａ比对 ， 相似
ｃ ｕｄ ｄ ｔｃ ７ ｐ ｒ ｌｔｄ ｏ ｃ ｓｓ ｉ ｉ ｒ ｆ ｇ ｎ ｓｑ ｅ ｃ ｓ ｗａ ｐ ｔ ８５ ｂ ｔ ｅ ｅ ｐ ｅ ｉｕ ｌ ｕ — ｏ ｌ ｅｅ ｔ ２ ｓｏ ｕａｅ ｏ ｙ ｔ．Ｓｍ ｌｉ ａ ｔ ｏ ｅ ｅ ｅ ｕ ｎ ｅ ｓ ｕ ｏ ９ ．％ ｙ ｅ ｗｅ ｎ ｔ ｒｖｏ ｓｙ ｐ ｂ ｈ
Ｋ ｗ咖 ８ ． ｔｓｉａｉ： Ｓ ｇｅ ｏ ｃ ｓ ｓｐ ｒｔ ｎ １ Ｓ ｒ ：Ｅｉ ｅｔ ｌ ｎ ｎ ｓ ｉ ｌ ｏ ｙ ｔ ｅ ａａｉ ； ＤＮＡ； Ｓ ｑ ｅ ｃ ｇ ｎ ｏ ８ ｅｕ ｎ ｉ ｎ
基金项 目： 国家兔产业技 术体 系（ 农业部 Байду номын сангаас 资助项 目
ｚ ｉｏ ｓ ｈ ９ ２，２ ： ６ ． ２８ １ Ｂ —ｄ ｅ ｅ ｇｃ ｒ ｃ ｐｏ ｓ ｉ ｐ ｒｉ ｅ ａ ｒ ｎ ｒ ｉ ｅ ｅ ｔ ｒ ｎ ｏｃ ｎ 没有增 加 ， 但是每 一根肌纤 维的直径 Ａｒｎｅｆｒｃ ｕｎｇ，１ ７ ２ ｃ ｋ ｒＰＫ，Ｄａｒ ｍｐ ｅＲ Ｉ ａ ｉｏ ｙｅ ［］ＪＡｎｍ ｃ，１９ ，７ ： ｌｙ ｌ ｄｐ ｃ ｔｓ Ｊ． ｉ Ｓ ｉ ９ ６ ４ 增加 了， 这是肌 纤维中肌原 纤维数量 ｆ１ＲｉｋＣ Ａ，Ｂａ ｅ ４ ９ ２． ｅｏ ｅ ｒｉ ｎ ｎ ｏ ｇ ｎ ｓ ｔ ｍ ｉ 增加 的结果 。但 Ｃ Ｌ对 白小 鼠心脏 的 Ｂ．Ｕｓ ｆｒｐａｔｔｏ ｉｇ ｆａ ｅ ｔ ｏ ｉ ． ９８ ． ９ ｐ ｏ ｅｐ ｒｏ ｍａ ｃ ｎ ｏ ｙｃ ｍｐ ｓｔ ｎ 『】Ｄ ｅｎ ｎ Ｗ ｒｖ ｅｆｒ ｎ ｅａ ｄｂ ｄ ｏ ｏ ｉｉ ９ ｏ ｒｎ ａ Ｇ．Ｃ ｅ ｂ ｔｒｌｎ ｔａ 一 ｌｎ ｕｅｏ ｏ 口 影响存 在雌雄差异 ， 具体原 因有待进 ｏ ａ ｎ ｍａｓ 『１ ｆ ｍｅ ｔ ａ ｉ ｌ Ｊ．Ｒｅ ｉｒ ｃ ｌＭ ｅ ｔ ｐｏ ｅ ｒ ｓ ａ ｌ ａ ａａＪ． ａ ｃｐｏ ａ ａ ｒｖ ｄｆ ｅｉ ｃｔｅｉ Ｃ ｄ ［］Ｃ ｏ ｕ ｎ ｎ ｎ ｎ 步研 究。 ｎ ｏ ９ ４，３ ： ． １ ７ ５ １． Ｖｅ ， ９ ４， ５： ４ ｔ １９ ３ ７． Ｊ 许 多亚急性动物 试验证实 ， 应用 Ｃｏ ｆＰｒ ｃ，１ ８ ３ 中华 人 民共 和 国药 典 【］ ０ ５版 ． Ｓ． ０ ２ 北 ［０ 张清 安 ， 学辉 ． 物性食 品中盐酸 １】 范 动 Ｃ Ｌ能够引起心肌 肥大 ，特别 是左心 ［］ 京 ： 学工 业 出版社 ， ０ ５ ２ ８２ ９ 化 ２ ０ ： ５ ．５ ． 克 伦 特 罗 的研 究 进 展 ［］ 品科 学 ， Ｊ．食 室肥大等心血管系统变化 。同时这些 『１Ｅｌｏ ｔ Ｔ，Ｍｃ ａ ｇ ｅ ４ ｌ ｔ Ｃ ｉ ｃ ｕ ｈ ｙＷ ，Ｃｒ ｏ ｓ ２ ０ Ｊ ｏ ｋ ０ ５，２ ４ ２ ５ ２ ８ ６（）： ６ ．６ ． 