拓扑异构酶I的结构特点及其抑制剂研究进展
UGT1A1研究进展
UGT1A1研究进展JSurgConceptsPract2008，Vol.13，No.4 伊立替康自20世纪90年代问世以来，已广泛应用于结肠直肠癌、肺癌等实体瘤治疗，可明显提高病人的总生存期，但因其毒性较大(Ⅲ~Ⅳ度腹泻和粒细胞缺乏)，应用受到限制。
伊立替康毒性与其主要的药物代谢酶UGT1A1有关，而其酶活性高低又受UGT1A1基因多态性的影响。
现就伊立替康的代谢、作用机制、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(uridinediphosphateglucuronosyltransferase，UGT)基因多态性及其与疗效、毒性关系进行综述。
伊立替康代谢及作用机制伊立替康系喜树碱半人工合成物，喜树碱及其衍生物以两种可相互转化的形式存在:①pH值依赖的生物活性形式-- -内酯;②非活性形式-- -羟化物。
较低的pH值可促进喜树碱向内酯形式转化。
伊立替康进入体内可经羧酸酯酶(carboxylesterases)转化为SN-38(活性形式)，后者为拓扑异构酶Ⅰ抑制剂，可抑制DNA单链断裂后修复，干扰DNA 复制和转录，导致肿瘤细胞死亡[1] 。
SN-38在血液中循环时，上述平衡也受到SN-38内酯与血清白蛋白优先结合的影响。
伊立替康代谢的主要特征包括羧酸酯酶分解药物水溶性部分产出拓扑异构酶Ⅰ抑制剂SN-38和CYP3A4介导的氧化作用使其变为APC非活性代谢产物，SN-38主要经UGT家族特别是肝内的UGT1A1和UGT1A7灭活为葡萄糖醛酸产物(SN-38G) [2] ，然后经胆汁排泄入肠道，在肠道细菌β- 葡萄糖醛酸酶转换为SN-38，引发肠黏膜损伤及迟发性腹泻;而肠道内的UGT1A1又可再度催化SN-38为SN-38G而解毒(见图1)。
早有多个重要的临床试验(样本数为20~118)表明遗传因素可能在伊立替康药物代谢、分布及毒性中起重要作用，尤其是启动子区TA序列重复次数，如TA由6→7 (UGT1A1*28)基因变异能引起UGT1A1表达下降，减少了SN-38转化为SN-38G，使伊立替康引起严重腹泻和粒细胞减少的风险增加[3，4] 。
UGT1A1基因多态性与伊立替康化疗毒性关系的研究进展
㊃综述㊃通信作者:徐亮,E m a i l :L w s 0114@y a h o o .c o m.c nU G T 1A 1基因多态性与伊立替康化疗毒性关系的研究进展陈文兴,徐 亮,綦晓龙(四川医科大学附属第一医院胃肠外科,四川泸州646000) 摘 要:消化道肿瘤是严重威胁人类健康的常见肿瘤,目前消化道肿瘤治疗方案多为根治性手术切除后辅以化学治疗㊂既往消化道肿瘤化疗方案以5-氟尿嘧啶(5-F u )或其衍生物为主㊂而近年来研制出如伊立替康㊁奥沙利铂等细胞毒类药物,使消化道肿瘤患者化疗效果有了很大提高㊂含伊立替康的化疗方案,治疗效果明显㊂但同时可能发生严重毒性反应,如严重延迟性腹泻㊁中性粒细胞减少等㊂以往对伊立替康所致严重毒性反应分子水平研究较少㊂近来大量分子水平研究表明伊立替康化疗严重毒性反应与其代谢过程的某些酶基因多态性相关㊂关键词:消化系统肿瘤;伊立替康;D N A 拓扑异构酶类,Ⅰ型;基因多态性;药物毒性中图分类号:R 735 文献标识码:A 文章编号:1004-583X (2016)01-0112-05d o i :10.3969/j.i s s n .1004-583X.2016.01.029 伊立替康为半合成水溶性喜树碱,为D N A 拓扑异构酶Ⅰ(T o p o i s o m e r a s eT O P O Ⅰ)抑制剂,作用于细胞周期S 期,通过与D N A 形成裂解复合物导致D N A 链断裂,导致肿瘤细胞死亡而发挥抗肿瘤活性㊂伊立替康抗肿瘤普广,现已用于胃癌㊁结直肠癌㊁肺癌等实体肿瘤的治疗[1]㊂尤其是在消化道肿瘤的治疗方面,伊立替康联合氟尿嘧啶治疗结直肠癌可以延长患者生存期[2]㊂但是,伊立替康的应用受其剂量限制性毒性的影响,尤其是严重的延迟性腹泻和骨髓抑制㊂因此各国学者就伊立替康代谢机制㊁毒性相关因素进行了大量研究,结果显示参与伊立替康代谢过程的某些酶基因多态性可能影响伊立替康的毒性,其中研究最多的是尿苷二磷酸葡苷酸转移酶1A 1(U r i d i n e D i p h o s p h a t e G l u c u r o n o s y l t r a n s f e r a s e 1A 1,U G T I A I )㊂我们就伊立替康毒性与U G T I A I 基因多态性关系研究进展综述如下㊂1 伊立替康1.1 伊立替康结构及体内代谢过程 伊立替康为可溶性喜树碱类似物,主干结构类似喜树碱的五环化学结构,在五环结构的C 7和C 10分别加入一个乙基和双六氢吡啶酸链,从而使其具有水溶性㊂在水溶液中伊立替康有内酯和羧基两种形式,且呈动态平衡,平衡常数受P H 值影响㊂在酸性环境下,偏向内酯形式㊂一般认为内酯形式是其活性形式,而羧基形式对拓扑异构酶(T O P O )没有抑制作用㊂伊立替康主要在肝脏代谢,在肝内经高亲和性羧酸酯酶(C a r b o x y l e s t e r a s eC E S )水解脱去C 10基团,形成活性代谢产物7-乙基-10-羟基喜树碱(7-e t h y l -10-h y d r o x y c a m p t o t h e c i n ,S N -38),S N -38的细胞毒活性较伊立替康原药增强100~1000倍㊂随后伊立替康及S N -38经血液循环到达肿瘤细胞,作用于拓扑异构酶而发挥抗肿瘤作用㊂剩余S N -38经血液循环到达肝脏,在肝内经U G T I A I 介导醛酸化成无活性的S N -38葡糖甘酸(S N -38G )后经胆道系统排入肠道㊂在肠道内伊立替康及其代谢产物又可经细菌β-葡萄糖醛酸酶作用转化为S N -38,继而引起肠黏膜损伤和延迟性腹泻[3]㊂1.2 伊立替康抗肿瘤机制及应用价值 拓扑异构酶通过催化D N A 拓扑结构转变而影响细胞D N A 的复制㊁转录等生命过程[4]㊂拓扑异构酶在肿瘤细胞中高水平表达,因此抑制D N A 拓扑异构酶的活性就能抑制肿瘤细胞增殖,使肿瘤细胞凋亡㊂拓扑异构酶抑制剂进入细胞后通过氢键和分子间疏水键作用与T O P OⅠ-D N A 复合物共价结合形成相对稳定的T O P O1-药物-D N A 复合物,导致D N A 链的断裂,抑制D N A 修复,促进细胞凋亡㊂伊立替康作为T O P OI 抑制剂,它将T O P OI 转变成对D N A 有害的物质,即T O P OI 的浓度越高,对药物就越敏感㊂研究表明大肠癌㊁宫颈癌㊁卵巢癌等肿瘤细胞内的T O P OI 含量远高于正常组织,尤其在S 期肿瘤细胞中活性大幅度提高㊂因此,T O P OI 抑制剂可以选择性作用于增殖期肿瘤细胞,抑制D N A 复制,发挥抗肿瘤活性㊂1.3 伊立替康毒性反应 伊立替康毒性反应有延迟性腹泻,骨髓抑制,肝肾功能损害,急性乙酰胆碱能综合征等㊂特别是其剂量限制性毒性:延迟性腹㊃211㊃‘临床荟萃“ 2016年1月5日第31卷第1期 C l i n i c a l F o c u s ,J a n u a r y 5,2016,V o l 31,N o .1Copyright ©博看网. All Rights Reserved.泻和骨髓抑制㊂日本有3㊁4级延迟性腹泻和骨髓抑制至患者死亡的报道[5]㊂国内也有类似报道[6]㊂故我们需深入研究其毒性反应发生机制及处理措施,及时发现㊁干预,避免此类悲剧的再发生㊂1.3.1延迟性腹泻延迟性腹泻指应用伊立替康24小时后出现的腹泻,为剂量限制性毒性㊂常发生在用药后第5天[7]㊂严重延迟性腹泻致化疗终止㊁进而影响其疗效,国外报道接受伊立替康治疗后因出现3~4级延迟性腹泻而导致化疗方案提前终止者约40%[8]㊂而国内许多学者研究显示,伊立替康致3~4级延迟性腹泻的发生率为5.9%~ 20.0%[9-10]㊂其机制可能是经胆道排入肠道的伊立替康及代谢产物在C E S和β-葡萄糖苷酸酶的作用下转化为S N-38㊂而S N-38可以通过干扰D N A的T O P OⅠ而对肠黏膜产生损伤[11],肠道吸收功能障碍,干扰体内电解质平衡,导致延迟性腹泻的发生㊂1.3.2骨髓抑制伊立替康及其代谢产物抑制D N A复制,杀伤肿瘤细胞的同时也导致正常细胞的损伤,从而引起骨髓抑制㊂伊立替康所致骨髓抑制高峰为用药后第8天㊂发生率高,主要表现为白细胞及中性粒细胞减少㊂然而伊立替康引起的骨髓抑制是可逆转㊁非蓄积的,故使用前后需监测血常规变化㊂国外一项Ⅱ期临床试验研究,采用联合伊立替康㊁5-氟尿嘧啶(5-F u)㊁亚叶酸钙(C F)组成F O L F I R I 方案治疗54例晚期结直肠癌患者,其中3~4级中性粒细胞减少的发生率为61%[12]㊂由此可见,伊立替康致骨髓抑制发生率高,尤需注意3~4级中性粒细胞减少的发生,及时给予处理㊂2U G T1A1基因多态性U G T1基因定位于2q37,至少有13个不同的启动子序列,其第1个外显子剪接成共有外显子2~5,形成具有特殊N末端和保守C末端结构域的不同亚型㊂U G T1A1为其一个亚型,是唯一与胆红素葡萄糖醛酸化生物途径相关的亚型㊂U G T1A1基因变异有插入㊁缺失㊁单核苷酸多态性等㊂U G T1A1基因变异可导致U G T1A1表达减少,从而引起药物及胆红素代谢障碍,致使药物毒性增加,导致C r i g l e r-N a j j a r 综合征或G i l b e r t综合征的发生[13]㊂U G T1A1基因位点的改变多达50余种,其中U G T1A1*28和U G T1A1*6基因多态性与伊立替康化疗毒性反应和疗效关系尤受关注[14]㊂U G T1A1基因启动子区存在大量T A碱基重复序列, U G T1A1*1为6个T A重复序列,即(T A6/T A6或*1/*1);U G T1A1*28为7个T A重复序列,包括纯合型(T A7/T A7或*28/*28)和杂合型(T A6/T A7或*1/*28)㊂随着T A重复序列数目的增加, U G T1A1表达下降,使用伊立替康后其代谢产物S N-38转化为S N-38G减少,S N-38过度累积,引起严重的伊立替康相关毒性[15]㊂U G T1A1基因多态性情况,见表1㊂表1U G T1A1基因多态性等位基因核苷酸改变氨基酸改变类型外显子U G T1A1*1野生型---U G T1A1*2879d e l13平截缺失突变2 U G T1A1*31124CңT S375F错义突变4 U G T1A1*41069CңT Q357X无义突变3 U G T1A1*5991CңT Q331d e l44132n t缺失2 U G T1A1*6221GңA G71R错义突变1 U G T1A1*7145TңG Y486D错义突变5 U G T1A1*8625CңT R209W错义突变1 U G T1A1*9992AңG