转基因植物生产基因工程疫苗技术
利用植物生产疫苗研究进展
中表 达量 最 高 。
２ ． ２ 口 蹄 疫 病 毒
病， 是危 害人 类 健 康 的 主要 传 染 病 之 一 。以结 核
（ １ ） 目的 基 冈 的 克 隆 ； （ ２ ） 把 基 因 连 接 人 可 在
白、 结 核杆 菌 、 轮 状病 毒等 １ Ｏ多种 疫苗 。 ２ ． １ 乙型肝 炎病 毒
乙型肝 炎是 由 乙型 肝 炎 病 毒 （ ＨＢ Ｖ） 感染 引
植 物 中表 达 的载 体 上 ， 构建 高效 植 物 表 达 载 体 ；
Ｄ ＮＡ 侵 染 植 物 ， 其表达量较高 ， 但 因外 源 Ｄ ＮＡ
未整 合 到植 物核 基 因 内 ， 不 能 随 植 物 传代 。 不 稳
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ３ － ０ ８ — ０ ５
基 金项 目 ： 陕 西 省 教育 厅 专 项 科 研 计 划 资 助 ，Ｎｏ ．１ １ Ｊ Ｋ０ ６ １ ５ ；西 安市 科 技 局 发 展 引 导计 划 资 助 ，Ｎｏ ．ＮＣ ｌ ｌ ｌ ８ （ ３ ） ；国 家 级 大学 生创 新
应 用藻类 生产 疫苗是 研究 热点 。
１ 转 基 因植 物 疫 苗 的制 备 原 理 和 方
法
１ ． １ 转 基 因 植 物 疫 苗 研 制 的 一 般 过 程
２ 利 用植 物 生产 的疫 苗
目前 ， 在 转基 因植 物 中表达 的主 要有 乙 型肝
炎病毒表面抗原、 口蹄 疫 病 毒 、 狂 犬 病 病 毒 糖 蛋
（ ３ ） 通 过一定 的转基 因方 法将 外源基 因导入 植物 ， 使 植株 携带 特定 抗 原 的编 码 基 因 ， 实现 植 物 细胞 的遗传 转 化 ； （ ４ ） 受 体 细 胞 的组 织 培 养 与植 株 再
《转基因技术 》课件
技术进步：基 因编辑技术的 不断发展，如 CRISPR/Cas9
等
应用领域扩大： 从农业领域扩 展到医疗、环
保等领域
安全性提高： 加强对转基因 产品的安全性
评估和监管
伦理问题：需 要解决转基因 技术带来的伦 理和社会问题
PART FOUR
转基因食品的定义：通过基因工程 技术将外源基因导入到生物体中， 使其表达出特定的性状
,
汇报人：
CONTENTS
PART ONE
PART TWO
转基因技术：通过基因工程技术将外源基因导入到生物体中，使其表达出特定的性状。
原理：利用DNA重组技术，将目的基因与载体DNA连接，形成重组DNA，然后通过转化系统将重组 DNA导入到受体细胞中，使其表达出特定的性状。
应用：广泛应用于农业、医药、工业等领域，如转基因作物、转基因药物、转基因微生物等。
1982年，美国科学家保 罗·伯格首次将外源基因导 入动物细胞，开启了转基 因动物研究的新篇章
1983年，美国科学家玛 丽-克莱尔·金首次将外源 基因导入植物细胞，标志 着转基因植物研究的开始
1994年，美国科学家马 克·安德森首次将外源基因 导入人类细胞，开启了转 基因人类研究的新篇章
1973年，首次成功将细菌基因转入大肠杆菌 1982年，首次成功将外源基因转入植物细胞 1983年，首次成功将外源基因转入动物细胞 1994年，首次成功将外源基因转入人类细胞 2000年，首次成功将外源基因转入人类胚胎干细胞 2013年，首次成功将外源基因转入人类胚胎干细胞量：通过 转基因技术可以 提高作物的产量， 增加农民收入
减少农药使用： 转基因作物可以 抵抗病虫害，减 少农药使用，降 低环境污染
改善品质：转基 因技术可以改善 作物的品质，提 高农产品的市场 竞争力
转基因技术及农业生产应用
转基因技术及农业生产应用
转基因技术是一种基因工程技术，通过将外源基因导入到目标生物体的染色体中，使其获得新的遗传特征或功能。
