链霉菌基因转移的方法
质粒在大肠杆菌和吸水链霉菌井冈5008之间的属间接合转移
质粒在大肠杆菌和吸水链霉菌井冈5008之间的属间接合转移牛一第12卷第1期漳州师范学院(自然科学版)1999年1月JournalofZhangzhouTeachersCollege(Nat.Sci.)V o1.I2No.JAN.I999质粒在大肠杆菌和吸水链霉菌井冈5008之间的属间接合转移鉴墨壁(漳州师院化学系漳州363000),;/z/733摘要利用一十链霉菌——大肠杆菌双功能柯斯载体pHZI32建立T吸水链霉菌井冈变种5008("下简称井冈5008)的属间接台转移系统.将携带pHZ132的大腑杆菌细胞LE392和携带RP4衍生质粒pRK2073的大肠杆菌细胞ED8768与萌发后的井冈5008孢子混台起来进行三亲奉杂交,在接台性质粒RP4转移功能的诱导卜,pHZI32即可从大腑杆菌细胞LE392转移到井冈5008孢子中去.所用培养基是利用2CM:LA=d:I(体积比)的橱台培养基.井冈5008晟住孢子萌发时间为35～{小时,关键词苎壁!堕望,苎堕.接台转移属1日]摆}转牟;,考奔鐾1前言展粒才系由于井冈5008产生两类重要的抗生素——氯基糖苷类抗生素(井冈霉素[:)和肚类抗生素(静丝霉素口一,人们对该菌株极有兴趣但是由于对井冈5008的遗传背景了解甚少,国内外也未见有关井岗5008DNA操作的报道,在对该菌株进行抗生素生物合成基因簇的克隆操作时遇到很多困难,如并冈5008原生质体再生差,转化额率低等.奉文尝试了通过三亲本杂交的方法将大肠杆菌质粒pHZ【32动转移到井冈5008中,该方法已发展成为基因从大肠杆菌向井冈5008转移的工具.2材料和方法2.1材料本实验所用菌株和质粒列于表I,所用抗生素及其使用浓度见表2.抗生素均购自Sigma公司.表1菌株和质粒①奉文1998.I2-0,5收刊第1期漳州师范学院(自然科学版)?552.2技术方法大肠秆菌的液体培养基为LBls固体培养基为LA_5,培养温度37"C.井冈5008的液体培养基为YEMEC,固体培养基青黄豆饼柑培养基[,2CM[RYEE6]DNA[:和MMis]培养基.培养温度30C.井冈5008孢子萌发液见文献[6],孢子荫发方法和井冈5008质粒DNA提取方法几尢文献[6],大脑杆苗质粒DNA提取方法几尢文献Es].3实验结果与讨论大肠杆菌——井冈5008的三亲本杂交与接合平板培养基和链霉菌的受体状态密切相关作者对这两1,因素进行丁探索3.1接合平板培养基的选择接合平板培养基必须既能够使供体大晒杆菌生长良好,又能够使受体井冈5008茁丝体生长良好,而且为了便于杂交后检测接舍子.这种培养基叉必须适宜于井冈5008产孢.作者选择了链霉菌遗传操作中常用的几种培养基LA,2CM,R!YE,PDA,DNA及黄豆饼粉培养基.将大肠杆菌LE392和苷冈5008分别接种到这些培养基卜.观察它们的生长状况.结果见表3.丧3六种培养基}LE392和井冈500R的生长状况"+""++,"++十","十++十"分别表示生长或产孢整,一般,较好,很好.r表4同)结果表明:2CM,R2YE和黄豆饼粉培养基不适于大脑杆菌LE392生长,LA,PDA,DNA和RYE培养基不适于井冈5008生长和产孢,显然,六种培养基均不能满足要求.3.2合适比例的2CM+LA培养基的选择作者采用2CM和LA的混合培养基,设计了五种不同比例的处理选择合适的混合比例,实验结果见表4..5B.陈双雅:质粒在大脑杆菌和吸承链霉菌井冈5008之间的属间接合转移坞99年*;表示5倍体积的2CM与I倍体积的LA混合.#泉类推由此可见:当2CM和LA的体积比榴过:5:【.LE392生长差,当2CM和LA的体积比小于21,井阿5008的生长差.在这些处理中,2CM和LA的体积比为4:1和3:j无论是对大肠杆菌LE392的生长,还是井冈5008的生长部较适宜.最后选择的是2CM:LA的体积比,因为随着培养时间的延长,这种培荐基上井冈500g的产孢更好一些,更有利于接合转移子的检出.3.3井冈5008的最佳孢子萌发时间据报道,接合转移过程中,链霉菌受体状态非常重要到目前还未观察到与链霉菌苗照体的杂交,而萌发孢子可使接合转移频率比小萌发孢子提高5～10倍n:.作者设计了如下试验选择最佳的孢子萌发时间取井冈5008的孢子悬液(】0个/mL),按标准程序在37℃摇床两萌发,每半小时取样一趺,共5个小时,取出的样品经复红染色,在40×l0倍光学显微镜下观察孢子萌发情况.结果见表5.表5井冈5∞R孢子萌发时间与萌发百分率结果表明:萌发最佳时间为3.5～1小时,此时萌发孢子所占百分率为50～80,涂布在固体培养基能在5小时左右进入对敬生长期.3.4在pRK2073诱动下pHZ132向井冈5008的接合转移实验中的三亲本是受体井冈5008,供体大腑杆菌LE392(DHZ【32)和辅助菌株ED8768(口RK2073).pRK2073是在携带RK2的接台转移基因的辅助质粒pRK20【3的卡那霉索抗性基因位点插入转座子Tn7丽衍生的一呷,辅助质粒,携l有[ra基因和mob基因.pHZI32是一个大肠杆菌一链霉菌双功能柯斯质粒,携带了链霉菌质粒pSG5的复制子,组合丁可在链霉菌中表达的硫链丝菌素抗性基因(tsr),可在大肠杆菌中表达的氨苄青霉索抗性基因在这两种菌体中表达的紫霉抗性基因(vph),大肠杆菌噬苗体^的cus位点及太肠杆茁质粒RK2的接合转移位点(oriT).