香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物及其应用的制作方法
分子标记的发展及分子标记辅助育种
分子标记的发展及分子标记辅助育种分子标记辅助选择育种(Marker Assisted Selection (MAS)或Marker Assisted Breeding)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记或功能标记），在杂交后代中准确地对不同个体的基因型进行鉴别，并据此进行辅助选择的育种技术。
通过分子标记检测，将基因型与表现型相结合，应用于育种各个过程的选择和鉴定，可以显著提高育种选择工作的准确性，提高育种研究的效率。
分子标记辅助育种示意图DNA分子标记相对同类技术来说具有很强的优越性：因为大部分标记为共显性，对隐性性状的选择十分有利；数量极多，应对极其丰富的基因组变异；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用标记分析；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁等等。
随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术也有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴定、基因库构建、基因克隆等方面。
分子标记的类型分子标记按技术特性可分为三大类。
第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术；第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失等。
分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：①表现稳定，多态性直接以DNA 形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；②数量多，理论上遍及整个基因组；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；④对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；⑥成本不高，一般实验室均可进行。
分子标记技术的类型及其原理
分子标记技术的类型及其原理08农生1班陈耀光 200830010403所谓分子标记就是基于基因组DNA 存在极其丰富的多态性而发展的一类可以直接反映生物个体间DNA 水平上差异的新型的遗传标记方法。
在遗传学发展过程中，先后出现了形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记，其中以分子标记最为理想、可靠，因为DNA分子中碱基的缺失、插入、易位、倒位或是长短与排列不一的重复序列等产生的差异，都可以通过分子标记进行检测。
DNA 分子标记较以往的形态标记其优越性表现在：(1)以核酸为研究对象，不受季节、环境限制，不存在基因表达与否的问题，也没有组织或器官特异性；(2)数量的丰富性，遍及整个基因组，标记的数量几乎是无限的；(3)多态性高，自然存在丰富的等位变异；(4)许多标记表现为共显性，能很好地鉴别纯合基因型与杂合基因型；(5)检测手段简便、快速，并且重复性好；(6)既不对目标形状的表达造成影响，也不会与不良性状之间产生必然的关联。
1 分子标记的类型及其原理分子标记技术自诞生以来，短短的几十年时间中得到突飞猛进的发展，至今被发展和利用的分子标记技术已有二十余种，为不同研究领域提供了有效的技术手段，同时也发挥着至关重要的作用。
目前，根据对DNA 多态性检测手段和所应用序列范围的不同，对部分分子标记技术分类如下。
1.1 基于全基因序列的分子标记RFLP (restriction fragment length polymorphism,限制性片段长度多态性)：RFLP 作为最早发展的分子标记技术由Grozdicker 等于1974 年创建，并由Bostein 等再次提出。
RFLP 技术的出现开创了直接在DNA 水平上进行遗传研究的新时代。
其基本原理是：基因组DNA中限制性内切酶所识别的序列由于出现碱基变化而致使酶切位点的数量也变化，从而使酶切片段长短发生差异产生长度多态性。
利用特定的限制性内切酶切割不同个体的基因组DNA，由于不同个体中酶切位点的差别就得到了长短相异的片段DNA，电泳分离后，借助Southern 杂交将DNA 片段转移至硝酸纤维素膜上，将具有放射性标记的探针与膜上的片段杂交，通过放射自显影技术就可以获得显示物种特异性的多态性图谱。
分子标记技术概述
分子标记技术概述目录一、声明 (2)二、分子标记技术概述 (3)三、水果产量提升的重要性 (6)四、全球水果种植现状及趋势 (8)五、影响水果产量的主要因素 (11)六、结语总结 (14)一、声明除了上述六大水果大省，河北、湖北、湖南、福建等省份的水果产业也颇具规模。
河北省的水果种类丰富，包括苹果、梨、桃和葡萄等主要水果品种。
湖北的主要水果品种包括柑橘、桃子、梨子、葡萄、枣、西瓜、甜橙、柿子、猕猴桃、枇杷、李子、杏、无花果等。
湖南主要水果有柑桔、桃、杨梅、冰糖橙、葡萄、猕猴桃等。