在农业生产中，转基因技术已经被广泛应用，以改善农作物的产量、耐病性和营养价值等方面。
以下是转基因技术在农业生产中的一些应用：
1. 抗虫技术：转基因作物可以通过导入具有抗虫特性的基因，使作物获得对特定虫害的抵抗能力。
例如，将产生杀虫蛋白的基因导入到作物中，可以减少对农药的依赖，并降低害虫对作物的危害。
2. 抗病技术：转基因作物可以通过导入抗病基因，提高作物对病原微生物的抵抗能力。
这些基因可以来自其他植物或微生物，具有抑制病原体生长、产生抗菌物质等功能。
3. 耐逆性技术：转基因作物可以通过导入耐逆性基因，增强作物对环境胁迫（如干旱、盐碱等）的耐受性。
这些基因可以帮助作物在恶劣环境下生长和发育，提高产量和生存能力。
4. 营养改良技术：转基因作物可以通过导入特定的营养相关基因，
增加作物的营养价值。
例如，将富含维生素的基因导入作物中，可以增加作物的维生素含量，提供更健康的食物选择。
5. 延长保鲜期技术：转基因技术可以用于改变作物的果实成熟和衰老过程，延长其保鲜期。
这有助于减少食物的浪费，提高作物的市场可存储性和质量。
需要注意的是，转基因技术在农业生产中引起了一些争议和关注，主要是与食品安全、环境影响和农业可持续性等问题相关。
因此，在转基因作物的开发和使用过程中，需要严格的监管和评估，以确保其安全性和可行性。
转基因植物
载体介导法
➢ T-DNA区可高效整合到植物受体细胞的 染色体上并得到表达。利用这一特点， 将目的基因转入Ti质粒的T-DNA区构建 根瘤农杆菌的转化载体。
一、转基因植物
通过植物基因工程获得转基因植物在农 业生产发展及植物分子生物学研究中有 十分重要的意义，已获得的有重大经济 价值的转基因植物已经很多。
一、转基因植物
基因工程： 就是重组DNA技术，指在体 外将不同来源的DNA进行剪切和重组， 形成杂合DNA或成嵌合DNA分子，然后将 其导入特定的宿主细胞从而得到大量扩 增和表达，使宿主细胞获得新的遗传特 性，产生新的基因产物。
载体介导法
Vir区（virulence region）： ➢ 该区段上的基因能激活T-DNA转移，
使农杆菌表现出毒性，故称之为 毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒 DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质 粒DNA的三分之一。
Ti质粒的基因位点及其功能区域
➢ T-DNA区（transferred-DNA regions）：
产生白化苗，且由于 PEG法对原生质体活力 有害，转化率低。
应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡
椒等植物的转基因植株。
一、转基因植物
载体介导法 具体方法有农杆菌介导法、病毒介导法。 农杆菌介导可采用“共培养法”，(见
书本图10-1 B)，有根癌农杆菌和发根农 杆菌两种载体系统。
载体介导法
以野生型根癌农杆菌载体系统为例： ➢ 野生型根癌农杆菌Ti质粒大小约200-
基因工程的主要过程,并讨论基因工程技术的意义
基因工程的主要过程基因工程是一项集合了生物学、生物化学、分子生物学和遗传学等多学科的综合性技术，它利用基因重组和修饰等手段，对生物体的基因进行改造和调控，以实现人为控制基因的表达和功能的目的。
基因工程技术的应用广泛，它已经在医学、农业、工业等领域展现出重要的意义和潜力。
基因工程的主要过程基因工程的主要过程可以大致分为以下几个步骤：1.选择目标基因和宿主：在进行基因工程前，需要选择一个特定的基因作为目标基因，并确定一个适合的宿主生物体进行基因重组。
目标基因可以是具有特定功能或特性的基因，在基因工程中会被改造和调控以实现特定的目的。
宿主生物体通常是一种可以被人们较好地控制和操作的微生物、植物或动物。
