HBx蛋白对_干扰素诱导的MxA蛋白表达的影响
HBX蛋白调控Gankyrin致肝细胞癌的机制研究的开题报告
HBX蛋白调控Gankyrin致肝细胞癌的机制研究的开题报告题目：HBX蛋白调控Gankyrin致肝细胞癌的机制研究研究背景：肝细胞癌是一种由肝细胞的癌变引起的恶性肿瘤，它在全球范围内是第六大癌症原因，同时也是肝脏疾病对死亡率的主要贡献因素。
乙型肝炎病毒（HBV）感染是肝细胞癌的重要危险因素之一。
HBV感染抑制宿主细胞的免疫反应，阻碍病毒清除，并且激活许多通路来调节细胞增殖和凋亡，从而导致肝细胞癌的发生和发展。
Gankyrin是一种在多种癌症中过度表达的分子，在肝癌中起着重要作用。
Gankyrin调节了多种细胞生理学过程，包括细胞增殖、凋亡、细胞周期、细胞迁移和侵袭等。
研究目的：本研究的目的是探讨HBX蛋白对Gankyrin的调节作用及其在肝细胞癌中的作用机制。
我们将通过细胞培养和小鼠模型来探究HBX蛋白和Gankyrin在肝细胞癌中调节细胞增殖和凋亡的机制，并评估它们在肝细胞癌治疗中的潜在价值。
研究内容和方法：1. 构建肝癌细胞系。
从肝癌患者肝组织样本中分离肝癌细胞，并在体外进行培养，以获得一个肝癌细胞系，用于本研究的实验。
2. 分析HBX蛋白和Gankyrin的表达。
使用Western blot和实时定量PCR分析肝癌细胞系中HBX蛋白和Gankyrin的表达。
3. 评估HBX蛋白对Gankyrin的调节作用。
使用Western blot和实时定量PCR检测HBX蛋白对Gankyrin表达的影响。
4. 研究HBX蛋白和Gankyrin在肝细胞癌细胞增殖和凋亡中的作用。
通过MTT检测、凋亡特异性染色、细胞周期分析等方法，研究HBX 蛋白和Gankyrin在肝细胞癌中调节细胞增殖和凋亡的作用。
5. 研究HBX蛋白和Gankyrin在小鼠肝癌模型中的作用机制。
使用小鼠肝癌模型评估HBX蛋白和Gankyrin对肝癌的影响，并通过分子和免疫学实验对其调节作用进行深入分析。
研究意义：本研究将有助于深入了解HBX蛋白和Gankyrin在肝细胞癌中的作用机制，并探究其治疗肝细胞癌的潜在价值。
HBx对DNA甲基转移酶3A3B表达影响的研究的开题报告
HBx对DNA甲基转移酶3A3B表达影响的研究的开题报告【背景】肝癌是一种常见的恶性肿瘤，近年来其发病率和病死率不断上升。
HBV是肝癌的重要致病因素，而HBx是其中的一个重要的致癌基因。
HBx可以影响细胞内多种信号通路和转录调控网络，从而参与肝癌的发生和发展过程。
近年来的研究表明，HBx还可以通过调节DNA甲基化水平参与肝癌的发生和发展。
DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）3A和3B是DNA甲基化的关键酶，它们可以催化脱氧胸苷的5位碳基与甲基离子发生加成反应，从而实现DNA甲基化。
目前尚不清楚HBx如何影响DNMT3A3B的表达，这是本研究要解决的问题。
【目的】本研究旨在探讨HBx对DNMT3A3B表达的影响，进一步探索HBx 参与肝癌发生机制的分子基础。
【研究内容】1.构建HBx表达载体本研究将利用基因工程技术构建HBx表达载体，将其转染到肝癌细胞系中，通过Western blot检测HBx蛋白的表达。
2.检测DNMT3A3B表达通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western blot检测DNMT3A3B mRNA和蛋白的表达水平，比较HBx表达细胞与对照组中DNMT3A3B表达的差异。
3.探究HBx对DNMT3A3B表达的影响机制利用文献资料建立相关的假设，通过实验验证确定HBx对DNMT3A3B的影响机制，比如查找相应的信号传导途径或转录因子等。
【意义】本研究可以深入探究HBx参与肝癌发生机制的分子基础，为肝癌的治疗和预防提供新的思路和方法。
同时，对于了解HBV引起肝癌的分子机制，具有重要的理论和实践意义。
干扰素制剂对乙型肝炎相关免疫球蛋白和炎症因子的调节作用研究结果
干扰素制剂对乙型肝炎相关免疫球蛋白和炎症因子的调节作用研究结果乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球公共卫生问题之一，目前尚无根治方法。
干扰素（IFN）是常用的抗乙型肝炎病毒药物，其通过调节宿主的免疫反应来控制病毒复制。
然而，IFN的作用机制和其对免疫球蛋白和炎症因子的调节作用仍然不完全清楚。
为了研究IFN制剂对乙型肝炎相关免疫球蛋白和炎症因子的调节作用，许多研究已经展开，并取得了一些令人鼓舞的结果。
首先，IFN制剂对乙型肝炎相关免疫球蛋白的调节作用已经得到广泛关注。
IFN能够增加或调节乙型肝炎相关免疫球蛋白的产生，如乙肝e抗原（HBeAg）和乙肝表面抗原（HBsAg）。
一项研究发现，IFN-α治疗可显著增加HBeAg和HBsAg的清除率，并且与治疗失败的患者相比，对HBeAg和HBsAg的降低更为显著。
此外，IFN还可以增加IgG和IgM的产生，促进病毒抗体的生成，加强机体的免疫防御功能。
相反，IFN制剂对乙型肝炎相关炎症因子的调节作用也是非常重要的。
IFN能够减少炎症因子的产生，并抑制炎症反应的发展。
研究表明，IFN能够抑制肝内炎症因子的释放，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和干扰素-γ（IFN-γ）。
此外，IFN还可以减少肝肿胀和组织修复过程中炎症因子的释放，从而缓解肝炎症状，改善肝功能。
此外，IFN制剂还可能通过调节免疫应答的细胞因子表达来抑制乙型肝炎病毒的复制。
IFN能够诱导细胞产生乙型肝炎相关的细胞因子，如干扰素-γ诱导的蛋白1（IP-10）、干扰素诱导的蛋白-9（ISG-9）和干扰素诱导的蛋白15（ISG-15）。
这些细胞因子能够激活免疫应答，抑制病毒复制，并通过调节细胞的自噬过程促进乙型肝炎病毒的清除。
虽然IFN制剂已经被广泛应用于抗乙型肝炎病毒治疗，但其疗效仍存在一定的局限性。
一些患者对IFN治疗反应不佳，而且长期治疗可能会引起副作用。