Q331R错义突变2 U G T1A1*101021CңT R341X无义突变3 U G T1A1*11923GңT G308E错义突变2 U G T1A1*12524TңA L175Q错义突变1 U G T1A1*13508d e l3F170d e l缺失突变1 U G T1A1*14826GңC G276R错义突变1 U G T1A1*15529TңC C177R错义突变1 U G T1A1*161070AңG O357R错义突变3 U G T1A1*171143CңG S381R错义突变4 U G T1A1*181201GңC A401P错义突变4 U G T1A1*191005GңA W335X错义突变3 U G T1A1*201102GңA A368T错义突变4 U G T1A1*211223i n sG移码移码突变4 U G T1A1*22875CңT A292V错义突变2 U G T1A1*231282AңG K426E错义突变4 U G T1A1*241309AңT K437X错义突变5 U G T1A1*25840CңA C280X错义突变1 U G T1A1*26973d e lG移码移码突变2 U G T1A1*27686CңA P229Q错义突变1 U G T1A1*28T A A T A7转录插入突变启动子U G T1A1*291099CңG R367G错义突变1 U G T1A1*3044TңG L15R错义突变1 U G T1A1*3111609C CңG T P387R2n t丢失4 U G T1A1*321006CңT R336W错义突变3 U G T1A1*33881TңC1294T错义突变2 U G T1A1基因多态性在种族间分布存在差异性㊂U G T1A1*28/*28在非洲人和高加索人中的频率分别为12%~27%和5%~15%㊂而在亚洲人中仅为1.2%~5%[16]㊂一项汉族人U G T1A1基因分布频率研究发现U G T1A1*1/*1占79.7%, U G T1A1*1/*28占15.6%,U G T1A1*28/*28占4.7%[17]㊂N9741试验报道显示U G T1A1*28/ *28在黑种人较白种人更多见(14%v s.9%)[18]㊂最新调查发现即使在亚洲,U G T1A1*28/*28的分布亦存在差异,其中在印度人约为8%,中国人约为4%[19]㊂由于其分布差异,导致各种族患者使用伊立替康后严重毒性反应发生率存在差异㊂㊃311㊃‘临床荟萃“2016年1月5日第31卷第1期 C l i n i c a l F o c u s,J a n u a r y5,2016,V o l31,N o.1Copyright©博看网. All Rights Reserved.3U G T1A1基因多态性与伊立替康毒性反应关系伊立替康的活性产物S N-38作用于肿瘤细胞后经U G T1A1灭活,可见U G T1A1的浓度及活性将影响伊立替康的活性产物S N-38的浓度,进而影响其毒性反应㊂国内外多个实验表明遗传因素在伊立替康作用机制中起重要作用㊂U G T1A1基因启动子区T A序列重复次数尤为重要,如U G T1A1*28可能引起U G T1A1表达下降,减少S N-38向S N-38G 的转化,使伊立替康引起严重延迟性腹泻及粒细胞减少㊂可见U G T1A1的遗传多态性及酶表达水平与伊立替康的细胞毒性反应发生均密切相关㊂3.1伊立替康毒性反应与U G T1A1*28基因多态性关系U G T1A1*28是目前研究最多的U G T1A1基因位点,其多态性指T A T A盒胸腺嘧啶-腺嘌呤重复序列㊂纯合基因型T A6/6为(6次T A重复)的两个U G T1A1*1个体;纯合突变基因型即T A7/7为两个U G T1A1*28等位基因(7次T A重复)的个体;杂合突变基因型T A6/7是指1个U G T1A1*1等位基因和1个U G T1A1*28等位基因的个体㊂最早的一项研究发现与野生型患者相比, U G T1A1*1/*28突变杂合子患者使用伊立替康后粒细胞减少的风险达12.5%,而U G T1A1*28/*28纯合突变患者发生严重毒性反应的风险高达50%[20]㊂此后大量研究表明U G T1A1*28基因多态性增加伊立替康化疗所致严重粒细胞减少的风险[21-23]㊂鉴于此,2005年6月美国食品药品监督管理局(F D A)要求伊立替康制药公司修改其说明书,警告患者若为U G T1A1*28纯合突变,使用伊立替康后毒性反应风险增加,并呼吁减少用药起始剂量㊂一项纳入20个试验,1760例患者的荟萃分析显示伊立替康所致严重延迟性腹泻风险:中等以上剂量时U G T1A1*28/*28组明显高于U G T1A1*1/*1组,U G T1A1*1/*28组也高于U G T1A1*1/*1组㊂而低剂量伊立替康(<125m g/m2)中并未发现U G T1A1*28基因与严重延迟性腹泻相关[24]㊂而一个国际多中心临床试验纳入105例晚期结直肠癌白种人,发现U G T1A1*28与延迟性腹泻无关[25]㊂近来一项Ⅲ期随机临床研究证实U G T1A1*28/* 28基因型增加患者发生中性粒细胞减少及延迟性腹泻的风险[22]㊂而另一项国外研究并未发现U G T1A1*28与伊立替康毒性反应相关[26]㊂一项来自台湾,纳入128例晚期结直肠癌患者的回顾性研究显示:U G T1A1*28与U G T1A1*1相比,3~4度白细胞减少的发生率及严重延迟性腹泻的发生率㊁化疗前血清胆红素水平均显著增高[17]㊂季楚舒等[9]发现U