2.克隆目标基因：克隆是基因工程的基础步骤之一。
通过使用一系列的分子生物学手段，包括PCR、限制性酶切、连接等技术，将目标基因从其来源中分离并进行放大。
克隆目标基因的目的是为了在后续的步骤中进行基因重组和修饰。
3.基因重组和修饰：在基因工程中，重组和修饰是至关重要的步骤。
重组是将目标基因与其他DNA片段进行连接，构建起新的DNA序列。
修饰是指对重组后的DNA进行进一步的改造，例如插入或删除一些基因片段，改变基因的顺序或结构，以及调控基因的表达等。
4.转化宿主生物体：一旦完成了基因重组和修饰，接下来的步骤是将修改后的基因导入到选择的宿主生物体中。
这个过程称为转化。
转化可以通过多种方法实现，包括细胞质融合、化学方法、电穿孔、冷冻-解冻等等。
成功转化后，目标基因将会被宿主生物体继承并表达。
5.筛选和鉴定：转化后的宿主生物体通常不都具有目标基因的特性或功能。
因此，在转化后的生物体中需要进行筛选和鉴定。
这可以通过一系列的分子生物学和生物化学技术来实现，例如PCR、限制性酶切、蛋白质表达分析等方法。
6.表达和生产：最后一步是让转化后的宿主生物体表达和产生目标基因所带来的特性或功能。
这可以是一个基因在植物中表达特定的蛋白质，将药物基因导入细胞，或者是增强农作物的产量和抗病性等等。
植物基因工程技术的研究与应用
植物基因工程技术的研究与应用 随着生物技术的兴盛，植物基因工程技术成为了农业科技领域中的一个热门话题。植物基因工程技术的研究和应用已经取得了令人瞩目的成就。本文将主要介绍植物基因工程技术的研究现状、应用前景以及可能会带来的好处和问题。
一、植物基因工程技术的研究现状 植物基因工程技术是一种通过改变植物基因组的方法，使其具有一些新的性状或者改进原有的性状的技术。这种技术早在20世纪80年代末期就得到了广泛的实践和研究，并且在如今已经得到了广泛的应用。
植物基因工程技术的主要研究内容包括：1.获取目的基因；2.改造外源基因；3.构建植物表达载体；4.将目的基因引入植物；5.筛选并鉴定转基因植物；6.进行田间试验，验证转基因植物的耐性和生物安全性。
当前，植物基因工程技术的研究重点主要是四个方面:1.提高植物产量和品质；2.提高植物抗性和适应性；3.提高植物的营养价值；4.提高植物的药用价值。其中，重要作物如水稻、小麦、玉米、大豆等，是植物基因工程技术的研究方向和热点。
二、植物基因工程技术的应用前景 植物基因工程技术在农业生产中具有广泛的应用前景。目前已经推出了许多具有实际生产应用价值的转基因植物，比如转基因水稻、转基因玉米等。
1.提高植物抗病性和适应性 由于植物具有低抗性和不适应性，常常会被一些病菌侵袭或者在一些极端环境的情况下无法正常生长。而通过植物基因工程技术，可以增强植物的抗病和适应能力，从而减少病菌的侵染和潜在的风险。
2.提高植物营养价值和药用价值 目前，世界上存在着很多健康问题和营养问题。通过植物基因工程技术，可以推出更加营养丰富的食品，也可以探索新的植物物质，进而更好地解决人类营养与健康问题。此外，新的药用品种的开发也是植物基因工程技术的研究方向之一，比如超丝兔茅等植物素类药物。
3.解决食物短缺问题 随着人口的增长，未来将出现一定程度上的食物短缺问题。通过植物基因工程技术，可以进一步提高食物产量和品质，以此解决食物短缺问题。
植物基因工程的应用前景
植物基因工程的应用前景随着科技的进步和人类对生物领域的深入研究，植物基因工程技术逐渐引起人们的关注。
植物基因工程是一项利用分子生物学和基因组学技术来改变植物遗传组成以增加其产量、改善农产品质量和增强对环境逆境的抵抗力的技术。
本文将探讨植物基因工程的应用前景，并着重介绍其在农业、医药和环境保护领域中的潜力。
一、农业领域的应用前景在农业生产中，植物基因工程技术为农民提供了一种改良作物的新途径。