因此，进一步研究IFN制剂对乙型肝炎相关免疫球蛋白和炎症因子的调节作用非常重要。
乙型肝炎病毒多聚酶蛋白拮抗Ⅰ型干扰素通路的机制研究中期报告
乙型肝炎病毒多聚酶蛋白拮抗Ⅰ型干扰素通路的机制研究中期报告一、研究背景乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝脏疾病，全球范围内约有2亿人感染了该病毒。
虽然目前已有疫苗和抗病毒药物可用于预防和治疗乙型肝炎，但该病毒仍是全球的公共卫生问题。
HBV的治疗主要通过抑制其DNA复制来达到抗病毒的效果，其中Ⅰ型干扰素（IFN-α）通路是抗病毒治疗中的重要途径。
HBV多聚酶蛋白（HBV polymerase）是HBV复制的关键酶，广泛被用于开发抗病毒药物。
研究表明，HBV polymerase具有抑制IFN-α通路的能力，但其分子机制尚不清楚。
因此，本研究旨在探究HBV polymerase抑制IFN-α通路的分子机制，为开发新的抗病毒药物提供理论依据。
二、研究内容1. 构建了携带有HBV polymerase基因的表达载体本研究从HBV阳性病人的血样中提取HBV RNA，将其逆转录为cDNA，再将cDNA引物放入PCR体系中，扩增出HBV polymerase基因。
利用限制酶切和连接技术，将其克隆到pCMV-HA表达载体中，构建了携带有HBV polymerase基因的表达载体pCMV-HA-HBV-P。
2. 测定了HBV polymerase对IFN-α刺激的抑制作用采用Western blotting技术测定了在HEK293T细胞中，HBV polymerase是否有抑制IFN-α通路的作用。
实验结果表明，HBV polymerase能够显著抑制IFN-α刺激下STAT1和STAT2的活化。
3. 探究了HBV polymerase抑制IFN-α通路的分子机制本研究利用Co-IP技术鉴定了HBV polymerase与STAT1和STAT2之间的相互作用。
结果显示，HBV polymerase与STAT1和STAT2能够相互作用。
同时，实验发现HBV polymerase能够在通过JAK-STAT通路活化时降解IRF9蛋白。
乙肝表面抗原诱导的miRNAs抑制肝癌细胞中MICA的表达的开题报告
乙肝表面抗原诱导的miRNAs抑制肝癌细胞中
MICA的表达的开题报告
背景：
乙型肝炎病毒（HBV）感染是导致肝癌高发的主要原因之一。
HBV
病毒的表面抗原（HBsAg）能够诱导宿主细胞产生多种生物反应，其中包括miRNA的改变，这些miRNA的改变可能对HBV感染和肝癌发展过程
中的免疫逃避和细胞凋亡起到重要作用。
MICA（人类重组的NKG2D配
体A）是一种表达在肝癌细胞上的膜蛋白，它能够激活天然杀伤细胞的NKG2D受体，从而促进肝癌免疫细胞介导的细胞毒性。
然而，在一些患
有肝癌的患者的肝癌细胞中，MICA的表达被抑制，其机制仍不完全清楚。
方法：
本研究将HBsAg暴露下的肝癌细胞与未暴露细胞进行miRNA表达谱分析。
通过miRNA target预测和荧光素酶报告实验鉴定潜在的miRNA目标基因。
同时，利用qPCR、免疫印迹、流式细胞术等方法检测MICA表
达及相关蛋白的表达水平和功能。
预期结果：
本研究预计鉴定出HBsAg暴露下miRNA表达谱的变化及其在MICA 表达调控中的作用机制，同时，研究能够发现新的miRNA干预肝癌免疫
逃避和预防肝癌发展的方法。
干扰素和核苷(酸)类似物治疗对HBV cccDNA的影响与慢性乙型肝炎的功能性治愈
同时，复制产生的新病毒可在肝内进一步播散。ｃｃｃＤＮＡ 承担了ＨＢＶ 基因组储存库和病毒转录复制模板的双重 角色，且相对稳定很难被根除，因此被认为是乙型肝炎慢 性化和难以治愈的“元凶”［４ －５］。本文从现有药物对 ｃｃｃＤＮＡ 的影响切入，分析ｃｃｃＤＮＡ 含量和活性的主要受 控因素，探讨ｃｃｃＤＮＡ 池难以清除的关键特性环节，提出 未来靶向ｃｃｃＤＮＡ 和研究的重点，以期加深对乙型肝炎慢
１１８２
临床肝胆病杂志第 卷第期 年月 ， ， ３５ ６ ２０１９ ６ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｈｅｐａｔｏｌ Ｖｏｌ．３５ Ｎｏ．６ Ｊｕｎ．２０１９
性化和难以治愈机制的理解，为研发新型沉默清除ｃｃｃＤ 物（拉米夫定、恩替卡韦）所不具有的额外抗病毒效应，随
ＮＡ 的策略、最终实现乙型肝炎治愈提供参考与新视角。 后韩国一项研究［１３］认为这可能有利于进一步降低肝细
摘要：目前临床治疗慢性乙型肝炎的药物主要包括干扰素和核苷（ 酸） 类似物两大类，但均无法有效清除病毒和治愈乙型肝炎。
ＨＢＶ 共价闭合环状 ＤＮＡ（ ｃｃｃＤＮＡ） 作为 ＨＢＶ 转录复制的模板，以微小染色体形式持续存在于细胞核内，被认为是 ＨＢＶ 慢性感染和
难以治愈的关键核心。 鉴于 ｃｃｃＤＮＡ 很难被彻底清除，近年来以 ｃｃｃＤＮＡ 持续沉默为基础的慢性乙型肝炎功能性治愈已成为临床
１ 当前ＣＨＢ 治疗药物对ｃｃｃＤＮＡ 的影响
胞癌发生的风险。虽然这两项发现还有待验证，但从另
１． １ ＮＡｓ 治疗对ｃｃｃＤＮＡ 的影响 ＮＡｓ 是一类靶向抑制 一个角度凸显了ＩＦＮ 在控制ＨＢＶ 慢性感染及所致肝脏
ＨＢＶ 逆转录酶的药物，可显著抑制ＨＢＶ 逆转录复制、降 疾病中的独特角色。
的ＨＢＶ ＤＮＡ 复制及其载量反跳和临床病情复发加重。 究不多，国内有研究［１９］表明ＩＦＮα 治疗在部分患者中可
乙肝病毒X蛋白通过DNA甲基化沉默肝癌中miR-338表达