G T1A1*28非野生型的基因多态性使患者发生Ⅲ度以上延迟性腹泻的风险增加㊂李虎等[27]研究同样发现U G T1A1基因多态性为伊立替康所致延迟性腹泻的独立影响因素,T A6/7和T A7/7基因型患者发生延迟性腹泻的风险高于T A6/6基因型㊂日本一项研究证实U G T1A1*28基因多态性与严重粒细胞减少相关[23],但也有研究发现U G T1A1*28基因多态性与严重粒细胞减少的风险无关[28]㊂由此可见U G T1A1*28基因多态性与严重延迟性腹泻及中性粒细胞减少的关系有待进一步研究㊂3.2伊立替康毒性反应与U G T1A1*6基因多态性关系 U G T1A1*6是亚洲人常见的U G T1A1基因变异体,且仅在亚洲人中发现,并已证实此变异体能使U G T酶活性减低[29]㊂U G T1A1*6为U G T1A1基因第一个外显子211位碱基的突变(211G>A),包括U G T1A1*6野生型G/G, U G T1A1*6杂合突变型G/A,U G T1A1*6纯合突变型A/A㊂因U G T1A1*28在亚洲人群分布率低,故U G T1A1*6已成为研究热点,并取得了一定进展㊂但是其对伊立替康毒性反应的预测作用尚不明确㊂一项对177例接受伊立替康单药或联合用药的日本患者进行的研究显示,具有U G T1A1*6(211G >A)单倍体患者S N-38G㊁S N-38的药时曲线下面积(A U C)减少,发生严重粒细胞减少的风险增加[30]㊂Y a m a s h i t a[31]和S a t o h等[32]进行的研究同样得出类似结果㊂故美国F D A修改了伊立替康说明书,增加U G T1A1*28和*6对伊立替康代谢和药物不良反应的内容㊂在我国一项对70例结直肠癌患者进行研究,结果显示U G T1A1*6基因型频率分布情况为A/A3.7%,A/G36.0%,G/G60.3%㊂大肠癌患者与健康人群之间的基因型分布无差异㊂但U G T1A1*6基因多态性与伊立替康毒性反应无关系[33],因U G T1A1*28突变在亚洲人中发生率低,而U G T1A1*6可能与伊立替康毒性反应相关,故结合两者综合考虑它们与伊立替康严重毒性反应的关系已成为目前主要研究方向㊂随后我们需进行多中心㊁大样本㊁随机实验研究,确定它们与伊立替康严重毒性反应的关系㊂目前在伊立替康毒性反应分子标志物研究方面尚有U G T1A1*27,U G T1A7,U G T1A9,M D R1, A B C G2等㊂各研究结果不一,结论不同,尚需进一步研究㊂㊃411㊃‘临床荟萃“2016年1月5日第31卷第1期 C l i n i c a l F o c u s,J a n u a r y5,2016,V o l31,N o.1Copyright©博看网. All Rights Reserved.4小结伊立替康是治疗进展期消化道肿瘤的重要药物,因其不可预知严重毒性反应而使其应用受到限制㊂遗传差异对其毒性反应影响大,目前很多学者着手研究基本达成共识,U G T1A1*28突变型纯合子(T A7/7)的患者,使用伊立替康时发生严重延迟性腹泻及骨髓抑制风险高,需调整用药剂量或改变治疗方案㊂若发生严重延迟性腹泻,在患者第一次发生腹泻时立即予以易梦停治疗,避免病情加重;若发生严重白细胞或中性粒细胞减少,予以粒细胞刺激因子治疗㊂但伊立替康毒性反应影响因素众多,即使排除U G T1A1*28基因型,患者在使用伊立替康时仍可能发生严重毒性反应㊂且遗传因素中U G T1A1*27,U G T1A7,U G T1A9,M D R1, A B C G2,C E S,C Y P3A4等基因变异均可能影响伊立替康体内代谢过程,从而影响其毒性反应㊂但是目前各家研究结果不一致,得出不同结论,尚需进一步研究㊂总之,药物的个体化治疗已在全世界范围内达到共识㊂如何根据患者年龄,分期,疗效与毒性的预测标志物确定化疗药物的种类及剂量?未来我们将依靠更多综合的基因检测结果为伊立替康的个体化治疗服务㊂进而使肿瘤患者的生存率以及生活质量提高㊂参考文献:[1]杨立学,马韬,张俊,等.伊立替康化学治疗的不良反应与U G T1A1*28基因多态性的关系[J].内科理论与实践,2009,4(4):300-304.[2] D o u i l l a r d J Y,C u n n i n g h a m D,R o t h A D,e t a l.I r i n o t e c a nc o m b i n e dw i t hf l u o r o u r a c i l c o m p a r ed w i t hf l u o r o u r a c i la l o n ea sf i r s t-l i n e t r e a t m e n tf o r m e t a s t a t i c c o l o r e c t a lc a n c e r:am u l t i c e n t r er a n d o m i z e dt r i a l[J].L a n c e t,2000,355(9209):1041-1047.[3] T o f f o l iG,C e c c h i n E,C o r o n a G,e ta l.P h a r m a c o g e n e t i c so fi r i n o t e c a n[J].C u r r M e d C h e m A n t i c a n c e r A g e n t s,2003,3(3):225-237.[4] C h a m p o u xJ J.D N A t o p o i s o m e r a s e s;s t r u c t u r e,f u n c t i o n,a n dm e c h a n i s m[J].A n n uR e vB i o c h e m,2001,70:369-413. 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DNA拓扑异构酶的研究进展