通过选择遗传优秀的基因并将其导入目标植物，可以增加植物的农产品产量和品质。
例如，利用基因工程技术改良水稻和小麦的抗病性，可以减少农药的使用量，并有效避免由于病害引起的产量损失。
此外，利用基因工程技术改良作物的耐旱性和耐盐性，可以有效应对全球气候变化及干旱地区的农作物生产问题。
二、医药领域的应用前景植物基因工程技术在医药领域的应用也具有广阔的前景。
植物能够产生一些具有药用价值的化合物，例如，阿司匹林就是通过从树皮中提取的柳树素分离而得。
利用基因工程技术，可以在植物中导入制药相关的基因，使其产生特定的药物。
通过这种方法，不仅可以降低药物生产成本，还有助于解决传统药材资源短缺的问题。
此外，植物基因工程技术还可用于生产疫苗，例如，利用转基因植物制备疫苗免疫草履虫病。
三、环境保护领域的应用前景植物基因工程技术在环境保护领域的应用也备受瞩目。
植物具有修复土壤和水环境的能力，利用基因工程技术可以提高植物的这种修复能力。
例如，转基因植物可以用于吸收土壤中的重金属污染物，将其积累在植物体内，减少对环境和人体的危害。
此外，植物基因工程技术还可用于改善植物对氮、磷等营养元素的利用效率，减少农业生产过程中的土壤和水资源的浪费。
总结起来，植物基因工程技术在农业、医药和环境保护领域具有广泛的应用前景。
通过应用这一技术，可以提高农作物的产量和质量，减少农业生产成本，改善医药资源供给，促进环境保护和可持续发展。
然而，我们也需要注意植物基因工程技术的安全性和道德性，避免对自然生态和人类健康带来不利影响。
转基因技术的名词解释_主要分类_技术原理
转基因技术的名词解释_主要分类_技术原理转基因技术的名词解释转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。
基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。
DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。
该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。
转基因技术的主要分类转基因过程按照途径可分为人工转基因和自然转基因，按照对象可分为植物转基因技术、动物转基因技术和微生物基因重组技术。
人工转基因将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术(Transgene technology)。
人们常说的“遗传工程”、“基因工程”、“遗传转化”均为转基因的同义词。
如今，改变动植物性状的人工技术往往被称为转基因技术(狭义)，而对微生物的操作则一般被称为遗传工程技术(狭义)。
经转基因技术修饰的生物体在媒体上常被称为“遗传修饰过的生物体”(Genetically modified organism，简称GMO)。
自然转基因不是人为导向的，自然界里动物、植物或微生物自主形成的转基因现象，例如慢病毒载体里的乙型肝炎病毒DNA整合到人精子细胞染色体上、噬菌体将自己DNA的插入到溶源细胞DNA上，农杆菌和花椰菜花叶病毒(CMV)等。
植物转基因植物转基因是基因组中含有外源基因的植物。
它可通过原生质体融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程技术获得，有可能改变植物的某些遗传特性，培育高产、优质、抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗除草剂等的作物新品种，如玉米稻、北极鳄梨、转基因三倍体毛白杨。
而且可用转基因植物或离体培养的细胞，来生产外源基因的表达产物，如人的生长激素、胰岛素、干扰素、白介素2、表皮生长因子、乙型肝炎疫苗等基因已在转基因植物中得到表达。