第1期漳州师范学院(自然科学版)?57.接种LE392(pRK2073)zj~5mL含有壮观霉素(终浓度50pg/mLJ的LB中,3TC摇床培养,离心出菌体,用LB洗两次,分别悬浮于少量LB中.井冈5008的孢子按标准程序热激和预萌发3.5小时,离心,沉淀悬浮于少量LB中(浓度约10十/mL,.取三亲本各50L,混合均匀后涂布于4×2CM+ixLA平板,同时设置对照[井冈5008与ED8767(pRK2073)混合],30C培养约2d小时,倒入适量无菌水,刮铲洗下平板表面的大肠杆菌菌体,重复三次至倾出的废液清亮.然后将平板置超净工作台上吹干,用lmL含200pg/mL的硫链丝菌素和400ug/mL的奈啶酮酸的水溶液均匀铺设在上层,再置超净工作台上吹干,最后放到30℃培养.3.4接合转移子的检出及质粒检测三亲杂交平板培养5～7天后,有白色菌落出现,而对照平板则没有菌落长出,说明抗性选择是有效的.挑出杂交平板中的菌落分别涂到含有硫链丝菌素(终浓度30~g/mL)的MM培养基和含有紫霉素(终浓度i0~tg/mL)的MM培养基上,发现挑出的所有菌落在两个抗性平板都生长,说明它们都有琉链丝菌素抗性和紫霉紊抗性,暗示得到了携带有pHzl32的井冈5008的接合转移子,但光用抗性选择是不够的,作蕾通过凝胶电泳排除了自发突变的可能性.将井冈5008(pHZ]32)在含有硫链丝菌素(终浓度30g/mL)的基本培养基上传代纯化三次后,制备孢子悬液,然后接种补加0.05甘氮酸,0.05MMgCI和硫链丝菌素(终浓度0rig/mL)的l0YEME,30℃摇床培养40～48小时,收获菌丝体,按标准程序提取质粒DNA,与从LE392(pHZl32)中分离出来的pHZi32进行同步电泳发现,两种质粒DNA在琼脂糖凝胶上电泳到同一水平.ABCDE图ipHZI32/LE392与pHZ132/井冈5008的同步电泳C+HindⅢB-D:pHZI32/LE392A.E:pHZ132/井阿5008这说明pHZl32确实已从大肠杆菌LE392转移至井冈5008中.电泳照片见图1. 参考文献I上海市农药研究所农用抗苗京组.井冈霉衰产生菌的鉴定.微生物,1975.5(2)l10～i132卢惟钊,周梅娟,余震等.静丝霉棠的分离与鉴定.徽生物.I980,20(2):19l～1953Borek—k..Beggs,J.D.tBrammer,W-J.etal?Thea)『crucfl0ninvitrooftransducingderivativesofphagelambda.MolecularandGeneralGenetic,;.I975.I46:I99~207dMazodicr.P.,PetterRandThompson.C-In[ergenericcunjugationbetween"呐蚺or,h,andsirepro—myce~species.JournalofBacteriology.1989.June-P.3583~35855Sambro~k.J..Fritseh.E.F.andManmtm-MolecularCloning.Abboratarymanua1.Second edition.ColdringHarborLaboratoryPress-CokiSpringHarborNY?l9896霍酱伍德着,邓小平新等译.链霉菌遗传操作实验手册.长抄:湖南科学技术出版社,I9887袁丽蓉.麦迫霉素产生菌——生米卡链霉菌原生质体融台的研究.抗生隶,I993,B(6):380~3878HopwoodD.A-UnderstandJngthegenetkt~ontrolofantibioticbiosynthesisandsporulatio ~inStreptom~ce,s.proc.R.Soe.Lond.I988.B235:I2I～138.5R.陈积雅:质粒在太肠杆菌和吸水链霉菌井冈5098之间的属间接台转移1999-~ IntergenerioPlasmidConjugalTransferBrtweenEscherichin(andStrept.trmyce8ygroscopicusar.jingangensis5008ChenShuangya(DepartmeatChemu~vy,Zhaa9zhouTeoche~8Colle9e,Fujmu363000,Chiaa)Abs~'actUsingaEscherichiacoli—Streptomycesbifunctionalshuttleplasmidvector pHZI32,theheterologousDNAfragmentsfromgschevid~iacoliLE392couldtransfertoSlr epmycextiygr0叩spⅡr.Jmdg"5008bym~rllsofthreeparentalconjugation.Theoptimal mediumforconjugationisamixtureof2CMmediumandLAmedium(ratio4:1).Theoptimal spore—germinatingtimeis3.5～4hours.KeyWOrdsS.hyg..