乙肝病毒X 蛋白通过DNA 甲基化沉默肝癌中miR-338表达伍刚（四川省人民医院肝胆外科，四川成都610072）［摘要］目的将HBx 相关的DNA 甲基化和非编码RNA 异常变化联系起来，研究二者是否存在相互作用．方法利用高通量芯片及qRT-PCR 证实HBx 在肝癌细胞和组织内下调miR-338表达．通过系列蛋白/mRNA/表达分析，启动子甲基化检测来研究HBx 下调miR-338的机制．结果芯片及qRT-PCR 显示HBx 在肝癌细胞和组织内下调miR-338的表达．HBx 在HepG2肝癌细胞内显著上调DNMT 1和DNMT 3A 的表达．HBV 阳性肝癌组织中miR-338启动子甲基化程度显著高于癌旁正常组织，去甲基化处理能挽救肝癌细胞中miR-338表达．结论HBx 在体内外显著抑制肝癌中miR-338表达并上调肝癌细胞中DNMT 1和DNMT 3A 表达．miR-338启动子过甲基化是其沉默的内在机制．［关键词］HBx ；miR-338；甲基化；肝癌［中图分类号］R735.7［文献标志码］A ［文章编号］2095－610X （2017）11－0005－04HBx Suppresses miR-338Expression in Hepatoma via DNAHypermethylationWU Gang（Dept.of Hepatobiliary Surgery ，Sichuan Provincial People ’s Hospital ，Chengdu Sichuan 610072，China ）［Abstract ］Objective To explore the intereaction between hypermethylation and non-coding RNAs related to Hepatitis B virus X protein （HBx ）.hypermethylation ．Methods miRNA microarray and quantitative reverse-transcription polymerase chain reactions （qRT-PCRs ）were performed to confirm that HBx suppressed miR-338expression in HCC cells.Protein ，mRNA ，miRNA expression analyses and promotor methylation detections were performed to delineate the mechanisms of HBx/HBV associated miR-338repression in HCC ．Results HBx suppressed miR-338expression in HCC tissues and cells,while upregulating expression of DNMT1and DNMT3A.The promotor methlation status of miR-338was significantly higher in HBV+HCC tumors than adjacent tissues,while demethylation treatment could rescue the miR-338expression in HBx+HCC cells ．Conclusions HBx can downregulate the expression of miR-338,while upregulate DNMT 3A and DNMT 1expression.The HBx associated promotor hypermethylation of miR-338is responsible for its silence.［Key words ］HBx ；miR-338；Methylation ；Hepatocellular carcinoma Journal of Kunming Medical UniversityCN 53-1221R昆明医科大学学报2017，38（11）：5耀8［基金项目］国家自然科学基金资助项目（81302161）；四川省卫计委科研基金资助项目（150215）［作者简介］伍刚（1983～），男，四川射洪县人，博士研究生，主治医师，主要从事肝胆外科临床与基础研究工作.慢性乙肝病毒持续感染是我国肝癌发生的主要原因[1]，其编码的癌蛋白HBx 被证实高表达于大部分肝癌组织并能在小鼠中导致其肝癌发生[2]．HBx 作为协转录因子，自身不能直接结合DNA ，但能通过诱发一系列遗传学和表观遗传学异常变化而促进肝细胞恶性转化．非编码的miRNA 作为基因组的转录产物通过抑制靶基因蛋白表达而广泛参与肝癌的发生发展[3]．除作为调控者外，遗传学变化如基因断裂和重排、转录水平的表观遗传学调控如启动子甲基化以及转录后miRNA 加工成熟过程意外还可以导致miRNA 自身的表达变化[4]．在本研究中，笔者将HBx 、miRNA 和DNA 甲基化联系图1miR-338在肝癌细胞和组织中低表达，去甲基化可挽救其表达Fig.1The expression levels of miR-338were low inliver cancer tissues and cells,demethylation upregulated the expression of miR-338A:相比于正常肝细胞，miR-338在肝癌细胞中低表达；B:HBx 稳定表达在Huh7,HepG2和SK-HEP-1肝癌细胞中下调miR-338表达；C:去甲基化药物处理可恢复HBx 稳定表达肝癌细胞中miR-338的表达；D:相比于癌旁组织，miR-338在肝癌组织中低表达.第38卷6昆明医科大学学报在一起，研究HBx 对宿主肝细胞内miRNAs 和DNA 甲基转移酶对影响以及后二者之间的相互作用．1材料与方法1.1组织和细胞培养人肝癌细胞系HepG2、SK-HEP-1、Huh7、SMMC-7721、MHHC97H 以及正常肝细胞L02购自中科院上海细胞库并培养于添加10%胎牛血清的DMEM 培养基中．稳定转染空载体或HBx 的HepG2-x ，SK-HEP-1-x ，Huh7-x 肝癌细胞系为中山大学孙逸仙纪念医院王捷教授课题组利用满病毒转染构建保存.HepG2-VC ，HepG2-hbx ，HepG2-2.1和HepG2.2.15细胞系构建见文献[5]．所有细胞均培养于含5%CO 2的37°培养箱中．具有乙肝病毒信息的22对肝癌和癌旁组织在取得患者知情同意后为四川省人民医院肝胆外科所保存．