研 究也 认为 这种 肥 大 的心脏 具有 正 Ｓ Ｒ ，ｅ １ Ｈ ｔ ａ．Ｒｅ ｉ ｕ ｓ ｏ ｌｎ ｕ ｅ ｏ ｎ ［１ 杨 秀平 ． 物 生 理学 ［ ． ｓｄ ｅ ｆｃ ｅ ｂ ｔ ｒ ｌｉ １】 动 Ｍ】 北京 ： 高等 常 的形 态 结构和 正 常 的收缩 和舒 张 ｃｔｅｒｃｉｉｇｔｅａ ｅ ｔ ｏｅ Ｊ． ｔ 教育 出版社 ， ０２ １４１５ ａｔ ｅ ｎ ｒｐ ｕｉ ｄ ｓｓ［］Ｖｅ ｌ ｅ ｖ ｈ ｃ ２０ ：７． ． ７ 功 能 ， 心 肌 肌 浆 网 Ｃ ２Ａ Ｐ ｓ２ ａ － Ｔ ａｅａ ＋ ［２ 陈 杖榴 ． 药 理学 【 ． ． 京 ： １】 兽医 Ｍ】 ２版 北 Ｑｕ ｒ ｒ ， ９ ５ ７ １ ０ １ ２ ａｔ ｌ １ ９ ，１ ： ０ ． ０ ． ｅｙ （Ｅ Ｃ ａ 及磷 酸 受 体 蛋 白 （ｈ ｓ Ｓ Ｐ Ａ２） ｐ ｏ．
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二、实验器材1.仪器设备。
上海XSP-2C生物显微镜（具备10倍目镜和低倍、高倍物镜及油镜）；目镜测微尺和物镜测微尺；盖玻片、载玻片、牙签、洗瓶、平皿；剪刀及手术刀；离心管；血细胞计数板。
2.实验材料。
感染球虫的患鸡,常见的球虫卵囊,蔗糖、食盐、硫酸镁、铬硫酸、重铬酸钾等。
三、实验方法、步骤和操作要领（一）球虫的形态观察随宿主粪便排出的卵囊呈卵圆形、圆形或球形；无色、淡黄色或淡绿色，其形态大小随球虫种类而异。
外被有两层囊壁，外壁较厚，轮廓清晰；内壁较薄。
内含颗粒状的胞质(即原生质团)。
卵囊内具有一至多个孢子囊，每个孢子囊内含有一至多个子孢子，因种类而异。
艾美耳属的球虫种类经发育后，原生质团分裂为四个孢子囊，每个孢子囊内含有两个子孢子。
有些种类的球虫在卵囊的极端具有明显的卵膜孔，有些球虫的卵囊内膜突出于卵膜孔之外，形成极帽。
畜禽常见球虫的种类：1．牛球虫。
文献报道的有10种，其中9种为艾美耳属（Eimeria）球虫，另外一种为阿沙卡等孢球虫（Isospora akscaica）。
以邱氏艾美耳球虫(E. zurnii)致病力最强，牛艾美耳球虫(E.bovis)致病力较强，它们寄生于牛消化道的上皮细胞。
(1)邱氏艾美耳球虫(E. zurnii)。
卵囊呈亚球形或球形，平均直径为18.6μｍ×14.6μｍ。
淡黄色，无卵膜孔，胞质充满整个卵囊，无极体。
卵囊孢子化时间为24～72小时。
(2)牛艾美耳球虫(E.bovis)。
卵囊呈卵圆形，褐色，有卵膜孔，平均大小27.7μｍ×20.3μｍ，卵囊孢子化时间为48～72小时。
2. 兔球虫。
种类很多，有16种，属艾美耳属。
仅介绍两种如下。
(1)斯氏艾美耳球虫(E.stiedae)。
寄生于肝、胆管上皮细胞内。
致病力最强。
卵囊甚大，长椭圆形，大小为26～40μｍ×16～25μｍ，略带淡红色，囊壁较厚，具卵膜孔。