口lu0r.fingauge~sis5008.E.coil.conjugaltransfer(上接第d9页)cetyltrimetrhylammoninmbromide,theregressionequation1og(0/A)一0.0379I+0.007576CB(Ⅲ)vg/L,r一0-9997)islinerwithconcentracti~nofBi(Ⅲ)intherangeof0～8~ag/L,.5一9.3×10L?mol一?cm一,thedetectionlimitbeing0.012.ag/L.themethodhashighsensitiv- ityandwellselctivity—GoodagreementwasobtainedbetweenAASre.suk,sandanaly'tk-alresult~ oftracebismuthinwater.KeywordsDiscoloringspectr0photometry,Sensitizedretj0n,Inhiblti.n,Bismuth, Litchichmcsered.。
实验四细菌质粒的接合转移
转移子的筛选
• 筛选培养基为：基本培养基+抗生素；
供体和辅助大肠杆菌均营养缺陷型，不能 在基本培养基上生长；
未转化成功的受体菌不能在有抗生素的平 板上生长。
三：实验菌株
• 供体菌：E.coli DH5α(pTR102) (TcR)，含有 mob基因 ；
• 受体菌: 紫云英根瘤菌 ( TcS) ； • 辅助菌: E. coli MM294 (pPK2073)（SpeR），
大肠杆菌：F因子、R1、R100、R6K、RP4…… 天蓝色链霉菌：致育性因子pSCP1、pSCP2……
• 2．非转移型质粒：多为高拷贝的小质粒，如大肠 杆菌的ColE1、RSF1010等。由于缺少转移基因 （tra），不能自主转移，但由于含有与F质粒类似 的bom（或nic）位点或诱动基因mob （mobilization），因而能被带有tra基因的转移性 质粒诱动而发生转移。
二：基本原理
• 在质粒转移过程中，供体菌与受体菌 细胞通过结合作用紧密接触，质粒从 供体细胞向受体转移，同时进行质粒 复制，这就是结合转移的过程。按能 否自主转移，将天然存在的质粒分为 两大类。
• 1．转移型质粒：多为低拷贝的大质粒，含有完整 的转移操纵子基因（tra）和转移起始位点。能在同 种或亲缘关系近的菌体细胞间进行转移。例如：
操作步骤（第一天）
• 用可调定量移液器吸取供体、辅助菌各 0.4ml， 吸受体菌0.6ml，都加入同一eppdorf管内（每个 同学做1管），放入离心机内，10000转/min 离 心1分钟。
• 倒上清，向沉淀加 1ml 的 TY液体，用 tip上下抽 吸，洗涤菌体，再10000转/min离心1分钟，倒上 清，留100μl左右用于悬浮菌体。
菌种传代的操作方法
菌种传代的操作方法
菌种传代，是指将已有的菌株进行繁殖，并保持其遗传特性的操作。
以下是菌种传代的一般操作方法：
1. 选择合适的培养基：根据菌株的需求选择合适的培养基，如琼脂或液体培养基。
2. 培养菌株：将初始的菌株接种到培养基上，培养在适当的条件下，如温度、光照和湿度等。
3. 观察生长情况：观察菌株在培养基上的生长情况，如菌落形态、颜色和密度等。
4. 选取单一菌落：根据需要，从培养基上选择单一的菌落，避免杂交或干扰。
5. 转移到新的培养基上：将选取的单一菌落转移到新的培养基上。
可以使用传递环法，即在新的琼脂平板上划出线形、网状或圆形区域，将菌落转移到该区域；或使用菌液接种法，将菌悬液接种到新的培养基中。
6. 维持传代：继续重复步骤3-5，将菌株传代到新的培养基上，以保持其遗传特性。
需要注意的是，在菌种传代的过程中，应避免污染和混杂，保持无菌操作。
另外，菌种传代的频率也应根据需要和菌株的生长特性进行调整，以保证菌株的质量和稳定性。
微生物遗传-结合转移
实验原理：1、质粒的转移性
• 细菌的遗传重组有接合转移、转化和转导三种主要方式。 接合转移是指供体和受体细胞间直接接触，质粒DNA从 供体向受体转移的过程。
• 质粒可分为可转移质粒和非转移质粒两类，转移质粒带有 完整的编码转移酶的 tra 基因,质粒能自主地从一个细胞 转移到另一个细胞,甚至还能带动供体细胞的染色体 DNA 向受体细胞转移，这类质粒常被称为自主转移质粒。如大 肠杆菌的 F 质粒。
实验菌株
• 供体菌：E.coli DH5α(pTR102-luxAB) (TcR、luxAB) • 受体菌: Sinorhizobium fredii ( Tc S) • 辅助菌: E. coli MM294 (pRK2073)（SpecR） 实验产物 • 转移接合子: S. fredii (pTR102-luxAB), (TcR，luxAB)
