各类质粒载体图谱、序列及酶切位点大全(非常有用)
质粒载体
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。
一、一个合格质粒的组成要素a复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。
b 抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+c 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段d P/E 启动子/增强子e Terms 终止信号f 加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。
它具有多个限制酶的单一切点。
便于外源基因的插入。
如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。
决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA插入片段大小。
质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。
一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。
这是用来区别克隆载体与表达载体。
克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。
选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号a 启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
b增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。
LentiCRISPRV2载体使用说明
LentiCRISPRV2载体使用说明
一载体简要说明
1 克隆gDNA使用BsmBI酶切位点，载体可以切出1.9kb的filter，便于确定载体酶切成功，并且利于胶回收。
2 BsmBI酶切位点如图酶切后不需要用CIP脱磷，也不会自连。
3在cas9的C端有FLAG，可以WB或Immunostaining来检测。
4 EFS被优化的小而强，方便慢病毒的包装，极大的提高了慢病毒包装的效率。
5 优化的内部核糖体插入位点P2A，可以在只有EFS启动的情况下独立表达puromycin来筛选转染或感染成功的细胞。
二 gDNA设计说明
对于lentiCRISPR V2克隆，其合成的oligo末端与px330不同如下图所示：
具体举例如下：一定注意oligo的方向，载体的hU6的下游正义链一定是基因组序列的有义链，否则编辑无效,且5’端必须第一个碱基必须是G如果不是G也要认为加一个G满足U6启动子的需求。
将引物稀释 100uM 后，再 10 倍稀释
退火
50ul 体系
引物 20ul（上下游各 10ul）、
水 25ul、
NEB buffer 2（10*）5ul 95℃，5min。
然后关闭 PCR 仪，自然降温 40min。
LentiCRISPR V2 载体酶切
200ul体系：
BsmBI 2ul；
10*buffer 20ul；
质粒 10ul（2ug）
水 16ul 55℃，酶切 2 小时胶回收
连接
2*solutionI 5ul
退火引物 4.5ul
线性化载体 0.5ul 16℃连接过夜，转化挑菌送测序。
第三章__质粒载体
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8
环形双链DNA质粒分子的三种构型
OC L
SC
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不同质粒DNA分子量差异显著，最小的仅能编码2－3 种蛋白质，分子量约为106 ，最大的可达108。
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1、pSCl01质粒载体
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pSCl01质粒作载体克精选隆可编非辑洲ppt爪赡的基因
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2、CoLEl质粒载体
2
一、质粒的定义、命名、分类、分布
定义：质粒是一类寄宿于细胞内，独立于染色体外 的自我复制并稳定遗传的环状双链DNA分子。
命名：小写字母p代表质粒，两个大写字母代表发 明者，后接实验编号，
分类： 分布：
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3
质粒分类
1、根据质粒的性状特征分为：
1）F质粒：又叫F因子或性质粒(sexplasmid)。 2）R质粒：通称抗药性因子。编码有一种或数种抗菌
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质粒DNA拷贝数的控制
高拷贝质粒DNA复制的启动，是由质粒编码基因合成的 功能蛋白质调节的，与寄主细胞周期开始时合成的不稳 定的复制起始蛋白质无关。
低拷贝质粒的复制是受寄主细胞不稳定的蛋白质控制的， 并与寄主细胞染色体同步进行。
用蛋白质合成抑止剂氯霉素或壮观霉素处理寄主细胞， 使染色体DNA复制受阻的情况下，松弛的质粒仍可继续 扩增。而严紧型质粒则不行。
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3、失控的质粒载体
有一些低拷贝数的质粒，其复制控制时温度敏感型的， 即在不同的温度下，拷贝数会有显著的变化，这类质粒 称失控的质粒载体。
【原创】找质粒.载体图谱及序列的方法
【原创】找质粒.载体图谱及序列的方法
在相关版面看到n个这样的帖子：“请问....质粒的图谱?" "请问质粒...的酶切位点?"....
诸如此类的问题，多之甚多。
因此，友情提醒按以下方法查找质粒相关信息:
1.Vectorpedia：输入质粒骨架，直接查询，非常方便;
2. google
检索式子：质粒名＋ map
质粒名＋sequence ＋filetype:txt or filetype:pdf
或者：进入google，点击"图片搜索"，直接查找图谱.
3.google scholar: /
有些质粒是经过改造的，所以通过上述方法不能查询到相应信息。
这时，可以在google scholar中输入质粒名称，可以直观地看哪些学者在何文章中使用了该质粒，从而可了解到质粒的来源;或者籍此向作者咨询或索取。
4.尝试从各大生物公司，例如invitrogen网站查询.