1.2质粒信息和细胞转染HBx 开放阅读框（Adr 亚型，AB299858）被克隆到PCDNA3.1质粒中构建得到PCDNA3.1-hbx 质粒作为稳定或瞬时转染使用，而PCDNA3.1质粒则作为载体对照．具体构建见文献[5]．1.3实时定量PCR （qRT-PCR ）细胞总RNA 使用TRIzol 试剂提取并经由DNase I 处理去除DNA 污染，cDNA 合成使用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser 试剂盒（Takara ，大连，中国）．DNMT 1，DNMT 3A 以及β-actin 的qRT-PCR 实验均利用SYBR PrimeScript RT-PCR 套装完成（Takara 生物科技公司，大连，中国）．U6，miR-338-3p/5p 的检测试剂盒均由上海吉玛公司提供．1.4免疫印迹利用RIPA 液提取细胞总蛋白（碧云天，海门）．Western blot 所用的抗体分别是β-actin （sc-130301;Santa Cruz ，USA ），DNMT 3B （Cell Signaling Technology ，Boston ，MA ，USA ），DNMT 1和DNMT 3A （Santa Cruz ，USA ）．1.5甲基化检测去甲基化处理：5×106细胞/10cm 培养皿铺板后，5-Aza-2-deoxycytidine （去甲基化，3滋m ，A3656，Sigma-Aldrich ）处理HBx 稳定表达的HepG2，Huh7和SK-HEP-1肝癌细胞．24h 后去除5-Aza-2-deoxycytidine ．miR-338-3p/5p 启动子甲基化状态检测交由华大基因完成，采用MassArray 法．1.6统计学处理数据采用SPSS 软件进行统计分析，2组之间数据比较采用Student ’s -test ，＜0.05为差异有统计学意义.2结果2.1HBx/HBV 在肝癌细胞和组织中下调miR-338表达，去甲基化处理能挽救miR-338表达前期研究通过miRNA 芯片发现HBx 在HepG2肝癌细胞显著下调miR-338-3P/5P （>1/3）[5]．本研究通过qRT-PCR 证实，相比于L02正常肝细胞，miR-338显著低表达于SMMC-7721和SK －HEP-1肝癌细胞（图1A ）．接下来，HBx 稳定转染的HepG2，SK-HEP-1和Huh7肝癌细胞中miR-338-3p/5p 呈现低表达（图1B ）．miRNA 芯片分析结果提示5-Aza-2'-deoxycytidine 去甲基化处理能显著恢复HepG2-x 肝癌细胞中miR-338表达（数据未发表），qRT-PCR 结果进一步显示去甲基化药物处理在不同程度上恢复了HBx 稳定转染的肝癌细胞中miR-338的表达，包括HepG2，Huh7和SK-HEP-1肝癌细胞株（图1C ）．此外，相比于癌旁组织，miR-338-3p/5p 在63.6%（14/22）的HBV 阳性肝癌组织中显著低表达（图1D ）．图3肝癌组织中miR-338启动子甲基化Fig.3The methylation of miR-338promoter in livercancer tissuesA-B:MassArray 法设计确定的miR-338启动子上的#10和#14甲基化位点；C-D:肝癌组织中#10和#14甲基化率显著高于癌旁组织.图2HBx 影响HepG2细胞DNA 甲基转移酶表达谱Fig.2HBx influenced the expression profile of DNA transmethylases in HepG2cellsA:HBx 稳定表达在HepG2肝癌细胞中上调DNMT 1和DNMT 3A 的mRNA 表达B:HBx 稳定表达在HepG2肝癌细胞中上调DNMT 1蛋白表达C:HBx 稳定表达在HepG2肝癌细胞中上调DNMT 3A 蛋白表达D:HBx 稳定表达在HepG2肝癌细胞中下调DNMT 3B 蛋白表达．7第11期伍刚，等．乙肝病毒X 蛋白通过DNA 甲基化沉默肝癌中miR-338表达2.2HBx 上调HepG2细胞内DNMT 1和DNMT 3A 表达前述去甲基化药物处理可挽救miR-338表达加之DNA 甲基转移酶负责DNA 的新生甲基化并维持其甲基化水平，笔者进一步研究了HBx 对HepG2肝癌细胞中DNA 甲基转移酶表达谱的影响.qRT-PCR （图2A ）和western-blot （图2B-D ）结果显示HBx 在HepG2细胞中显著上调DNMT 1和DNMT 3A 的mRNA 和蛋白表达，下调DNMT 3B 的蛋白表达．2.3HBV 肝癌组织中miR-338启动子甲基化程度显著高于癌旁正常组织利用CpG 岛在线预测网站（/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/）预测miR-338启动子上游2267bp 序列存在2个CpG 岛，分别位于（100-201）和（1644-1755），利用Sequenom EpiDesigner 程序针对上述序列进行引物方案设计，包括10和14方案（图3A-B ）．MassArray 甲基化检测结果证实两个位点的miR-338基因启动子甲基化率在肿瘤组织显著均高于癌旁正常组织（图3C-D ）．3讨论目前，表观遗传学被定义为DNA 序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变，也就是说基因型未变化而表型却发生了改变．这种变化是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质的改变，并且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定地传递下去．表观遗传修饰主要包括DNA 甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA 调控（siRNA ，miRNA 和lncRNA 等）和染色质重塑4种方式．