福建的主要水果品种包括琯溪蜜柚、度尾文旦柚、永春芦柑、顺昌芦柑、建宁黄花梨、福安巨峰葡萄等。
水果产量的增加有助于减少因产量不足而导致的价格波动，稳定市场价格，使更多消费者能够以合理的价格获得高质量的水果，从而促进社会经济的稳定发展。
水果产业是许多国家和地区农业的重要组成部分，提升水果产量直接关联到农业经济的增长。
高产的水果不仅能够提高农业总产值，还能带动相关产业链的发展，如包装、运输、加工和销售等，为地方经济注入新的活力。
水果产量的提升离不开技术创新和科技进步。
为了满足市场对高品质、高产量水果的需求，种植者必须不断探索和应用新技术、新品种和新方法。
这不仅促进了农业科技的发展，还推动了农业产业的现代化进程。
一些特色水果如柠檬、草莓、葡萄、樱桃等，在全国范围内也有广泛种植。
这些水果不仅丰富了人们的餐桌，也为当地经济发展注入了新的活力。
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本文内容仅供参考，不构成相关领域的建议和依据。
二、分子标记技术概述（一）分子标记技术的基本概念分子标记技术是在DNA分子水平上，通过对遗传物质多态性的检测和分析，进行遗传育种和基因研究的一种现代生物技术。
与传统的形态学标记、生物化学标记和细胞学标记相比，分子标记技术具有更高的准确性和可靠性。
它基于生物个体间基因组中核苷酸序列的差异，能够直接反映DNA水平的遗传多态性。
DNA分子标记及其在作物遗传育种中的应用
DNA分子标记及其在作物遗传育种中的应用摘要：本文对四种DNA分子标记技术的原理和特点，以及不同DN A分子标记在作物亲缘关系与遗传多样性、指纹图谱的建立、遗传图谱的构建与基因定位、及分子标记辅助选择育种等方面所取得的应用效果进行了较为详尽的论述，充分展示这项技术的发展具有巨大的应用潜力和广阔的应用前景。
关键词：DNA分子标记；遗传育种；应用伴随着人们对生命认识的不断加深以及遗传学的发展，遗传标记（genetic marker）的种类和数量越来越多，主要分为四种类型：形态学标记、细胞学标记、生化标记和DNA 分子标记。
前三种标记都是以基因表达的结果(表现型)为基础，是对基因的间接反映；而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映。
1.分子标记（molecular marker）广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
狭义的分子标记只是指DNA标记。
DNA分子标记是以生物DNA的多态性为基础的遗传标记，与其他遗传标记相比，它具有以下优点：（1）直接以DNA的形式表现，在生物各个组织，各个发育时期都可检测到，不受季节、环境限制；（2）数量极多，遍及整个基因组；（3）多态性高，并且自然存在许多的等位变异，不需专门创造特殊的变异材料；（4）表现“中性”，即不影响目标性状的表达，与不良性状也没有必然的连锁；（5）许多分子标记表现为共显性，能够鉴别纯合基因型与杂合基因型，提供完整遗传信息。
因此，DNA分子标记已广泛地应用于种质资源研究、目的基因定位、遗传图谱构建和分子标记辅助选择等各个方面。
根据检测手段的不同，DNA标记技术综合起来可分为以DNA杂交为基础的、以PCR 技术为基础的、以串联重复的DNA序列为基础的以及基于单核苷酸多态性的DNA标记四种类型。
不同的DNA分子标记之间既有共性又有各自的特点，这里就常用的几种标记技术作简要介绍。
1.1 以DNA杂交为基础的分子标记该标记是利用限制性内切酶酶解不同生物体的DNA分子后，用经标记过的特异DNA 探针与之进行Southern杂交，通过放射自显影或同位素显色技术来揭示DNA多态性，主要包括RFLP标记和VNTR标记。
分子标记
分子标记遗传标记主要有四种类型：形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）。
分子标记是其中非常重要的一种，他是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。
概念：分子标记的概念有广义和狭义之分。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。
狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。
优点：与其它标记方法相比，分子标记具有无比的优越性。
它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息。
随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。
理想的分子标记必须达以下几个要求：（1）具有高的多态性；（2）共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；（3）能明确辨别等位基因；（4）遍布整个基因组；（5）除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；（6）选择中性（即无基因多效性）；（7）检测手段简单、快速（如实验程序易自动化）；（8）开发成本和使用成本尽量低廉；（9）在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）。
论文-分子标记的种类及其发展