5. 这个网站收录了大量图谱：
PET系列载体信息：
本人一点想法，供参考。
希望版面内不要出现类似的帖子，浪费
斑竹和其他战友的时间，也影响自己的工作。
:P。
质粒种类与应用-PPT精品文档139页
质粒的基本特征
质粒
质粒的不相容性：分子机制 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的 拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定， 因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一 细胞内 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种 拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同， 其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势
克隆载体
基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段 DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源(目 的) DNA而将目的DNA带入宿主细胞。
常用的载体有质粒、噬菌体、病毒等
基因工程载体的构建必需应用表达调控 的基本理论知识，应用已知的调控序列进行 重组、改造。
基因载体应具备的条件：
Cop
Rep
Pcop
cop
P/Orep
rep
ori
质粒
质粒的基本特征
质粒的不相容性
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质 粒组成不相容性群 以大肠杆菌的质粒为例：
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
E c o R I S a c I K p n I S m a I B a m H I X b a I S a lI P stI S p h I H in d I II
pU C 19
LacZ
Apr
(2.68kb)
Ori
三个显著特点：
（1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更 高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。 （2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利 用-互补原理进行蓝白筛选。 （3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构 成。
质粒DNA限制性酶切图谱分析
问题二：DNA切割不完全
４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则是酶：ＤＮＡ=２－３：１ 注意事项——限制性内切酶酶切 ２小时即可，充分酶解。
注意事项——DNA凝胶电泳
琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。 胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。
问题一：DNA完全没有被内切酶切割
原 因
对 策
六、限制性内切酶酶切常见问题分析
内切酶活性下降 内切酶稀释不正确 DNA不纯，反应条件不佳 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰 部分DNA溶液粘在管壁上 内切酶溶液粘度大，取样不准 酶切后DNA粘末端退火 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性 过度稀释使酶活性降低 反应条件不适 识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序
单击此处添加大标题内容
平头末端：
II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT|ATC …… 3’ 3’…… CTA|TAG …… 5’ 切割后形成 5’…… GAT ATC …… 3’ 3’…… CTA TAG …… 5’ 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。
pET-28b(+)载体
pET-28b（+）载体（基本信息、图谱和多克隆位点信息、简介、序列）1.pET28a载体基本信息：质粒类型：大肠杆菌表达载体表达水平：高克隆方法：多克隆位点，限制性内切酶载体大小：5368bp5' 测序引物及序列: T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'3' 测序引物序列: T7t: 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'载体标签: N-His, N-Thrombin, N-T7, C-His载体抗性：Kanamycin (卡那霉素)N端含有凝血酶（Thrombin）蛋白酶位切点；pET28a,b,c的差异主要存在于多克隆位点处病毒类型：非病毒2.pET28a载体质粒图谱和多克隆位点信息：3.pET28a载体简介pET-28a-c(+)载体带有一个N端的His/Thrombin/T7蛋白标签，同时含有一个可以选择的C端His标签。
pET28a载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。
注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。
T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。
质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列(Cat. No. 69337-3)的作用下终止蛋白翻译。
3.pET28a载体简介pET-28a-c(+)载体带有一个N端的His/Thrombin/T7蛋白标签，同时N端含有凝血酶（Thrombin）蛋白酶位切点；pET28a,b,c的差异主要存在于多克隆位点处载体描述：The pET-28a-c(+) vectors carry an N-terminal His•Tag®/ thrombin/ T7•Tag® configuration plus an optional C-terminal His•Tag sequence. Unique sites are shown on the circle map. Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymeraseis shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containingsingle-stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single stranded sequencing should be performed using the T7 terminator primer (Cat. No. 69337-3).PET-28a-c(+) 向量进行 N-末端His•Tag® / 凝血酶/ T7•Tag® 配置再加上可选的 C-末端His•Tag 序列。