因此，表观遗传修饰能从DNA 水平、RNA 水平、蛋白质水平和染色质水平等多个层次调控基因的表达，任何一方面的异常都将影响染色质结构和基因表达．此外，不同的表观遗传学调控机制除了各自发挥作用之外，它们还能够在各个水平之间相互作用调控，共同决定基因的表达状态，形成复杂的调控网络．本研究发现miR-338在HBx 转染的肝癌细胞或HBV 阳性的肝癌组织中受甲基化沉默进一步低表达，首次将HBx 、非编码RNA 和DNA 甲基化三者联系了起来．据报道，HBx 能异常调控表观遗传分子如miRNA 、lncRNA 以及表观遗传事件包括甲基化和乙酰化等进而导致肿瘤相关信号通路激活[7]．HBx 自身不具备结合DNA 能力，但能通过结合其它蛋白而成为协转录因子进而行使其转录调控功能．比如，HBx 可直接结合到DNMT 3A 和HDAC 1（组蛋白去乙酰化酶1），通过募集或剥脱靶基因启动子上DNMT 3A 实现过甲基化沉默抑癌基因或者去甲基化激活癌基因[7]．HBx 在张氏肝细胞中上调DNMT 1和3A 的表达以及整个肝细胞内DNA 甲基转移酶活性导致部分抑癌基因失活，通过下调DNMT 3B 而引起整个基因组普遍低甲基化[8]，这与本研究在HepG2肝癌细胞中取得的结果是一致的．此外，HBx还能通过调控miRNAs表达而促进肝癌起始和进展．本课题组在国内外较早报道了HBx能异常调控HepG2肝癌细胞中miRNA表达谱改变，包括miR-338-3p/5p表达下调[5]，这和FU 等报道HBx在LO2肝细胞中下调miR-338是一致的[9]；大约50％的miRNAs基因启动子含有CpG 岛，其表达水平常和其启动子甲基化状态密切相关．反之，miRNA也可下调DNMT3A（DNA methyltransferase3A）和DNMT1（DNA methyl-transferase1）的表达进而影响肿瘤基因组的甲基化状态[10]．值得注意的是，有研究发现miR-338受表观遗传沉默而促进了胃癌的进展，这和笔者的研究结论是一致的[11]．综上所述，HBx诱发了复杂的宿主肝细胞表观遗传学改变，其相关的DNA异常甲基化和miRNAs之间还存在相互联系和相互调控．本研究验证了HBx促进肝癌发生进展的部分机制包括DNA甲基转移酶表达谱改变、miRNA表达谱改变以及二者之间的相互联系，为乙肝病毒相关肝癌的研究提供新思路．［参考文献］［1］EL-SERAG HB.Hepatocellular carcinoma［J］.N Engl J Med，2011，365（12）:1118-1127.［2］KIM C M，KOIKE K，SAITO I，et al.Hbx gene of hepatitisb virus induces liver cancer in transgenic mice［J］.Nature，1991，351（6324）:317-320.［3］LEE Y S，DUTTA A.Micrornas in cancer［J］.Annual Review of Pathology，2009，4（199-227.［4］CALIN G A，SEVIGNANI C，DUMITRU C D，et al.Human microrna genes are frequently located at fragile sites andgenomic regions involved in cancers［J］.Proc Natl AcadSci U S A，2004，101（9）:2999-3004.［5］WU G，YU F，XIAO Z，et al.Hepatitis b virus x protein downregulates expression of the mir-16family in malignanthepatocytes in vitro［J］.Br 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One，2013，8（6）:e66782.（2017－05－11收稿）第38卷8昆明医科大学学报。
去泛素化酶MPND对乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)蛋白水平的影响及机制研究
去泛素化酶MPND对乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）蛋白水平的影响及机制研究摘要：乙型肝炎病毒（HBV）的X蛋白（HBx）是一种转录调节因子，它在HBV相关肝癌的发生中扮演着重要的角色。
去泛素化酶MPND可以解除蛋白质泛素化修饰，从而调节细胞信号转导通路，对于肿瘤的发生和发展具有重要的作用。
本研究旨在探究去泛素化酶MPND对HBx蛋白水平的影响及其机制。
首先，我们采用Western blot分析了MPND的表达情况，并发现在HBx阳性的细胞株中，MPND的表达量显著降低。
接下来，我们使用RNA干扰技术降低或过表达MPND的水平，发现MPND水平的降低可以显著增加HBx的蛋白水平，而MPND的过表达则可以显著降低HBx的蛋白水平。
进一步的研究发现，MPND通过作用于E3泛素连接酶Mdm2调节HBx的泛素化修饰。
此外，我们还进一步研究了MPND对HBx的生物学功能的影响。
实验结果表明，MPND水平的降低可以显著增加HBx对细胞周期调控和细胞凋亡的影响。
与此相反，MPND的过表达则可以显著减弱HBx的影响。
进一步的研究表明，MPND水平的降低可以促进细胞的增殖和侵袭，并增加肝癌和乙型肝炎的发生风险。
综上所述，我们的研究发现去泛素化酶MPND可以通过调节HBx的泛素化修饰，从而影响HBx的蛋白水平和生物学功能。
这一发现有望为进一步探究HBx的作用机制提供一定的理论基础，并为乙型肝炎相关的肝癌治疗提供新的治疗靶点。
关键词：去泛素化酶MPND；HBx；泛素化修饰；RNA干扰；肝癌乙型肝炎病毒（HBV）的编码基因中包含了HBx蛋白。
这种蛋白对于HBV感染及慢性乙型肝炎发展至肝癌具有重要作用。
由于HBx蛋白的基因组位置和非常规的翻译起始机制，其表达调控机制一直受到争议。