(2)穿孔艾美耳球虫(E.perforans)。
寄生于肠上皮细胞内。
卵囊甚小，椭圆形，两端较钝，无色，大小为13.3～30.6μｍ×10.6～17.3μｍ，卵膜孔不明显。
3. 鸡球虫。
报道的有9个种，属艾美耳属，世界公认的有7个种。
(1) 柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)。
寄生于盲肠，多为宽卵圆形，少数为椭圆形，原生质呈淡褐色，卵囊壁为淡黄绿色（图17-1）。
其卵囊平均大小为22μｍ×19μｍ，形状指数为1.16，裂殖体很大，直径可达54μｍ，第一代裂殖体包含的裂殖子可达900个，第二代为350个，最短孢子化时间为18ｈ，最短潜隐期为115ｈ。
图17-1柔嫩艾美耳球虫卵囊(2) 毒害艾美耳球虫（E.necatrix）。
其第一、二代裂殖生殖在鸡小肠，第三代裂殖生殖和配子生殖在盲肠。
卵囊呈卵圆形，大小为13.2～22.7μｍ×11.3～18.3μｍ，囊壁无色、光滑。
具极粒，孢子囊呈卵圆形，有斯氏体，无残体（见图17-2）。
图17-2毒害艾美耳球虫卵囊(3) 堆型艾美耳球虫（E.acervulina）。
寄生于十二指肠。
卵囊呈卵圆形，大小为17.7～20.2μｍ×13.7～16.3μｍ。
光滑，卵囊壁淡黄绿色。
孢子囊呈卵圆形，有斯氏体，具极粒，无残体（图17-3）。
图17-3堆型艾美耳球虫卵囊(4) 布氏艾美耳球虫（E.brunetti）。
寄生于小肠后段、直肠和盲肠近端区。
卵囊平均大小为18.8μｍ×24.6μｍ，是鸡球虫中仅次于巨型艾美耳球虫的第二大型卵囊。
形状指数为1.31。
有一极粒，无残体和卵膜孔。
裂殖体直径为30μｍ。
孢子化时间为18ｈ，潜隐期为120ｈ。
(5) 巨型艾美耳球虫(E.maxima)。
寄生于小肠中段。
卵囊很大，是鸡球虫中最大型的卵囊，最大的卵囊达到42.5μｍ～29.8μｍ。
卵囊呈卵圆形，一端钝圆，一端较窄，黄褐色，囊壁浅黄色。
其形状指数为1.47。
最大的裂殖体直径为9.4μｍ。
（图17-4）。
(6) 和缓艾美耳球虫(E.mitis )。
寄生于鸡小肠前段。
卵囊较小，近球形，卵囊壁为淡黄绿色，有一极粒，无卵膜孔，也无残体。
卵囊平均大小为15.6μｍ×14.2μｍ，最短孢子化时间为15h.（图17-5）。
(7) 早熟艾美耳球虫（E.praecox ）。
寄生于小肠上段1／3处。
卵囊呈卵圆形或椭圆形，平均大小为21.3μｍ×17.1μｍ，形状指数为1.24，囊壁光滑，呈淡黄绿色，原生质无色，无卵膜孔和残体，具极粒。
孢子囊无残体。
（图17-6）。
4. 鸭球虫。
鸭球虫常见于北京鸭群中，对北京鸭具有致病力的球虫有两种。
（图17-7）。
（1）毁灭泰泽球虫（Tyzzeria perniciosa ）。
寄生于小肠前段，致病力强。