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第23卷 第2期 中 国 预 防 兽 医 学 报 Vol.23, No.2 2001年3月 Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine Mar. 2001转基因植物生产基因工程疫苗技术吴建祥,周继勇,于 翠(浙江大学动物预防医学研究所,杭州 310029)摘要 用转基因植物生产有用的外源蛋白是一个有吸引力的廉价生产系统,它可能替代传统的外源蛋白生产体系。
通过外源基因的瞬时表达或稳定表达方式,多种基因工程疫苗已在植物中表达成功,并保持良好的免疫原性。
本文概要介绍了国内外利用转基因植物生产疫苗的研究现状,并对转基因植物生产疫苗的潜在优势、存在的问题及其相关技术作一综述。
关键词 转基因植物; 外源蛋白; 基因工程疫苗; 载体中图分类号 Q78; 文献标识码 B 文章编号 1008-0589(2001)02-0157-03 转基因植物生产疫苗是Mas on于1992年提出的。
该技术是利用分子生物学技术把重组的疫苗基因导入植物,并使植物能够大量表达的一类生物技术。
利用该技术国外至今已获得成功的有乙型肝炎表面抗原、不耐热的肠毒素B亚单位(LT-B)、诺沃克病毒外壳蛋白(N orwalk virus)、流感病毒血凝素和艾滋病病毒抗原、口蹄疫病毒抗原和鼻病毒抗原、疟疾抗原等10多种疫苗[1～7]。
国内在利用转基因植物或病毒载体生产疫苗的研究方面还远远滞后于其它国家,有关论文报道甚少[8～11]。
1 植物作为制备基因工程疫苗生物反应器的优势1.1 原核表达系统不能对表达产物进行准确的翻译后加工和蛋白糖基化,而植物与动物细胞表达系统,可对表达产物进行糖基化、酰氨化、磷酸化、亚基的正确装配等转译后加工,使表达产物具有良好的免疫原性和生物活性。
1.2 细菌在发酵过程中常产生一些不溶性聚合物,其要重新溶解并折叠成天然蛋白质则需要很高的成本,且发酵需要庞大设备投资;转基因植物则不存在这类问题,且植物所需要的仅是阳光和来自土壤或肥料的矿物质营养及水分。
1.3 与动物细胞培养相比,植物细胞培养条件简单,成本低廉,且具有全能性,能再生植株,基因一旦稳定整合便可长期使用。
另外,植物细胞中绝对不会含有潜在的动物或人类病原。
1.4 转基因植物中的外源基因可通过植物杂交的方法进行基因重组而达到在植物体内积累多基因的目的。
1.5 重组基因工程疫苗可长期稳定的储存于植物器官或组织,有利于保存和运输。
1.6 利用转基因植物生产口服疫苗,可减去纯化过程,降低生产成本,使用方便。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(批准号:30070570) 收稿日期:2000-09-252 转基因植物生产疫苗技术分离克隆的抗原基因必须通过适当的方法转移到植物中才能生产植物疫苗。
所以,将外源基因稳定的导入农作物体内(即植物遗传转化)是植物基因工程疫苗生产的关键。
外源基因一般不能主动转移到植物细胞中,需要适当的转化方法,并借助恰当的载体才能转移到植物的基因组中。
转化成功与否以及转化效率的高低,很大程度上取决于良好受体再生系统的建立,同时对不同物种也要采用不同的转化方法[12,13]。
因此,植物遗传转化的受体系统、载体系统和遗传转化方法是转基因植物基因工程疫苗生产技术的关键。
2.1 植物遗传转化的受体系统及其特性2.1.1 植物组织受体系统: 受伤的细胞容易受到病毒或质粒的感染。
这些病毒或质粒上的某些DNA通过各种不同的方式转移到受伤的植物细胞,并形成愈伤组织。
愈伤组织可以培养成完整的转化植株。
该受体系统转化率高,可获得较多的转化植株,取材广泛、适用性广。