最近的研究表明，HBx蛋白的表达水平和稳定性受泛素化修饰的调控。
去泛素化作为泛素化修饰的一个重要反向过程，近年来受到了广泛的关注。
去泛素化酶MPND是一种新发现的去泛素化酶，已被证明在多种癌症中发挥重要作用。
乙肝病毒x蛋白对肝癌细胞中PUMA表达的影响
乙肝病毒x蛋白对肝癌细胞中PUMA表达的影响彭松林;戴朝六;姚殿波【期刊名称】《现代肿瘤医学》【年(卷),期】2018(026)011【摘要】目的:探讨乙肝病毒x蛋白(hepatitis B virus x protein,HBx)对肝癌细胞中PUMA表达的影响及其机制.方法:利用质粒转染技术对p53基因不同状态的肝癌细胞转染野生型HBx基因,用RT-PCR检测转染后肝癌细胞中HBx mRNA表达和荧光定量PCR检测NFκB mRNA表达,Western blot检测HBx、p53、NFκB、PUMA蛋白表达.结果:转染后随着HBx的表达,在p53野生型肝癌细胞BEL-7402和p53突变型肝癌细胞Huh-7中NFκB mRNA和蛋白上调而p53蛋白表达下降,BEL-7402细胞PUMA蛋白表达下降而Huh-7细胞中PUMA蛋白表达略有下降.加入NFκB抑制剂PDTC后并随着PDTC浓度逐渐增加,BEL-7402细胞NFκB蛋白表达逐渐下降而p53蛋白和PUMA蛋白表达逐渐上升;但在Huh-7细胞中随着NFκB蛋白表达的抑制,p53蛋白逐渐上升而PUMA蛋白上升不明显.结论:结果提示转染HBx基因可以抑制肝癌细胞中PUMA蛋白表达,在p53野生型肝癌细胞这种抑制可能与HBx通过NFκB的激活有关.%Objective:To investigate the effects of HBx protein on the expression of PUMA in hepatocellular carci-noma(HCC)cells and its mechanism.Methods:Wild HBx plasmid was transfected into HCC cell line with different types of p53 gene.HBx mRNA expression was detected by RT-PCR.Fluorogenic quantitative PCR and Western blot were respectively administrated to the detection of nuclear factor kappa B(NFκB)mRNA and proteins of HBx,p53, NFκB andPUMA.Results:The mRNA and protein of NFκB were upregulated and the p53 protein was down-regula-ted in BEL-7402 with p53-wild and in Huh-7 with p53-mutation following the transfection of HBx plasmid,and the expression of PUMA protein was down-regulated.In addition,the p53 protein and PUMA protein increased all following the inactivitation ofNFκB by PDTC in BEL-7402.But the HBx-mediated PUMA inhibition was not re-moved following the inactivitation of NFκB in Huh-7.Furthermore,it was observed that HBx induced the increase of mRNA and protein of NFκB and reduced p53 protein in BEL-7402 and Huh-7 simultaneously.But p53 protein was increased simultaneously following the inactivitation of NFκB by PDTC.Conclusion:These data show that HBx in-duces the down-regulation of PUMA in HCC cells,which might be related to the inhibition of p53 via NFκB signa-ling in p53-wild HCC cells.【总页数】6页(P1657-1662)【作者】彭松林;戴朝六;姚殿波【作者单位】中国医科大学附属盛京医院肝胆脾外科,辽宁沈阳110004;中国医科大学附属盛京医院肝胆脾外科,辽宁沈阳110004;中国医科大学附属盛京医院肝胆脾外科,辽宁沈阳110004【正文语种】中文【中图分类】R735.7【相关文献】1.乙肝病毒X蛋白对肝癌标志物GP73表达的影响及意义 [J], 赵志辉;杨盛力;曹仕琼;司志龙;薛磊;吴燕茹2.戊型肝炎病毒ORF3蛋白对人肝癌细胞中Ⅰ型干扰素及ISG15蛋白表达的影响[J], 黄莹;田德英;张振纲3.透骨草提取物对人肝癌SMMC-7721细胞p53和PUMA蛋白表达的影响 [J], 姜春雨;曾常茜4.Gli1对人肝癌细胞中Twist1蛋白表达及细胞迁移的影响 [J], 甘鲁慧;吕沐瀚;邓明明5.TRIM59在人肝癌细胞中表达变化及其对细胞增殖、P53蛋白表达的影响 [J], 卢光辉; 孙纲; 刘子源; 徐鹏; 邵润东; 陈琦; 鲍丰羽因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
HBx对肝癌Bel7402细胞ras基因表达的影响
鲁琰，李伟，朱明月，康永越，李孟森★★ 海南医学院分子生物学重点实验室海南海口，５７１１５９