均位于 Ｔ ｐ 的核心结构域 ，Ｔｒ ２ ｏ ｏＩ ｙ ７ ３位 于羧基端结构域 。核 心 结构域和 羧基端结构域重组后可 以得到接近全酶 的活性。 Ｔｐ ｏ ｏＩ的结构域还有连接子区域和 Ｎ端域， 前者与催化活性无
结构动态变化， 是控制核酸生理功能 的关键酶。 扑酶 的生物 拓 学作用可通过两种方式实现 ，一是调节控制 Ｄ Ａ 的超螺旋状 Ｎ 态及打结或解结 Ｄ Ａ 的环连体状态，从而间接地影响细胞 内 Ｎ 核酸代谢过程：二是直接参与那些需打断并重新连接 Ｄ Ａ分 Ｎ
３０ ０ ３０ ６）
文 章编 号 ：１７ — ０ ５ （０ ８ ． ２ ７０ ２ ５ ８ ２ ０ ）３０ ５ ． ３ ６
Ｄ Ａ 拓 扑 酶 广 泛存 在于 生物 体 细 胞核 内 ， 调 节 核酸 空 间 Ｎ 能 结 构 动 态变 化 ， 是控 制 核 酸 生 理 功 能 的关 键 酶 。 参与 Ｄ Ａ 的 其 Ｎ
为 ３ｋ ， 通 常 Ｉ Ｂ型 酶相 对 分 子 量在 ８ ～ １ Ｏｕ之 间 。因 ６ｕ 而 Ｏ ｌｋ 此它 已成 为 研 究 该类 酶 的结 构 功 能 的重 要 模 型分 子 。
构 ：双螺旋结构构成其二级结构；真核生物 Ｄ Ａ 分子很大 ， Ｎ
Ｄ Ａ 很 长 ，但 却要 存 在 于 小 小 的细 胞 核 内 ，因 此 Ｄ Ａ必 须 在 Ｎ链 Ｎ 二 级 结 构 的基 础 上 紧密 折 叠 ，这 就形 成 了三 级 结 构 ：ＤＡ分 子 Ｎ
人 Ｔ ｐ Ｉ为单体酶，相对分子量为 ９ ｕ ｏｏ １ｋ ，共含 ７ ５个 ６ 氨基酸 ，由位于染色体 ２ １￣１．２上 的单拷贝基 因编码 。 ０ｑ ２ ３ 最早 发现 的 Ｔ ｐ 个关 键功 能活 性位 点为 ： ｈ ｇ８ ， ｏ ｏＩ ４ ｒ ４ ８
热疗法治疗肿瘤的研究进展
热疗法治疗肿瘤的研究进展目前针对肿瘤的治疗手段有很多，但最基本也是最主要的仍是手术联合放疗和化疗。
探索新的、毒副作用小的治疗方法，或者在目前治疗方法的基础上增加一些辅助手段，进而提高疗效，减轻毒副反应，是目前肿瘤治疗亟待解决的问题之一。
近年来逐渐发展成熟的肿瘤治疗新领域。
本文介绍了热疗的起源与现状，简述了热疗的基本原理及其现有的技术支持及具体临床应用，其中重点介绍了迄今已经证实可与热疗发挥协同作用的药物。
1.热疗的起源与现状热疗起源于19世纪末期，最早西医文献记载于1866年，Busch报告1例恶性肿瘤病人因感染丹毒产生高热后肿瘤完全消退。
1893年Co1ey用细菌毒素注入人体引发机体产生高热治疗38例晚期恶性肿瘤病人，其中12例肿瘤完全消退，19例好转，还同法治愈了10例肉瘤患者，其中1例无瘤且存活期达27年。
但直到20世纪中叶热疗才作为实验性疗法治疗晚期病人。
早期热疗由于设备落后、加热剂量和温度无法控制、作用机制不清、副作用严重等诸多限制，因而发展相对滞后，在相当长的时间内没能被广泛应用。
近20年以来在医、工两界的共同寻求与探索下，分子热生物学、细胞热生物学、血管热生物学、热剂量测定法、加热与控温技术等均取得了突破性的进展，为肿瘤热疗技术的发展提供了新的契机。
现代肿瘤热疗技术以其无创或微创性并对免疫系统损伤较小且有可能增强免疫力等优势，逐步成为继手术、放疗、化疗、生物治疗后的又一种抗肿瘤手段。
2.基本原理热疗，即通过各种致热源的热效应，将肿瘤区域或全身加热至有效治疗温度范围并维持一定时间，从而引起肿瘤细胞分子结构发生改变和溶酶体活性增强以杀灭肿瘤细胞，热疗过程中肿瘤和周围正常组织温度均升高，但正常组织因热效应导致血管扩张、血流加快，故散热充分，且因其血液循环良好，温度升高并不显着；而肿瘤组织由于血流缓慢，甚至血管闭塞，导致散热困难，热量积聚，可以高于正常组织5℃～10℃，进而可发挥抗肿瘤作用。
拓扑异构酶Ⅰ抑制剂介导的DNA损伤、修复和检验点应答
一 步被 ３ 磷酸酶 ，例如聚合苷酸激酶磷酸酶（ＰＮＫＰ）（或 Ａｐｅ１）加工．Ｔｄｐｌ催化裂解后产生的３ 磷酸根 ， 被进一步水解产生 ３ 羟基 ，然后经 ＤＮＡ聚合酶和连接酶加工时将 ＤＮＡ再度连接．在芽殖酵母 中，这一
３ 磷酸酶活性是 由ＤＮＡ ３ 一磷酸酶 Ｔｐｐ１和两种作用重叠的多功能的无嘌啉（ＡＰ）核酸内切酶 Ａｐｎｌ和 Ａｐｎ２来完 成 的 Ｊ．人 类 的 ＡＰ核 酸 内切 酶为 Ａｐｅ１．Ｔｐｐｌ的 ３ 磷 酸 酶 同源 物 在 裂殖 酵 母 中是 Ｐｎｋｌ［６ Ｊ，在
关键 词 ：拓 扑 异 构 酶 Ｉ；ＤＮＡ；检 验 点 ：喜 树 碱
中 图分 类号 ：Ｒ９７９．１