操作步骤：三菌混合培养（第1天） (1)吸取供体菌、辅助菌各 0.4ml，吸受体菌0.6ml，都加入同 一个1.5ml离心管内（每个同学做1管），8000转/min 离 心1分钟。 (2) 倒上清，向沉淀加 1ml 的 TY液体，用 tip上下抽吸，洗 涤菌体，再8000转/min离心1分钟，倒上清，留沉淀。 (3) 用镊子取灭菌滤纸片贴于已准备好的TY平板上（每个同 学1片，3片/平板，平皿背面标记姓名），用200μl的 tip 抽吸离心管内沉淀的菌体，打散成浓菌液，将之加到滤纸 片中央（切勿倾斜平板，以免菌液流出滤纸片以外） (4) 加好菌液后，静置5－10分钟，待滤纸上的培养基液体 被平板吸收后，倒置放培养箱，28OC培养1天。
操作步骤：洗菌涂平板（第2天）
（1）灭菌小PA瓶中加5ml无菌水(1瓶/人), 镊子揭下TY平板 上的滤纸片，放入瓶中，在震荡混匀器上充分打散菌体。
链霉菌沉默生物合成基因簇调控的研究进展
文章编号：1001-8689(2020)12-1201-07链霉菌沉默生物合成基因簇调控的研究进展陈瑞琦1,2,3 梁冬梅1,2,3 刘家亨1,2,3 乔建军1,2,3 财音青格乐1,2,*( 1 天津大学化工学院，天津 300072；2 系统生物工程教育部重点实验室，天津 300072；3 天津化学化工协同创新中心合成生物学平台，天津 300072)摘要 本文以天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor )中黄色色素coelimycin 生物合成调控及开发策略的研究进展为代表，介绍了链霉菌中沉默生物合成基因簇调控激活的新进展，为链霉菌天然产物基因簇的挖掘和新次级代谢产物的发现提供研究思路。
关键词：链霉菌；次级代谢；沉默生物合成基因簇；黄色色素coelimycin ；转录调控中图分类号：R9, Q936 文献标志码：AAdvances in the regulation of Streptomyces silent biosynthetic gene clustersChen Rui-qi 1,2,3, Liang Dong-mei 1,2,3, Liu Jia-heng 1,2,3, Qiao Jian-jun 1,2,3 and Cai-yin Qing-ge-le 1,2(1 School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072; 2 Key Laboratory of Systems Bioengineering ofMinistry of Education, Tianjin University, Tianjin 300072; 3 Syn Bio Research Platform, Collaborative Innovation Centerof Chemical Science and Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072)Abstract This paper takes the example of theregulation of the coelimycin biosynthesis in Streptomyces coelicolor ，and introduces the advances of activation of silent biosynthetic gene clusters in Streptomyces . It provides research ideas for the activation of Streptomyces natural product gene clusters and the discovery of new secondary metabolites.Key words Streptomyces ; Secondary metabolism; Silent biosynthetic gene clusters; Yellow pigment coelimycin ; Transcriptional regulation收稿日期：2019-12-13基金项目：国家重点研发计划资助项目(No.2017YFD0201400)作者简介：陈瑞琦，女，生于1994年，在读硕士研究生，研究方向为微生物次级代谢产物生物合成，E-mail:**********************通讯作者，E-mail:****************.cn近年来，随着耐药病原体的频繁出现和癌症等疾病发病率的逐年增长，发现和开发新药迫在眉睫。
链霉菌培养
1.棒状链霉菌Mg2+ 0mM—0.4mM培养基组成为:大豆粉、FeS04.7H20、鸟氨酸、甘油、KH2P04和MgS04.7H20含量分别为38.1029/1、O.3959/1、1.1779/1、18.75鲋、O.1259a和0.25刨。
采用ISPl培养基活化菌种,于28"C、200r/min培养48h后,以5%的接种量转接发酵培养基,于28℃、200r/min培养。