分子标记的种类及其发展1 引言1.1 分子标记概念的界定广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。
蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。
狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳。
本文中也将分子标记概念限定在DNA标记范畴。
1.2 理想的分子标记的界定理想的分子标记必须达到以下几个要求：(1)具有高的多态性；(2)共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3)能明确辨别等位基因；(4)遍布整个基因组；(5)除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6)选择中性（即无基因多效性）；(7)检测手段简单、快速（如实验程序易自动化）；(8)开发成本和使用成本尽量低廉；(9)在实验室内和实验室间重复性好（便于数据交换）。
但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以上所有要求。
2 分子标记的种类2.1 限制性片段长度多态性2.1.1 限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP)是发展最早的分子标记技术。
RFLP技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。
因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。
此技术及其从中发展出来的一些变型均包括以下基本步骤：DNA的提取、用限制性内切酶酶切DNA、用凝胶电泳分开DNA片段、把DNA片段转移到滤膜上、利用放射性标记的探针显示特定的DNA片段（通过Southern杂交）、分析结果。
由于线粒体和叶绿体DNA较小，前三个步骤就完全可能检测出DNA片段的差异，所以往往不必要后面的几个步骤；对线粒体和叶绿体DNA进行的这种多态性差异检测在1980年之前就已出现，从理论上说，这种多态性也可称为RFLP。
基于SNP_标记的4_个品种复烤烟叶鉴别研究
河南农业科学，2023，52（11）：174⁃180Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi:10.15933/ki.1004-3268.2023.11.019基于SNP 标记的4个品种复烤烟叶鉴别研究杨金初1，童治军2，李萌3，赵旭1，徐永明1，冯颖杰1，杨宗灿1，曲鹏3，李悦1，孙九喆1，张轲4（1.河南中烟工业有限责任公司技术中心，河南郑州450000；2.云南省烟草农业科学研究院/烟草行业烟草生物技术育种重点实验室/国家烟草基因工程研究中心，云南昆明650021；3.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南郑州450001；4.云南省烟草质量监督检测站，云南昆明650106）摘要：为探究单核苷酸多态性（SNP ）标记在复烤烟叶品种鉴别上的可行性，开发基于SNP 标记的复烤烟叶高效鉴别技术，对4个主栽烟草品种云烟87、红花大金元、K326及NC102的复烤烟叶进行了全基因组测序，应用全基因组数据发掘SNP 位点，依据SNP 位点设计了PCR 引物，并对不同烟草品种进行了基因分型和区分。
结果显示，4个品种复烤烟叶全基因组测序共获得21.5Gb 数据，共检测出27137个SNP 位点。
挑选其中53个SNP 位点设计不同错配类型等位基因引物570条，扩增结果均与预期一致。
SNP 位点35、45和51在品种间具有多态性，红花大金元在35、45、51位点基因型为T/T 、C/C 、T/T ；K326为C/T 、C/T 、C/C ；NC102为C/T 、C/T 、C/T ；云烟87烟叶在35位点无扩增，在45、51位点的基因型为C/T 、C/T 。
依据3个SNP 位点的基因型构建不同品种的分子ID ，可准确区分4个品种的复烤烟叶。
关键词：复烤烟叶；品种；鉴别；全基因组测序；SNP 位点；等位基因；多态性中图分类号：S57；TS45文献标志码：A文章编号：1004-3268（2023）11-0174-07收稿日期：2023-02-06基金项目：中国烟草总公司重点研发计划项目（110202202038）；中国烟草总公司云南省公司科技项目（2020530000241034，2023530000241027）作者简介：杨金初（1987-），男，湖南衡阳人，高级工程师，硕士，主要从事烟草生物技术与烟用香精香料研究。
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本技术公开了樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物及其应用，属于林业分子生物学技术领域。
本技术筛选了11对香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物，将其应用在古樟遗传多样性分析和古樟谱系分析中，基于叶绿体单倍型分析显示，不同单倍型分布差异明显，大部分单倍型只存在于特定的群体中，只有少数单倍型为共享单倍型，表明单倍型间存在一定的地理分化。