文 献 标 识 织中，其 主要功能是在染色质转录和复制过程 中松弛 ＤＮＡ超 螺旋 ．ＤＮＡ的超长 线度 和双 螺旋 性质使 其 在复制 和重组 期 间经 常缠 绕 ，阻 碍 ＤＮＡ的 复制 、转 录和重 组 ． ＤＮＡ Ｔｏｐｏ酶在 ＤＮＡ的核糖 一磷酸 主链上产生一次性的断裂 ，断裂 ＤＮＡ围绕完整 ＤＮＡ绕旋 ，改变了 ＤＮＡ的拓扑结构，从而使 ＤＮＡ的缠绕解开 ，再通过逆 向转酯反应再次连接断裂的 ＤＮＡ，恢复 ＤＮＡ的完 整性．ＤＮＡ拓扑异构酶包括 ＤＮＡ拓扑异构酶 Ｉ（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ Ｉ，Ｔｏｐｏｉ）和 ＤＮＡ拓扑异构酶 Ｉｔ（ｔｏｐｏｉ— ｓｏｍｅｒａｓｅ １１，ＴｏｐｏⅡ）两种 ，分别断裂 ＤＮＡ单链 和 ＤＮＡ双链．… 目前 已知有多种不 同类型 的拓扑异构 酶 Ｉ（Ｔｏｐｏｉ）抑制剂 ，其 中首 先被 发现 以及最 重要 和最 广 泛使 用 的是 喜树 碱 ．喜 树碱 以 Ｔｏｐｏｉ为靶 目标 ， 已成为有效的抗肿瘤药物．普遍认为喜树碱杀伤肿瘤细胞的主要机制，是形成 Ｔｏｐｏ Ｉ—ＤＮＡ一喜树碱三 元复合物后，与复制叉发生冲突，造成 ＤＮＡ损伤 ，激活 ＤＮＡ损伤检验点 ，从 而抑制肿瘤细胞生长 ，引发 凋亡 ，杀伤肿瘤细胞．喜树碱已成为探讨 ＤＮＡ损伤以及相关的修复和检验点应答分子机制的有力的药 理学 工具．
盐酸槐定碱注射液对DNA拓扑异构酶活性抑制作用的研究
盐酸槐定碱注射液对DNA拓扑异构酶活性抑制作用的研究【关键词】盐酸槐定碱，；，，，拓扑异构酶；，，活性作用摘要：目的研究盐酸槐定碱对 DNA拓扑异构酶I和酶II（TOPO I、II）活性的影响。
方法DNA超螺旋解旋法检测盐酸槐定碱注射液对拓扑异构酶I及酶II介导的 PBR322 DNA解旋反应的影响。
结果盐酸槐定碱注射液能明显抑制 TOPO I介导的 DNA 解旋及断裂，在终浓度为6 250 μg/ml 和3 215 μg/ml 时对拓扑异构酶I均有抑制作用，且剂量--效应关系密切，但对拓扑异构酶II介导的 DNA 解旋反应无影响。
结论结果提示盐酸槐定碱注射液的直接作用靶点是 DNA拓扑异构酶I，该药为拓扑异构酶I抑制剂。
关键词：盐酸槐定碱；拓扑异构酶；活性作用Abstract：ObjectiveThe purpose of this study was to investigate the principle of activity of promoting DNA topoisomerase. MethodsThe effect of Sophoridine hydrochlorium on topoisomerase was measured by supercoiled DNA relaxation assay. ResultsSophoridine hydrochlorium could markedly inhibit the activity of topoisomerase I，by 6250μg/ml and 3215μg/ml respectively， could not prove that it inhibited the activity of topoisomerase II.ConclusionIt may be the fact that DNA topoisomerase I is a direct target in antitumor activity of Sophoridine hydrochlorium.Key words：Sophoridine hydrochlorium; DNA topoisomerase; antitumor activity癌症是严重威胁人类健康的一类疾病，寻找有效的抗癌药物是目前世界医学界重要的研究课题，由于合成药物在伴随治疗中出现明显的副作用，天然药物越来越受到人们的重视和青睐。
刘潇-拓扑异构酶I抑制剂研究进展
[接受日期] 20092042093通讯作者: 李志裕,副教授;研究方向: 药物化学与合成工艺研究;Tel:025*********; E 2ma il:zhiyuli@doi:10.3969/j .issn .1001-5094.2009.07.004拓扑异构酶I 抑制剂研究进展刘 潇, 王汝冰, 符 伟, 李志裕3(中国药科大学药物化学教研室,江苏南京210009)[摘要] 综述近年来拓扑异构酶I 抑制剂的研究进展,分类介绍其抗肿瘤活性以及构效关系,并分析讨论其与靶酶结合作用的特点,旨在为设计、合成与筛选新型拓扑异构酶I 抑制剂候选化合物提供一定参考。
DNA 拓扑异构酶I 是抗肿瘤药的重要靶点,随着对酶的构象及其抑制剂的深入研究,多种高效低毒的化合物被相继发现并进入临床研究阶段,为肿瘤患者带来了希望。
[关键词] 拓扑异构酶I 抑制剂;抗肿瘤药;喜树碱;吲哚并咔唑;茚并异喹啉酮[中图分类号] R 97911;R 91412 [文献标识码] A [文章编号]1001-5094(2009)07-0311-10Advances i n the Researches on Topo iso m era se I I nh i b itorsL I U Xiao, WANG Ru 2bing, F U W ei, L I Zhi 2yu(D epart m ent of M ed icina l Che m istry,China Phar m aceutical U niversity,N anjing 210009,China )[Abstract] The advances in researches on t opois o merase I (t opo I )inhibit ors were intr