卵囊呈短椭圆形，较小，呈淡绿色，，大小为13.2～9.2μｍ×9.9～7.2μｍ，形状指数为1.2。
无孢子囊，8个子孢子呈香蕉状，大小为7.2μｍ×2.7μｍ。
图17-4 巨型艾美耳球虫卵囊 图17-5和缓艾美耳球虫卵囊 图17-6 早熟艾美耳球虫卵囊 图17-7 鸭球虫卵囊 1.毁灭泰泽球虫 2. 菲莱氏温杨球虫（2）菲莱氏温杨球虫（Wenyonella philiplevinei）。
寄生于小肠，致病力弱。
卵囊呈卵圆形，浅淡绿色，外层薄而透明，内层浅蓝，大小为22～13μｍ×12～10μｍ，有卵膜孔，形状指数为1.5。
孢子囊呈瓜子形，大小为7.2μｍ×4.8μｍ，具斯氏体。
（二）卵囊的分离与孢子化1．卵囊的分离。
卵囊存在于宿主粪便和组织中。
分离粪便中的卵囊较多采用饱和食盐(或硫酸镁、蔗糖等)溶液漂浮法和离心法；分离组织中的卵囊一般采用铬硫酸分离法和蛋白酶消化法。
单卵囊分离法是指从混合虫种的卵囊中分离出单个卵囊，以备进一步扩增所需的“克隆”卵囊。
尽管有许多分离卵囊的方法，但其基本原理是一样的，即根据卵囊与杂质比重的不同。
对于组织中的卵囊，尚需借助消化液或酸的作用，破坏组织中的细胞，以利卵囊的提纯。
（1）漂浮法。
可用很多种溶液和很多种方法，其关键是溶液的比重要适当(一般 1.2左右)；再者，溶液对卵囊的活性没有不良影响。
这里介绍几种常用方法：①糖溶液漂浮法。
a. 糖溶液的制备。
称500g糖和6.5g石碳酸(或6～7ml石碳酸溶液)溶于320ml蒸馏水中即可。
此法配制的溶液也常称为Sheather氏糖溶液。
b.卵囊的分离。
(a) 在一容器里将粪便和2倍于粪便体积的自来水(或生理盐水，或食用专用洗剂如0.5%莱喷液等)混成均匀的悬浮液。
(b) 将粪便混悬液经两层粗棉布(或先经50目后经100～200目网筛)滤到第二个容器中，再与等量Sheather氏糖溶液混合，而后将混合液注入离心管中。
(c) 离心(3000rpm，3min)。
(d) 用直径略小于离心管口径的捞网(20～50目)捞取表层浮液,抖落于另一盛水容器中。
水的多少视卵囊的多少而定，卵囊多带进的糖溶液也多，应多加水稀释。
(e) 离心(3000rpm，3min)，沉淀物即为所需卵囊。
②饱和食盐溶液漂浮法。
a.饱和食盐溶液的配制。
在1000m1开水中加食盐380g，充分搅拌，比重约为1.18。
b.卵囊的分离。
(a) 将粪便和5倍于粪便体积的生理盐水搅成混悬液。
(b) 将粪便混悬液经两层粗棉布(或先经50目后经100～200目网筛)滤过到第二个容器中，并将第二个容器中的滤过液倒入离心管中。
(c) 离心(3000rpm，3min)，弃去上清液。
(d) 向沉淀中加入10倍的饱和盐水(先加少许，充分混匀后再加其余的)充分混匀。
(e) 离心(3000rpm，3min)。
(f) 同糖溶液漂浮法，捞取表层浮液，离心取沉淀。
③饱和硫酸镁溶液漂浮法。
a.饱和硫酸镁溶液的配制。