但再生植株无性系变异较大,转化的外源基因稳定性差,嵌合体多。
2.1.2 植物细胞原生质体: 是植物细胞除去细胞壁后的部分,是一个质膜包围的“裸露细胞”。
原生质体在合适的条件下具有分化、繁殖并再生成完整植株的能力,具有全能性。
原生质体在体外比较容易完成一系列细胞操作或遗传操作,互相之间可以发生细胞融合,而且还可以直接高效的捕获外源基因。
但缺点是嵌合体少,遗传稳定性更差,培养周期长,难度大,再生频率低。
2.1.3 生殖细胞受体系统: 是以植物生殖细胞如:花粉细胞、卵细胞为受体细胞进行基因转化的系统。
目前主要以两个途径利用生殖细胞进行基因转化:一是利用组织培养技术进行花粉细胞和卵细胞的单倍体培养,诱导愈伤组织细胞,进一步分化发育成单倍体植株,从而建立单倍体的基因转化系统;二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化,如花粉管导入法、花粉粒浸泡法、子房微针注射法等。
由于该受体系统与其它受体系统相比有许多优点,如:具有全能性的生殖细胞直接为受体细胞,具有更强的接受外源DNA 的潜能,一旦将外源基因导入这些细胞,犹如正常的受精过程会收到“一劳永逸”的效果;利用植物自身的受粉过程,具有操作方法方便、简单。
不足之处是利用该受体系统进行转化受到季节的限制,只能在短暂的开花期进行,且无性繁殖的植物不能采用。
2.2 植物遗传转化的载体系统 作为植物遗传转化的载体必须是能进入宿主细胞内进行复制和表达的核酸分子。
目前的载体系统有病毒的载体系统和质粒的载体系统两大类。
2.2.1 病毒载体系统: 植物病毒作为植物遗传转化的载体系统是由植物病毒的侵染特性所决定的。
以病毒作载体的表达系统为瞬时表达系统,其一般不能把外源基因整合到植物细胞基因组中。
植物病毒的感染率很高,在较短时间内可获得较大的表达量。
但因以病毒为载体的表达系统每个宿主材料都要接种病毒载体,故瞬时表达系统不易起始。
作为病毒载体的病毒最好是双链DNA植物病毒。
目前已有十几种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋白表达载体中;包括椰菜叶病毒(CaM V)、烟草花叶病毒(T M V)、豇豆花叶病毒(CP M V)和马铃薯X病毒(PVX)等。
其中在T M V载体中成功表达的外源病毒至少有150种以上。
2.2.2 农杆菌质粒载体系统: 质粒载体系统中最常用的质粒有:T i质粒和Ri质粒。
T i质粒存在于根癌农杆菌(Agrobacterium tumef aciens)中,Ri质粒存在于发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenis)中。
T i质粒和Ri质粒在结构和功能上有许多相似之处,具有基本一致的特性。
但实际工作中,绝大部分采用T i质粒。
农杆菌质粒是一种能实现DNA 转移和整合的天然系统[14～18]。
T i质粒有两个区域:T-DNA 区(是质粒上能够转移整合入植物受体基因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘿瘤的发生,且可通过减数分裂传递给子代的区域)和Vir区(编码能够实现T-DNA转移的蛋白)。
T-DNA长度为12～24kb之间,两端各有一个含25bp重复序列的边界序列,在整合过程中左右边界序列之间的T-DNA可以转移并整合到宿主细胞基因组中[18,19],研究发现只有边界序列对DNA的转移是必需的,而边界序列之间的T-DNA并不参与转化过程,因而可以用外源基因将其替换。
Vir区位于T-DNA以外的一个35kb内,其产物对T-DNA的转移及整合必不可少。
农杆菌侵染植物首先是吸附于植物表面伤口,受伤植物分泌的酚类小分子化合物可以诱导Vir基因的表达[20]。