[SPl培养基为(g/1):胰蛋白胨5,酵母提取物3,pH6.5。
发酵培养基组成为(g/1):甘油16.88、KH2P04 0.13、大豆蛋白胨33.60、MgSO,·7H20 0.2、FeS04·7H20 0.3、鸟氨酸1.32、MOPS 21。
2. 始旋链霉菌优化后的发酵培养基组成为:可溶性淀粉3.0%,蔗糖1.0%,葡萄糖O.5%、麦芽糖0.8%、黄豆饼粉1.2%、蛋白胨O.4%、鱼粉1.2%、酵母粉0.6%、(NH4)2S04 0.2%、MgS04 0.35%,KH2P04 O.02%、CaC030.4%,NaN03 o.075%;优化的摇瓶培养条件为:初始pH值为6.5,在25mL/250 mL三角瓶中以6%接种量接入经过36 h培养的种子培养液,在25。
C,220 rpm条件下进行培养60 h斜面培养基:可溶性淀粉1.5%,黄豆饼粉1%,缬氨酸0.05%,K2HP04O.05%,NaCl 0.2%,MgS04 0.05%,琼脂2.0%。
调节pH值为6.5,在28℃及空气湿度40%条件下培养7.1 0 d。
平板培养基:配方同斜面培养基种子培养基:可溶性淀粉1.5%,葡萄糖l%,黄豆饼粉1.5%,蛋白胨O.5%,酵母粉0.5%,KN01 0.25%,NaCl 0.2%,CaC03 0.4%,琼脂0.1%。
调节pH值为pH 7.0—7.2,在28℃、摇床转速220 rpm条件下培养40 h。
发酵培养基:可溶性淀粉4%,葡萄糖1%,黄豆饼粉1.5%,蛋白胨0.5%,鱼粉1%,酵母粉0.3%,(NH4)2S04 0.2%,MgS04 O.35%,KH2P04 O.02%,CaC03 O.4%,NaN03 0.075%,调节pH值为pH 7.0,在28℃,220 rpm条件下培养60 h。
微生物遗传与分子生物学
微生物遗传与分子生物学（5*15+1*25=100分）本课程主要涉及到微生物中主要的模式菌株:原核微生物: 放线菌(链霉菌),大肠杆菌,芽孢杆菌,乳酸菌，古菌等。
真核微生物：汉逊酵母，酿酒酵母，白念珠菌等。
第一章概论基因的符号：每个基因：如色氨酸基因trp；同一表型的不同基因：如trpA或trpB等。
当染色体上发生缺失时可用Δ表示（如ΔtrpA或ΔtrpA）；基因突变：如亮氨酸缺陷型leu-；抗药性基因：r表示抗性，加s表示敏感如链霉素抗性基因表示为strr，敏感基因表示为strs。
1、微生物基因突变一般分几种类型,突变有什么生物学意义?（谭老师）基因突变可从突变发生方式和突变引起的表型改变和遗传物质改变等方面进行分类。
按突变体表型特征的不同，可把突变分为以下4个类型:1). 形态突变型2). 生化突变型3). 致死突变型:按突变所引起的遗传信息的改变，又可把突变分为：1). 错义突变2). 同义突变3). 无义突变根据遗传物质的结构改变，可分为碱基置换、移码、DNA片段插入和缺失。
根据突变发生的方式，可分为自发突变和诱发突变。
突变的生物学意义：基因突变导致了基因表达出来的性状发生了改变，对突变个体本身来讲，绝大多数是有害的，因为现有的生物基本上都适应了现在的环境。
但是环境是可变的，如果生物不变，那就很可能被淘汰。
所以，对整个生物群体来说，突变使群体不会灭亡。
环境不断改变，生物通过不断突变而适应, 也就使其被保存下来。
最终，物种的面貌特征与祖先不同，所以说，突变是生物进化的内因，是进化的主要动力。
无数事实说明了一个真理，即宇宙间的所有物种变是绝对的，不变则是相对的。
2、应用于链霉菌基因组编辑与大片段DNA克隆的技术都有哪些？能否用在你们今后的实验中？（刘钢老师）基因组编辑是指在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。
原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到改造基因组的目的。
原核微生物基因重组的方式
原核微生物基因重组的方式引言原核微生物是一类单细胞的微生物，其具有简单的细胞结构和基因组组成。
基因重组是指将不同的DN A片段组合在一起，创造出新的基因组序列的过程。
原核微生物基因重组的方式多种多样，本文将对其中的几种常见方式进行介绍。
1.水平基因转移水平基因转移是指基因从一种微生物向另一种微生物传递的过程。
常见的水平基因转移方式包括共轭转移、转导和转化。
1.1共轭转移共轭转移是指两个细菌之间通过直接接触传递质粒或染色体的过程。
质粒是一种环状D NA分子，它可以携带多种基因。
在共轭转移中，质粒通过共轭桥从一个细菌传递到另一个细菌。
这种方式使得基因可以在不同的细菌之间进行传递和交换，从而促进了基因的多样性。
1.2转导转导是指细菌间通过噬菌体传递D NA的过程。
噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，它在感染细菌时会将自己的遗传物质注入到宿主细菌中。
如果宿主细菌的D NA与噬菌体D NA发生重组，那么在噬菌体复制时就会将宿主细菌的某些基因带走，并在感染新的细菌时将这些基因传递给后代细菌。
1.3转化转化是指细菌从周围环境中吸收外源D NA，并将其整合到自身的基因组中。