称64.4g硫酸镁于1000m1温水中充分搅拌溶解即成。
b.卵囊的分离。
步骤同前法，只是悬浮液换为饱和硫酸镁溶液而已。
鸭球虫的两个种：菲莱氏温扬球虫和毁灭泰泽球虫的卵囊在饱和食盐水中较易变形，以此法分离为佳。
④铬硫酸分离法。
适用于从肠内容物、肠粘膜组织、肝组织、肾组织及其它组织中分离球虫卵囊。
无菌条件下操作时所制备的卵囊为无菌卵囊。
a.铬硫酸溶液的制备。
先配好20%的重铬酸钠溶液100ml于500ml锥形瓶中，然后在冰浴条件下逐渐加入浓硫酸100m1，边加边充分搅拌。
用玻璃过滤器或离心方法除去其它结晶，即为所需铬硫酸液。
b.卵囊的分离。
(a)将组织或肠内容物放在乳钵中充分研碎，加水充分搅拌后离心(1500 rpm，5min)。
(b)向沉淀物中加入4～5倍铬硫酸溶液，冰浴条件下充分搅拌，然后立即离心(1500 rpm，5min)。
(c)将浮液中的卵囊用吸管吸出，加入20倍以上的冷却水(冰水)，离心(1500rpm，5min)，沉淀物即为卵囊。
(2)蛋白酶消化法。
在分离组织中的卵囊时，常有许多组织碎块或细胞团块混杂于卵囊中或粘附卵囊壁上，致使纯化工作十分棘手。
在捣碎的组织中加入0.5%～1%胰蛋白酶，将 pH 调到8.0，39℃下消化20min；或者加入0.2%胃蛋白酶(蒋建林、蒋金书，1996)，将pH调至2.0，在39℃下消化1h，使卵囊分散游离出来，再依次用200目、300目和400目网筛过滤，滤液经2000rpm，10min离心沉锭，弃掉上清液，在沉淀中加入1 M蔗糖溶液，2000rpm，10min离心，管上层漂浮的白色似“塞子状”的物质即为卵囊。
将其移入装有0.5 M蔗糖溶液小离心管中，2000rpm离心10min沉淀，重复几次充分洗涤除去比重较小的杂质，然后加入5%次氯酸钠，在4℃下作用10min，最后在低浓度(0.5M)的蔗糖溶液中离心洗涤，除去小的杂质和次氯酸钠，即可得纯化的未孢子化卵囊。
(3) 糖溶液梯度离心法。
适用于从少量溶液中分离卵囊。
①糖溶液的制备。
将128g精制白糖溶解于100m1水中，以此作为总量，加入0.5%石碳酸，混匀作为A液。
以A液为基础，再按下述混合比，制成B、C、D液。
B液：3份A液+1份水，充分混合C液：3份B液+1份水，充分混合D液：3份C液+1份水，充分混合②梯度离心管的装备。
用10～50 m1的离心管，从底部开始，轻轻将等量的A、B、C、D液分层次地依次加入管中。
这几种液体不得相互掺混。
③卵囊的分离。
a.将粪便混匀在5倍体积的水中，离心(1000rpm，3min)，弃去上清液。
b.沉淀物加1/2体积的水，混匀后取少量放置在D液的上部，厚度约为1cm。
离心(1 000 rpm，3 min)。
c.用吸管将液层上部的液体吸掉，只将D液层(含卵囊)移入另外的离心管中，用大约 10倍的水稀释后，离心(2000rpm，5min)。