Vir产物能诱导T i质粒产生一条新的T-DNA单链分子。
此单链分子从T i质粒上脱离后,可以与Vir产物VIRD2蛋白共价结合,并在VIRD4和VIR B等蛋白的帮助下从农杆菌进入植物细胞的染色体中。
由于野生型T i质粒过于庞大,约200～800kb,为了便于重组DNA操作,研究人员对T i质粒进行了改造从而构建一系列合适的T i衍生载体。
首先除掉了野生型T i质粒T-DNA 区的一段DNA片段[21]。
例如:参与植物生长素和细胞分裂素的基因(这些基因过度表达植物激素,从而破坏受体细胞和激素产量)。
此外需在T i质粒上加上 E.Coli复制起始位点,使得插入外源基因的T i质粒在为一个穿梭载体,不但可在农杆菌中复制,而且便于在 E.Coli中重组操作与保存。
2.3 植物转化载体系统(包括一元载体系统和双元载体系统) 人们在研究中发现在T-DNA转移过程中,Vir基因并不一定与T-DNA位于同一个质粒上,于是通过构建中间载体解决了T i质粒不能直接导入目的基因的困难。
大肠杆菌具有能与农杆菌高度接合转移的特性,因此研究者可以将T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中,并插入外源基因,最后通过接合转移把上源基因引入到农杆菌的T i质粒上。
这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T-DNA引入T i质粒的有效方法。
带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒的衍生载体称为“中间载体”(intermediate vector),而接受中间载体的T i质粒则称为受体T i质粒(acceptor T i plasmid),一般是卸甲载体(disarmed vector)。
所谓卸甲载体就无毒T i 质粒载体。
因为利用野生型的T i质粒作载体时影响植株再生的直接原因是T-DNA中onc基因的致瘤作用。
因此为了使野生型的T i质粒成为基因转化的载体,必须切除T-DNA 的onc基因,而“解除”其“武装”,构建成所谓的“卸甲”或称“缴械”载体。
在这种onc-载体中已经缺失的T-DNA部分被大肠杆菌的一种常用质粒pBR322取代。
这样任何适合于克隆在pBR322质粒的外源DNA片段都可以与pBR322质粒DNA同源重组,而被其整合到onc-T i质粒载体上。
中间载体通常是多拷贝的 E.coli小质粒,这一点对T i通过体外操作导入外源基因是非常必要的。
从结构特点看可分为两类中间载体:即共整合系统中间载体和双元系统中间载体[22]。
根据两类中间载体,目前已开发出两类转化体系:一类是一元载体系统(整合载体系统),这一类载体系统由一个共整合系统中间表达载体与改造后的受体T i质粒组成。
在农杆菌内,通过同源重组将外源基因整合到修饰过的T-DNA 上,形成可穿梭的共整合载体,在Vir基因产物的作用下完成目的基因向植物细胞的转移和整合。
但这类方法构建困难,整合体形成率低,一般不常用。
另一类转化体系是双元载体系统[23],它由两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变T i质粒即:微型T i质粒(mi2 ni-T i plasmid)和辅助T i质粒(helper T i plasmid)构成,T-DNA和Vir基因在两个独立的质粒上,通过反式激活T-DNA转移到植物细胞基因组内。
微型T i质粒就是含有T-DNA边界缺失Vir基因的T i质粒,为一个广谱质粒。
它含有一个广泛寄主范围质粒的复制起始位点(OriV),同时具有选择性标记基因。
辅助质粒为含有Vir区段但T-DNA缺失的突变型质粒,完全丧失了致瘤的功能。