oduced,and the s pecies,anticancer activities and their structure 2activity relati onshi p s (S AR s )were summarized .W e als o analyzed the correlativity bet w een the crystal structure of the ternary comp lex and their S AR s,in order t o offer reference for designing,synthesizing and screening ne w t opo I inhitibor candidates .The t opo I has become a useful therapeutic target against cancer,and with the incessant discovery int o the conf or mati on of t opois omerase and the related inhitibors,many kinds of compounds with high 2efficiency and l ow t oxicity were discovered .Moreover,s ome compounds have already entered int o the clinical research successfully,which has br ought hope for cancer patients .[Key words] t opois omerase I inhibit or;anticancer agents;ca mp t othecins;indol ocarbaz oles;indenois o 2quinol ones DNA 拓扑异构酶(DNA t opois omerase,Topo )是一种重要的核酶,可通过催化DNA 链的断裂和结合控制其拓扑结构。
拓扑异构酶作用特点
拓扑异构酶作用特点
拓扑异构酶是一类重要的酶，在生物学研究中起着重要的作用。
其主要功能是改变DNA分子的拓扑结构，从而影响DNA的复制、转录和重组等生物过程。
拓扑异构酶的作用特点如下：
1. 双链DNA断裂和连合
拓扑异构酶能够将DNA分子断裂成两部分，并将其重新连接在一起。
这种能力使得拓扑异构酶在DNA复制和转录过程中起到了重要的作用。
2. 去除DNA缠结
DNA缠结是指DNA分子在复制和转录过程中遇到的拓扑问题。
拓扑异构酶能够去除这些缠结，使得DNA分子能够正常进行复制和转录。
3. 调节DNA拓扑结构
拓扑异构酶能够调节DNA分子的拓扑结构，从而影响DNA的复制、转录和重组等生物过程。
这种调节作用对维持DNA分子的正常生物功能非常重要。
4. 与其他酶协同作用
拓扑异构酶通常与其他酶协同作用，完成DNA复制和转录等生物过程。
这种协同作用可以提高酶的效率和准确性，从而保证DNA分子的正常功能。
总之，拓扑异构酶在生物学研究中具有非常重要的作用。
其作用特点对于理解DNA的生物学功能和调控机制具有重要的意义。
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拓扑异构酶I的结构特点及其抑制剂研究进展
引言
DNA拓扑异构酶是存在于细胞核内的一类酶，他们能够催化DNA链的断裂和结合，从而控制DNA的拓扑状态。
近来的研究表明，在RNA转录过程中，拓扑异构酶参与了超螺旋结构模板的调节。
主要存在两种哺乳动物拓扑异构酶，一类叫拓扑异构酶I，一类叫拓扑异构酶II。
拓扑异构酶I催化DNA链的断裂和重新连接，每次只作用于一条链，即催化瞬时的单链的断裂和连接，它们不需要能量辅因子如ATP或NAD。
E.coli DNA拓扑异构酶I又称ω蛋白，大白鼠肝DNA拓扑异构酶I又称切刻-封闭酶(nicking-closing enzyme )。
拓扑异构酶II能同时断裂并连接双股DNA链．它们通常需要能量辅因子ATP。
拓扑异构酶Ⅰ( topoisomerase, Topo)参与DNA复制、转录、重组、修复等所有关键的细胞核内过程,是抗肿瘤研究的重要靶点,以TopoⅠ为靶点的药物在肿瘤化疗中被广泛应用。
目前临床使用或处于临床前研究的拓扑异构酶Ⅰ抑制剂主要分为喜树碱类和非喜树碱类化合物。
1拓扑异构酶I的结构特点（拓扑异构酶I抑制剂研究进展）
1.1 拓扑异构酶I的四个主要结构域
人TopoⅠ为三维晶体结构的单体酶[4],分子量为91ku,共含765个氨基酸,定位于第20号染色体。
有限蛋白裂解实验表明,该酶包含4个主要结构域,分别为N端域、核心域、连接子区( linker)和羧基端结构域。
其中N端域具有高度正电性,疏水氨基酸很少,不能形成稳定的球形结构域。
核心结构域包含了除Tyr723以外的所有活性位点残基。
连接子区包含氨基酸636~712,与催化活性无关,但通过Lys650、Arg708与DNA 切割位点下游的核苷酸形成氢键,从而对DNA下游有稳定作用,进而减缓再连接过程。
羧基端结构域,包含关键活性位点残基Tyr723,与独立的核心结构域(含氨基酸215-635)重组后可以得到接近全酶的活性。
突变实验表明,该区还与TopoⅠ的激酶活性有关。
1.2拓扑异构酶I的活性位点