在转化过程中，外源D NA经过特殊的转化过程，如细菌细胞壁的转换、D NA的摄取和基因组的整合等，最终被细菌利用。
2.基因重组的限制和调控在原核微生物中，基因重组遭遇到一些限制和调控。
这些限制和调控有助于维持基因组的稳定性和适应环境的能力。
2.1限制酶限制酶是一种存在于细菌中的酶，它能够识别并切割特定的DN A序列。
限制酶的作用是保护细菌免受外源D NA的入侵。
当细菌吸收外源D NA时，限制酶可以切割这些外源DN A，从而阻止外源基因的整合。
2.2修饰酶修饰酶是一种存在于细菌中的酶，它能够在自己的DN A上添加化学修饰。
这些修饰可以阻止限制酶切割宿主细菌的DN A，从而保护宿主细菌的基因组。
2.3受体蛋白受体蛋白是一种存在于细菌中的蛋白质，它能够识别外源D NA并与之结合。
菌种保藏技术—菌种遗传与变异
图6.9 原生质体融合显微观察
谢谢
基因突变的概念
• 基因突变是指遗传物质的分子结构或数量发生的可遗传的变化。侠 义的突变专指点突变，所谓点突变是指一个基因内部遗传结构或 DNA序列的任何改变，包括一对或少数几对碱基的缺失、插入或置 换，而导致的遗传变化。广义的突变包括点突变和染色体畸变，染 色体畸变是指大段染色体的缺失、重复、倒位、易位。在微生物中， 点突变是最常见、最易发生的一种突变现象。从自然界分离到的菌 株一般称野生型菌株，或称野生型。野生型经突变后形成的带有新 性状的菌株，称突变株。
一、普遍转导
通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进 行“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称为普遍转导。噬 菌体侵入寄主细胞后，通过复制和合成，亦将寄主DNA降解为许多小 片段，进入装配阶段。正常情况下，噬菌体将自身的DNA包裹在衣壳 中，但也有异常的可能。它误将寄主细胞DNA的某一片段包裹进去。 这样的噬菌体称缺陷噬菌体。体内仅含有供体DNA的缺陷噬菌体称完 全缺陷噬菌体。体内同时含有供体DNA和噬菌体DNA的缺陷噬菌体 称为部分缺陷噬菌体。这种异常情况出现的概率很低（10-5～10-8)。
谢谢
一、菌种的衰退
（一）菌种衰退的现象
菌种衰退（degeneration）是指由于自发突变的结果，而 使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。 菌种衰退的具体表现有以下几个方面。
1. 菌落和细胞形态改变 每一种微生物在一定的培养条件 下都有一定的形态特征，如果典型的形态特征逐渐减少， 就表现为衰退。例如，泾阳链霉菌“5406”的菌落原来为 凸形变成了扇形、帽形或小山形；孢子丝由原来螺旋形变 成波曲形或直形，孢子从椭圆形变成圆柱形等。
基因重组的概念：
微生物遗传学第四章 细菌转移(2)
1. 接合现象的发现与证实
1946年，J.Lederberg & Tatum的大肠杆菌杂交试 验：
材料：大肠杆菌(E. coli) K12菌株的两个营养缺陷型品系：
菌株A—甲硫氨酸缺陷型met-和生物素缺陷型bio-； 菌株B—苏氨酸缺陷型thr-和亮氨酸缺陷型leu-。
2020/11/25
2.F质粒的发现
证明了细菌的接合是遗传物质的单向转移后， Hayes偶然发现了作为原始供体的A菌在冰箱里 存放了一年后出现一种变种，变种和正常的B菌 杂交时缺乏将遗传物质传给B菌株的能力。
他把这个不育变种的一个Strr 突变型分离出来， 并把它和可育的Strs A菌株一起繁殖，将其涂布 在含有链霉素的平板上，分离后再和B菌株杂交， 结果使不育的菌株回复了可育性（大约1/3恢 复）。
2020/11/25
有学者认为，具有性菌毛的细胞可以叫做 雄性，这种细丝状的菌毛像一种分子阴茎 ，与缺乏性菌毛的雌性细胞交合（德迪夫 1999）。
威廉斯（ 2001）的观点：“在细菌和病毒 以及在所有高等生命体的主要类型中，遗 传重组现象的存在表明，性别的分子基础 是来自远古的进化演变的产物”。
14.11MCB 140 2/16/05 15
草履虫
MCB 140 2/16/05 16
W.Hayes的实验（1952）
(A)Strs (B)Strr
(A)Strr (B)Strs
A: met- bio- thr+ thi+ B: met+bio+ thr- thi-
(B)Strr
(A)Strr
⑥ 其特性类似于染色体，但染色体基因转移的频率不超过 10-6，F因子转移的频率高达70％以上。
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5生物工程进展62002,Vol.22,No.1技术与方法链霉菌基因转移的方法吴胜夏焕章(沈阳药科大学生物制药系,沈阳110016)摘要本文介绍了用于链霉菌基因转移的各种方法,涉及原生质体转化、电穿孔、接合转移和噬菌体转导,对影响链霉菌基因转移的各种因素进行了分析。