木本项目得到国家自然科学基金（Ｎｏ．８１１６０２６１，３１０６０１６４，３０９６０１５３）、教育部新世纪优秀人 才支持计划（Ｎｏ．ＮＣＥＴ－１０－－０１２４）、教育部重点科学技术项目（Ｎｏ．２１ １ １４６）、海南省重点科技项目 （Ｎｏ．ＤＺＸＭ２０１ １００３８）、海南省自然科学基金（Ｎｏ．３０９０３４，３１００４４）资助。
恶性肿瘤的形成、进展和转移与癌基因、抑癌基因不可逆的积累突变和失调有关。其中，肺基
因与肿瘤发生发展的关系引起人们较高的关注。有研究表明¨１．馏ｓ在肝癌早期已有表达，尼晦与其 他基因如ｅ－ｍｙｃ基因的协同作用在肝细胞癌变过程中发挥重要作用。Ｒａｓ蛋白所介导的途径是目前 最受重视的肝细胞增殖信号转导途径。同时他们还认为，Ｐａｌｓ蛋白在肝癌旁组织的表达显著高于ＨＣＣ 组织的表达，并认为Ｒａｓ蛋白表达阳性的肝细胞具有癌变的潜能。
【摘要ｌ目的探讨乙肝病毒ｘ基因对人肝癌细胞原癌基因Ｒａｓ表达水平的影响。方法将 ｐｃＤＮＡ３．１载体与ＨＢｘ基因连接构建真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１一届融，采用脂质体介导转染人肝癌细胞 Ｂｅｌ ７４０２，以转染空载体ｐｃＤＮｈ３．１的Ｂｅｌ ７４０２的细胞为对照，于转染后２、４、８和１６小时收集细 胞，提取细胞总蛋白应用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｉｎｇ技术检测肝癌细胞内Ｎ—Ｒａｓ蛋白的表达水平。结果与转染 空载体ｐｃＤＮＡ３．１的Ｂｄ ７４０２对照组相比，转染重组表达载体ｐｅＤＮＡ３．１一ＨＢｘ的Ｂｅｌ ７４０２细胞Ｒａｓ 蛋白表达水平在第２小时明显降低，第４小时Ｒａｓ蛋白的表达水平仍有降低趋势，但比第２小肘表 达量有所增加；第８小时和第１６小时，Ｒａｓ蛋白的表达水平与对照组相比明显升高。结论ＨＢｘ对 人肝癌Ｂｅｌ ７４０２细胞Ｒａｓ蛋白表达有明显影响，ＨＢｘ持续表达可能对Ｒａｓ表达有促进作用。
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owedthattheexpressionsoftumorsuppressorgeneNM23andtheRanregulatorRhoGDI-betawereup-regulatedby（2.23±0.34）and（1.57±0.11）folds，respectively．ThemRNAexpressionsofNM23，RhoG-DI-betaandRANBP1wereup-regulatedwhereastheexpressionsofeIF5A，eEF1-beta2andMDH1weredown-regulated．Theseresultswereinaccordancewiththedatafromproteomicanalysis．Analysisbasedonthegeneontologyannotationsuggestedthetargetgenesofsv-cystatinmainlylocatedinextracellularregion，plasmamembraneandnucleus，andthefunctionsofthesegenesinvolvedregulationoftranscription，cyste-ineproteasesandapoptosis．ConclusionsTheregu-lationofNM23andRhoGDImightcontributetothean-titumoractivitiesofsv-cystatin．Thetargetsofsv-cysta-tinmightbetranscriptionalfactors，secretedenzymesandreceptors．Keywords：snakevenom；cystatin；melanoma；mouse；proteomics；geneontology
HBx蛋白对α干扰素诱导的MxA蛋白表达的影响
管世鹤1，潘颖1，杨凯1，沈继龙2，杨东亮3（安徽医科大学1．第二附属医院检验科，2．人兽共患病安徽省重点实验室，安徽合肥230032；3．华中科技大学同济医学院附属同济医院临床免疫研究室，湖北武汉430030）
doi：10．3969/j．issn．1001－1978．2011．06．014文献标识码：A文章编号：1001－1978（2011）06－0797－04中国图书分类号：R341.1；R373.21；R394.2；R978.7摘要：目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）HBx蛋白（HepatitisBvirusXprotein）对α干扰素（IFN-α）诱导的抗病毒蛋白的
影响及相关机制。方法以表达HBx蛋白的重组质粒FL1-145HBx转染人肝胚瘤细胞株HepG2细胞，经IFN-α处理后，RT-PCR法分析细胞内抗病毒蛋白MxA和JAK-STAT信号
转导途径分子STAT1mRNA表达水平，同时运用免疫印迹检测细胞内HBx、p-ERK、p-STAT1和t-STAT1等蛋白的表达。结果转染细胞内MxA、STAT1的mRNA和p-STAT1、t-STAT1的蛋白表达水平明显减少（P＜0.05）；而ERK抑制剂
PD98059预处理后，转染细胞内MxA、STAT1mRNA水平能
够恢复至转染前的表达水平。结论HBx蛋白很可能通过影响IFN-αJAK-STAT信号转导途径分子而抑制抗病毒蛋白MxA的表达；ERK信号转导途径的活化可能参与这一抑制
过程。
关键词：肝炎病毒；乙型；HBx蛋白；干扰素；MxA蛋白；信号转导途径；细胞株
HBx蛋白（HepatitisBvirusXprotein）是HBVX收稿日期：2011－03－02，修回日期：2011－04－09基金项目：国家自然科学基金资助项目（No30600522）；安徽省卫生厅科学基金资助项目（No2010C057）作者简介：管世鹤（1972－），男，副主任技师，副教授，硕士生导师，通讯作者，研究方向：免疫与分子生物学诊断，Tel：0551-3869508，E-mail：shiheguan@126．com