Stewart通过分析人TopoⅠ与DNA复合物的晶体结构,认为TopoⅠ活性位点内的Arg488,Arg590与DNA骨架上磷酸二酯键的一个非桥连氧原子形成氢键,另一个非桥连的氧原子与His632末端Nε2氧原子形成氢键,从而稳定五价配位的催化中间体。
然而, Tyr723羟基0.4 nm内没有发现可作为广义碱的侧链原子。
最近,切割位点21位为胞嘧啶的TopoⅠ与DNA的非共价复合物Topo70晶体结构测定结果表明,距Tyr723羟基0.23 nm处存在一个水分子,与Arg590的胍基形成较强的氢键作用(距离为0.25 nm),这很可能就是活化Tyr723羟基的特异碱。
在该晶体结构中,还发现磷酸基团旋转约75°,使得Lys532可以与一个非桥连氧原子形成氢键。
这提示Lys532是继Arg488、Arg590、His632和Tyr723后发现的第5个活性位点功能残基[5]。
2拓扑异构酶I的作用机理
在DNA的复制、转录等过程中,TopoⅠ的酪氨酸残基与DNA的3′末端以磷酸二酯键结合,形成TopoⅠ-DNA可裂解复合物,介导DNA单链断裂,使超螺旋得到松弛,然后再将已断裂的DNA连接起来[1]。
肿瘤细胞中TopoⅠ含量及活性远高于正常体细胞,抑制TopoⅠ-DNA可裂解复合物解离,就能选择性抑制肿瘤细胞的快速增殖,进而杀死肿瘤细胞, TopoⅠ由此成为公认的抗癌药作用靶点。
TopoⅠ抑制剂并非单纯抑制该酶的催化活性,还可通过与TopoⅠ-DNA可裂解复合物可逆结合,形成抑制剂-TopoⅠ-DNA三元复合物,阻止DNA重新连接,致使复制不能进行下去,从而使细胞死亡。
3拓扑异构酶I的抑制剂
根据目前的研究进展，新的分类方法把TopoⅠ抑制剂分为喜树碱(camptothecin,CPT)类化合物和非喜树碱类化合物。
3.1喜树碱类
具有显著抗肿瘤活性的喜树碱(CPT,1)最早由Wall等人于1966年从珙桐科植物喜树中分离得到。
研究表明,在人体内环境中,喜树碱内酯环可通过水解作用断裂而形成开环结构,且开环与闭环两种结构间存在动态平衡。
其中,闭环喜树碱可发挥抗肿瘤药效,而开环喜树碱易与人血清蛋白(humanserum albumin,HSA)结合,从而引发严重的毒副作用,同时还会推动平衡向生成更多开环喜树碱的方向移动,因此使闭环喜树碱的浓度降低,影响其抗癌效果。
此外,喜树碱还存在水溶性差等问题,使其开发与应用受到一定限制。
故研究人员将研究重点放在改善喜树碱理化性质、提高其内酯环稳定性等方面,近年来已合成了一系列喜树碱衍生物,包括其与大分子多聚物共价结合所得到的喜树碱前药[2],并展开了相应的活性研究,发现在抗肿瘤活性方面,喜树碱类TopoⅠ抑制剂具有如下构效关系。
1)若在喜树碱A、B环的7、9、10位引入碱性基团,并与酸成盐后,可使其水溶性增加及生物利用度提高,而引入卤原子、氨基、羟基、烷基和氰基,则可提高其抗癌活性;若7位被大基团取代,化合物活性下降;当10与11位连有亚甲二氧基或亚乙二氧基、或7和9位的取代基连成六七元环、或9和10位相连成环时,均可使化合物抗癌活性改善;当12位有取代时,化合物活性明显降低。
2)E环是喜树碱类化合物结构中最重要的部分,其开环后抗癌活性消失;若将其20位上的羟基替换为卤素、氢或烷基,则抗癌活性下降;当环中的氧原子被氮、硫原子等替换或内酯结构变成酮、醚或胍后,抗癌活性也会消失;而若E环为七元内酯环(其对应化合物称高喜树碱),化合物化学性质则更稳定,抗癌活性提高; 20位羟基与氨基酸等分子成酯后,内酯环稳定性提高,化合物水溶性增强。
现已上市的喜树碱类药物有10-羟基喜树碱(HCPT,2)、拓扑替康(topotecan,TPT,3)、伊立替康( irinotecan, IRT,4)和贝洛替康(belotecan, BLT,CKD602,5),其中伊立替康在体内代谢为活性产物SN-38(6)而发挥抗肿瘤作用。
研究发现,拓扑替康与SN-38均为乳腺癌耐药蛋白(BCRP)和P糖蛋白的底物,部分肿瘤易对其产生耐药性。
因此,寻找不易引发肿瘤耐药性的TopoⅠ抑制剂显得尤为迫切。
目前,除上述已上市药物外,还有其它喜树碱类化合物处于研发阶段,有望成为抗肿瘤新药,如正处在临床前研究阶段的NSC606985(7)和已进入临床研究阶段的S-CKD602、Gimatecan(ST1481,8)等。
3.2非喜树碱类
3.2.1吲哚并咔唑类
具有抗肿瘤活性的吲哚并咔唑类化合物BE-13793 (14)最早是从链轮丝菌属(Streptoverricillium)发酵液中分离获得的。
研究发现,该化合物可作用于TopoⅠ-DNA 可裂解复合物,抗癌机制与喜树碱类似。
而在其吲哚环氮原子上引入一个吡喃糖后得到的ED-110 (15)对TopoⅠ抑制能力与细胞毒活性都很强,但水溶性差。
因此,人们继续对ED-110进行结构改造,得到了具有广谱抗肿瘤活性、且毒性较小的化合物NB-506 (16),目前其已进入Ⅱ期临床研究阶段。
此外,进入临床研究阶段的此类化合物还有Edotecarin ( J-107088,17)、Becatecarin (NSC655649,18)和BMS-205749(19
3.2.2 茚并异喹啉酮类
NSC 314622(21)最初是在光花椒碱的合成过程中意外获得的一种茚并异喹啉酮类化合物,后受到美国国立癌症研究所(NCI)的密切关注,该所在分析了NSC 314622对不同
来源的60种肿瘤细胞株的抑制活性后,确定其为一种TopoⅠ抑制剂。
该化合物在毫摩尔浓度下即可抑制TopoⅠ介导的DNA断裂。