关键词链霉菌原生质体转化电穿孔接合转移噬菌体转导链霉菌是一类重要的工业微生物,它可以产生各种各样的生物活性物质,越来越受到重视,链霉菌基因工程技术的发展,使得克隆次级代谢产物生物合成基因、有目的地定向改造基因、提高基因的表达水平以改造菌种的生产能力、基因重组产生新化合物成为可能。
在对一个链霉菌进行基因改造时,首要的问题就是建立所研究菌株的基因转移系统,这是实现对其基因功能分析、生物合成基因簇定位、基因改造等一系列工作的基础。
然而,有许多链霉菌,尤其是有实用价值的链霉菌在进行DNA转化时,均遇到很大困难。
为克服这一困难,科研人员进行许多研究。
通过分离内源性质粒、筛选噬菌体并通过改造其结构而构建了许多有用的克隆载体。
在方法学上也进行了许多有益的探索,建立了几种基因转移方法如转化、转导和接合转移等。
下面对这些方法在链霉菌中应用逐一进行介绍。
1转化包括PE G-介导的质粒转化原生质体(polyeth-ylene glycol-induced plasmid transformation of proto-plasts)和电穿孔(electroporation)。
前者是链霉菌基因操作中最常用的方法,后者主要用于植物和动物细胞,在链霉菌中也有成功的报道。
1.1PEG-介导的质粒转化原生质体转化大肠杆菌的关键是用冷刺激和CaCl2处理诱导感受态细胞,由此形成通过质粒中介的克隆操作,但这在链霉菌中尚无成功的报道。
在Okanishi 和他的合作者有关链霉菌原生质体形成、再生和转染工作的基础上,Bibb等发现当有PEG存在时,质粒DNA能以很高的频率转化变铅青链霉菌原生质体[1]。
通过对影响转化过程的各个参数的优化以及对转化方法的改进,这一方法已成功地应用于许多种链霉菌[2-4]。
到目前为止该方法仍然是链霉菌转化和转染的基础。
影响原生质体转化的主要因素有原生质体的制备和再生的条件、转化时所用原生质体的数目、质粒的来源和浓度、再生平板的干燥程度、PE G的来源和浓度、抗生素选择时间等。
在进行转化实验之前,首先要制备原生质体,要求原生质体有较高的形成率和再生率。
据文献报道不同链霉菌原生质体形成和再生的条件不完全相同,需要根据不同菌种的性质加以改进。
另外,链霉菌对外源DNA普遍存在限制修饰作用,这也是影响转化成败的一个关键性因素。
除少数链霉菌如变铅青链霉菌(S.lividans)和生二素链霉菌(S.ambo faciens)等对外源DNA无限制修饰作用外,其它的链霉菌都表现出程度不同的限制修饰作用。
如除虫链霉菌(S.avermitilis)中存在一种独特的甲基化专一性的限制修饰系统[5];S.lipma-nii表达两种限制修饰系统[6];而弗氏链霉菌(S.fra-diae)中存在五种限制修饰系统等[7]。
链霉菌对外源DNA的限制修饰作用可由以下几个因素中的一个或几个共同决定:质粒的不相容性、DNase活力、限制性内切酶。
1.1.1质粒的不相容性质粒的不相容性主要由两个方面的因素引起的:¹由于复制控制而产生的不相容性。
复制控制系统不能将它们作为两个质粒来识别,因而只能随机选择进行复制;º由于分离引起的不相容性。
如果两个质粒具有相同的par功能,这两个质粒有可能是不亲和的。
当共存的质粒具有相同的par功能时,在细胞分裂时只有一种能够被分配到子细胞。
然而,有时一个子细胞只能得到一种类型的质粒,而另一个细胞得到另外一种类型的质粒,这样得到的子细胞都是丢失一种质粒的细胞。
在极端的情况91下,一个质粒的存在完全阻止另一个质粒的复制,因而无法建立异源的质粒系统。
在链霉菌中已发现许多内源性质粒,有线状和环状之分,大小也相差很悬殊,小的有几千个碱基对,大的有几十万个碱基对。
从变铅青链霉菌中分离到的内源性质粒pIJ101是一个8.9kb的高拷贝质粒,由它衍生出的一系列质粒已成为链霉菌基因工程中应用最广泛的克隆载体。
但一些pIJ101的衍生质粒之间存在强的不相容性,无法在同一宿主中共存[8]。
有文献报道,某些链霉菌中的内源性质粒可以和一些质粒载体共存,如pKC1139可与生米卡链霉菌中的内源性质粒pSMY1共存[9];pIJ101系列的质粒可与球孢链霉菌中的内源性质粒pSGL1共存等[10]。
1.1.2DNase活力DNase能降解线状和环状DNA,强的DNase活力影响质粒的转化和分离[11]。
有关DNase在链霉菌限制修饰系统中的作用研究最多的是抗生链霉菌(S.antibioticus)和淡青链霉菌(S.glaucescens)[12,13]。
这两个链霉菌的无细胞提取液中都没有检测到II 型限制性内切酶活力,非特异的DNase在宿主对外源DNA的降解方面起主要作用。
抗生链霉菌胞外DNase主要定位于细胞壁和细胞膜之间,与此相类似,淡青链霉菌胞外DNase主要定位于细胞外膜。
DNase的合成受营养条件的限制,此外,Mg2+是维持其活性所必须的金属元素。
DNase对热比较敏感,用/热处理0可以部分灭活。
11113限制性内切酶已经在不同的链霉菌中发现超过33种II型限制性内切酶,但是否存在I型和III型限制性内切酶还未见报道。
来自链霉菌的一些II型限制性内切酶的基因已被克隆并在大肠杆菌中获得表达[14-17]。
这些限制性内切酶多数识别6个碱基,但也有识别8个碱基的如Sse8387I[16]。