质粒载体种类
质粒载体种类质粒载体是在基因工程和分子生物学研究中广泛应用的一种工具，它可以用来携带和传递外源基因。
根据其特性和功能的不同，质粒载体可以分为多种类型，下面将介绍几种常见的质粒载体。
1. 表达质粒载体表达质粒载体是用于表达外源基因的载体。
它通常包含一个启动子、一个编码区和一个终止子。
启动子可以使外源基因在宿主细胞内得到转录和翻译，编码区则包含了外源基因的编码序列，终止子用于终止翻译过程。
常用的表达质粒载体包括pUC19、pET28a等。
这些载体具有高拷贝数和广谱宿主范围的特点，适用于大多数细菌和酵母的表达。
2. 克隆质粒载体克隆质粒载体用于将外源DNA片段克隆到质粒中。
它通常包含一个多克隆位点，用于插入外源DNA片段，以及一些选择标记，如抗生素抗性基因。
常见的克隆质粒载体有pGEM-T、pBluescript 等。
这些载体具有较高的拷贝数和较大的插入容量，适用于DNA 片段的克隆和扩增。
3. RNAi质粒载体RNAi质粒载体用于介导RNA干扰（RNA interference）。
它通常包含一个RNAi导体，其中包含外源基因的靶向序列，以及一个RNAi表达序列。
外源基因的靶向序列可以与目标基因的mRNA相互配对，从而介导其降解或抑制其翻译。
常见的RNAi质粒载体有pSUPER、pLKO等。
这些载体具有较高的RNAi效率和较强的基因沉默能力，适用于基因功能研究和基因治疗。
4. 荧光蛋白质粒载体荧光蛋白质粒载体用于表达荧光蛋白基因，常用于研究基因的表达和定位。
它通常包含一个荧光蛋白基因，如绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（RFP），以及一个启动子和终止子。
外源基因的表达可以使细胞或生物发出荧光信号，从而实现基因的可视化。
常见的荧光蛋白质粒载体有pEGFP、pRSET等。
这些载体具有较高的表达效率和较强的荧光信号，适用于细胞标记和蛋白定位等研究。
5. 敲入质粒载体敲入质粒载体用于将外源DNA片段整合到宿主基因组中。
pcdna31载体图谱
pcdna31载体图谱pCDNA3.1载体图谱在分子生物学研究中，载体扮演着非常重要的角色，可以用于携带和复制外来DNA片段。
其中，pCDNA3.1载体是一种常用的质粒载体，广泛应用于基因工程和蛋白表达等领域。
本文将为你介绍pCDNA3.1载体的图谱以及其在分子生物学研究中的应用。
一、载体介绍pCDNA3.1载体是由Invitrogen公司设计和制备的，是一种线性双链DNA质粒。
其总长度为5425个碱基对（bp），可在真核细胞中高效表达外源基因。
pCDNA3.1载体具有多个重要序列和元件，包括：1. CMV启动子：载体中的强启动子，可以驱动表达外源基因。
2. Ampicillin抗性基因：能够在大肠杆菌中提供抗生素选择性，方便在细菌中筛选携带pCDNA3.1质粒的细胞。
3. SV40终止子：有效终止基因转录。
4. T7、T3和SP6引物结合位点：可用于构建扩增外源DNA片段的引物。
二、载体结构pCDNA3.1载体的结构图谱如下所示（图1）：[图谱描述，如pCDNA3.1载体的线性结构图]图1. pCDNA3.1载体结构图谱三、载体应用1. 外源基因表达pCDNA3.1载体可用于在真核细胞中高效表达外源基因。
通过将目标基因插入载体的多克隆位点中，构建转基因质粒。
然后，将质粒导入目标细胞，经过适当的培养和选择，可获得稳定的外源基因表达细胞株。
这对于研究基因功能、蛋白表达以及疾病机制具有重要意义。
2. 基因敲除和敲入除了外源基因表达，pCDNA3.1载体还可以用于基因敲除和敲入实验。
通过基因敲除，可以揭示目标基因在细胞中的功能和作用机制。
而基因敲入则可以用于表达突变基因、标记基因或其他感兴趣的基因。
这些实验为研究基因调控网络和信号通路提供了有力的工具。
3. RNA干扰 (RNAi)pCDNA3.1载体也可以用于RNA干扰 (RNAi) 研究。
通过将目标基因的RNAi靶向序列插入载体，并转染到目标细胞中，可以靶向降低目标基因的表达。
pUC18+和+pUC19质粒图谱
pUC18 和pUC19质粒图谱pUC18 和pUC19 大小只有2686bp ，是最常用的质粒载体，其结构组成紧凑，几乎不含多余的DNA 片段，GenBank注册号为L08752（pUC18）和X02514（pUC19）。
由pBR322 改造而来，其中lacZ（MSC）来自M13mp18/19 图3-4 是其质粒图谱。
这两个质粒的结构几乎是完全一样的，只是多克隆位点的排列方向相反。
这些质粒缺乏控制拷贝数的rop基因，因此其拷贝数达500-700 。
pUC 系列载体含有一段lacZ蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表现α-互补作用。
因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。
特征序列区位：pBR322_origin1471 - 852Ampicillin2486 - 1626lac_promoter543 - 514AmpR_promoter2556 - 2528M13_pUC_rev_primer500 - 478M13_reverse_primer479 - 461M13_forward20_primer379 - 395M13_pUC_fwd_primer364 - 386lacZ_a398 - 250pGEX_3_primer51 - 29Orf22486 - 1626NOS terminator sequence:ggatccatcgttcaaac atttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataattt ctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttgtttatgagatgggtttttatgattagagtccc gcaattatacatttaatacacgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcat ctatgt tactagtaatcgat设计引物：Forward primer: 5’ ggaGGATCC ggatccatcgttcaaac 3’(含Bam H I 位点GGATCC及三个保护碱基)Reverse primer: 5’ atcGAATTC ATCGATTACTAGTAACATAG 3’(含Eco R I 位点GAATTC及三个保护碱基)请查一下NOS终止子序列内有没有这两个酶切点。