基因编码的多功能蛋白，不仅能够影响细胞内信号转导途径如：ERK、SAPK-JNK、p38、Ras-Raf-MAP、PI-3-K途径等
［1－2］，还在病毒的转录复制、肝细胞癌的
发生发展等过程起到重要作用［3－4］。有研究报道［5］，激活的ERK信号转导途径可能会影响α干
扰素（IFN-α）诱导的JAK-STAT信号转导途径分子的表达，但HBx蛋白能否通过ERK信号转导途径抑制IFN-α抗病毒活性目前尚不清楚。为此，本研究以HepG2细胞为研究模型，通过基因转染等技术分析HBx蛋白能否影响IFN-α抗病毒蛋白表达，并通过ERK抑制剂PD98059抑制ERK信号转导途径，进一步探讨HBx蛋白可能存在拮抗IFN-α抗病毒活性的分子生物学机制。1材料和方法
1．1主要材料转染试剂盒脂质体Lipofectami-neTM2000与RNA提取试剂盒TrizolReagent购自In-vitrogen公司。逆转录试剂盒ReverseTranscriptionSystem购自Promega公司。RT-PCR引物由上海生
物工程有限公司合成。IFN-α1b购自深圳科兴生物工程有限公司。兔抗人抗-磷酸化ERK，兔抗人抗-STAT1抗体、兔抗人抗-磷酸化STAT1抗体购自Bio-worlde公司。二抗购自中杉金桥公司。PD98059购
自Promega公司，质粒pcDNA3.1（-）购自Invitrogen公司。重组质粒FL1-145HBx由美国Drexel大学医学院Dr．Clippinger惠赠，HepG2细胞由本实验室保存。
·797·中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2011Jun；27（6）：797～8001．2细胞的培养及分组处理HepG2细胞用含10%小牛血清、1×105U·L－1青霉素、1×105U·L－1链霉素、2mmol·L－1谷氨酰胺DMEM培养液培养。转染前一天行HepG2细胞传代，并以5×107·L－1接种6孔板。接种后2d待细胞汇合约为75%时，按试剂盒说明书步骤分别混合质粒pcDNA3．1（-）或FL1-145HBx4μg与LipofectamineTM2000250μl至无血清DMEM行转染。HepG2细胞分为4组，对照组（CG）：HepG2细胞不做任何处理；空载体组（EG）：HepG2细胞按上述转染方法转染质粒pcD-NA3.1（-）；转染组（TG）：HepG2细胞转染表达HBx蛋白的质粒FL1-145HBx；预处理组（PG）：HepG2细胞转染FL1-145HBx后6h换含有40μmol·L－1的PD98059的DMEM培养液培养24h。以1000kU·L－1的IFN-α作用于各组细胞6h。1．3免疫印迹法检测蛋白表达预冷PBS洗6孔板中细胞3次，每孔加80μl含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上反应10min，振荡，12000r·min－14℃离心10min，收集上清液与20μl蛋白上样缓冲液混合煮沸10min。取20μl行SDS-PAGE电泳，80mA电流2h湿电转，10%脱脂奶粉封闭过夜，加一抗过夜，PBS洗3次，加二抗室温孵育2h，PBS漂洗3次，ECL试剂盒检测。1．4RT-PCR检测MxA、STAT1细胞总RNA的提取采用TRIzol试剂，并参照文献［6］进行RT-PCR操作。以目的基因与内参β-actin灰度值的比值表示目的基因mRNA相对表达水平。（引物序列及反应条件见Tab1）。Tab1PrimersandreactionconditionsGenePrimerlengthTmCycleMxA5'-ACAATCAGCCTGGTGGTGGTC-3'564bp60．6℃335'-CCTCCCCTACAGTTTCCTCTCC-3'STAT15'-CCCTTCTGGCTTTGGATTGA-3'518bp58．2℃335'-GGGAGCAGGTTGTCTGTGGT-3'β-actin5'-TCACCAACTGGGACGACAT-3'186bp60．6℃335'-GCACAGCCTGGATAGCAAC-3'1．5统计学处理数据用珋x±s表示。用SPSS13.0软件进行统计学处理，组间采用方差分析。2结果2．1HBx蛋白对IFN-α诱导的MxA蛋白表达的影响以1000kU·L－1浓度的IFN-α处理各组细胞，免疫印迹和RT-PCR法分别检测细胞HBx蛋白和MxAmRNA表达水平。从Fig1和Fig2可以看出，转染组和预处理组细胞均能够表达HBx蛋白，转染组细胞MxAmRNA表达水平（0.32±0.03）明显低于对照组（0.65±0.05）和空载体组（0.66±0.05），差异有统计学意义（F=59.39，P＜0.05）。而经PD98059预处理的细胞中，MxAmRNA表达水平（0.59±0.05）接近于对照组和空载体组（F=1.91，P＞0.05）。
Fig1ExpressionofHBxproteinineachgroup
Fig2EffectsofHBxontheexpressionofMxAmRNAineachgroup1：Marker；2：Controlgroup（CG）；3：Emptyvectorgroup（EG）；4：Transfectiongroup（TG）；5：Pre-treatmentgroup（TG）．*P＜0.05vscontrolgroupandemptyvectorgroup．
2．2HBx蛋白对IFN-αJAK-STAT信号转导途径
分子STAT1表达的影响RT-PCR结果发现，转染组细胞STAT1mRNA表达水平为（0.47±0.06），与对照组（2.13±0.12）和空载体组（2.15±0.09）比较，差异有统计学意义（F=325.92，P＜0.05）（见Fig3）。免疫印迹检测结果与RT-PCR检测结果相
符合，即转染组细胞中t-STAT1及p-STAT1明显低于对照组和空载体组（见Fig4、Tab2）。
·897·中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2011Jun；27（6）