表达限制性内切酶的宿主普遍对外源DNA具有较强的限制性。
通过识别外源DNA上特定的碱基序列,并从中切开,最终导致外源DNA被降解,致使转化或转染无法进行。
而细胞中同时存在的修饰酶(多为甲基化酶)则可将自身染色体上相同序列加以修饰而避免被降解。
限制修饰系统在链霉菌中广泛存在,这给链霉菌的基因操作带来很多困难。
对于如何克服链霉菌原生质体对外源DNA的限制修饰作用,科研人员也进行了许多有益的探索。
覃重军等人报道,来自标准宿主变铅青链霉菌TK24的质粒pIJ702无法转入吸水链霉菌应城变种10-22(S.hygrosco picus subsp.yingchen-gensis10-22)中,但来自弗氏链霉菌ATCC10745的pIJ702,却可以低频转化10-22原生质体。
原因可能是弗氏链霉菌ATCC10745和吸水链霉菌应城变种10-22之间存在相同修饰DNA的机制,因而通过弗氏链霉菌对pIJ702的修饰间接克服了吸水链霉菌对pIJ702的限制性障碍[18]。
朱春宝等在研究天蓝淡红链霉菌(S.coeruleorubidus)的转化系统时发现pIJ702无法直接转化天蓝淡红链霉菌的野生株SI-PI1482,但却可以很低的频率转化该菌的阻断变株N-18。
用从转化子中分离到质粒DNA再转化野生株SI PI1482,也获得成功[19]。
作者认为原因是诱变使表达限制酶的基因受到损伤而影响了限制酶的表达。
因此,通过异源宿主的修饰机制或采用突变株为中介宿主可能是克服质粒转化限制性障碍的有效措施。
另外下面将要提到到电穿孔、接合转移以及转导也能在一定程度上绕开宿主的限制性障碍。
112电穿孔利用高压脉冲电流将DNA导入细胞的方法称为电穿孔法,也称为电激法。
通过对细胞悬液和DNA的混合物施以瞬时高压脉冲电流,导致细胞膜上出现短暂的通道,外源DNA通过这些通道进入细胞。
该法在DNA转化动物细胞和植物原生质体中得到了广泛的应用。
在链霉菌中的应用实例比较少[20-25],涉及到的链霉菌有变铅青链霉菌(S.livi-dans)、龟裂链霉菌(S.rimosus)、小小链霉菌(S.par-vulus)、酒红链霉菌(S.vinaceus)、委内瑞拉链霉菌(S.venezuelae)、弗吉尼亚链霉菌(S.virginiae)、除虫链霉菌(S.avermitilis)和头状轮生链霉菌(Stre ptover-ticillium caes pitosus)等。
电击的对象有原生质体、经溶菌酶处理的菌丝、未经溶菌酶处理的菌丝体以及预萌发的孢子等。
影响电穿孔的一些因素有电脉冲的强度和时间、电击前菌丝体的预处理、电击时缓冲液的组成等。
但这些方法并不通用或者仅限于某种特定的链霉菌,如用于小小链霉菌和酒红链霉菌的电穿孔程序对变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌就不适用。
与PEG-介导的原生质体转化方法相比,电穿孔的程序相对简单、方便、快捷,是一种很有潜力的基因转移方法,但如何在链霉菌获得更为广泛而成功的应用,需要进一步的探索。
2接合转移研究人员很早就发现了质粒转移现象,但普遍认为质粒通过接合转移仅限于种属密切相关的细菌之间。
Tei w u-C uot等人突破了这一观念的束缚,他92们在体外构建了一种穿梭质粒,并通过接合转移成功地将此质粒从革兰氏阴性细菌大肠杆菌中转入到许多革兰氏阳性细菌中[26]。
随后科研人员进行了许多试验,并在种属关系相差很远的物种之间通过接合的方法实现了质粒的转移[27-29]。
在链霉菌中已发现许多具有自我转移性的质粒(sel-f transmissible plasmid),如pIJ101、SCP2*、SCP1、SLP1、SLP2、SLP3、pSAM2[30]、pSN22[31]、pSA1.1[32]等,这些质粒有共同的诊断性特征,即当质粒进入某个没有质粒的受体时,气生菌丝的发育受到过滤性抑制,这种现象叫做/麻点形成0,表型命名为Ltz+,也称为致死接合反应。
/麻点形成0这种肉眼可见的表观现象已被用于检测链霉菌中是否存在可转移性质粒、分离消除质粒的菌株、进行链霉菌种间的接合转移等方面。
赵书春等人通过这种方法甚至将大型线状质粒pHZ1000(230kb)和pHZ1001(90kb)从链霉菌T8-4中转入到异源宿主)))变铅青链霉菌ZX1中[33]。
通过对接合转移系统的研究,已从这些可转移质粒中分离到与接合转移有关的基因。
负责接合转移的基因可分为两类,一类是tra,负责质粒在链霉菌菌丝体之间的转移,其表达在转录水平上受到korA (traR)基因表达产物的调控[31];另一类是spd,表达产物为小分子的水溶性蛋白,麻点的形成需要spd 基因的活化,灭活spd基因则显著降低麻点的大小。
如质粒pSG5,它是一个可转移质粒,但不形成麻点,原因是pSG5中的spd基因无转录活性[34]。
以上从链霉菌中分离到的质粒转移仅限于同种或不同种的链霉菌之间。
Mazodoer等人于1989年报道了通过接合转移的方法把质粒DNA从大肠杆菌转移到变铅青链霉菌中,实现了质粒在大肠杆菌和链霉菌之间的跨属转移[28]。