18个古樟群体的遗传分化系数Fst为0.212，基因流Nm为0.929，表明古樟群体间存在中等的基因流。
本技术的SNP分子标记重复性好，能够全面揭示香樟遗传多样性真实水平，为野生香樟资源保护利用提供理论依据。
权利要求书1.香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物，其特征在于，包括11对多态性引物，其引物核苷酸序列如下：CpSNP1上游引物如SEQ ID NO.1所示；CpSNP1下游引物如SEQ ID NO.2所示；CpSNP2上游引物如SEQ ID NO.3所示；CpSNP2下游引物如SEQ ID NO.4所示；CpSNP9上游引物如SEQ ID NO.5所示；CpSNP9下游引物如SEQ ID NO.6所示；CpSNP13上游引物如SEQ ID NO.7所示；CpSNP13下游引物如SEQ ID NO.8所示；CpSNP14上游引物如SEQ ID NO.9所示；CpSNP14下游引物如SEQ ID NO.10所示；CpSNP15上游引物如SEQ ID NO.11所示；CpSNP15下游引物如SEQ ID NO.12所示；CpSNP16上游引物如SEQ ID NO.13所示；CpSNP16下游引物如SEQ ID NO.14所示；CpSNP18上游引物如SEQ ID NO.15所示；CpSNP18下游引物如SEQ ID NO.16所示；CpSNP19上游引物如SEQ ID NO.17所示；CpSNP19下游引物如SEQ ID NO.18所示；CpSNP20上游引物如SEQ ID NO.19所示；CpSNP20下游引物如SEQ ID NO.20所示；CpSNP21上游引物如SEQ ID NO.21所示；CpSNP21下游引物如SEQ ID NO.22所示。
2.根据权利要求1所述的香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物，其特征在于，所述多态性引物的PCR-HRM扩增体系为：上下游引物各10μM，1μL；2×Froget-Me-Not EvaGreenqPCR Master Mix 5μL，H2O 2μL，DNA模板30ng，1μL，所述体系的总体积为10μL。
3.根据根据权利要求1所述的香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物，其特征在于，所述多态性引物的PCR-HRM扩增程序为：95℃2min，95℃5s，60℃30s，30-35个循环；95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。
4.权利要求1所述的香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物在古樟遗传多样性分析中的应用。
5.权利要求1所述的香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物在古樟谱系分析中的应用。
6.权利要求4或5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：1)提取不同品种香樟的基因组DNA；2)用权利要求1SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.22所示的引物对步骤1)提取的基因组DNA进行PCR 扩增和HRM分析；3)数据分析叶绿体SNP位点多态性，古樟谱系分析，古樟遗传多样性分析。
技术说明书香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物及其应用技术领域本技术属于林业分子生物学技术领域，具体涉及香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物及其应用。
背景技术香樟(Cinnamomum camphora(L.)Presl.)是樟科樟属高大乔木，具有重要的生态、文化和经济价值，是我国重要的材用和特种经济树种。
近年来有关香樟分类学、生理学、化学成分与利用、良种选育和营林技术等方面的研究己有较多报道，但对其种质资源遗传多样性的研究却很不充分。
香樟在我国具有较早的栽培历史，地区间引种栽培情频繁，其延续至今，针对群体遗传分析的样品起源有较大出入。
此外，在研究手段上，早期使用的RAPD、ISSR等共显性DNA标记，重复性差、多态性低，难以全面揭示香樟遗传多样性真实水平。
SNP被称为第三代分子标记，是基因组中单个核苷酸的突变而引起的DNA序列的多态性，它以单个碱基的颠换、转换、插入和缺失的方式存在。
相较于其他分子标记，SNP具有以下几个有点：1)密度高，分布广，SNP分布广泛，遍布整个基因组；2)遗传稳定性，相较于SSR 等重复序列多态标记相比，SNP具有更高的遗传稳定性；3)二态性，尽管SNP只有两种等位基因型，在个体中信息量相较于目前常用的SSR标记要少，但其高密度性和稳定性弥补了这一差距；4)代表性，某些位于基因内部的SNP有可能直接影响蛋白质结构或表达水平，因此它们可能代表疾病遗传机理中的某些作用因素；5)易于实现分析的自动化，无需检测片段长度多态，容易实现自动化。
由于以上特点，SNP经常被用作于遗传多样性研究、遗传连锁图谱的构建、种质资源鉴定和关联分析等研究。
技术内容针对现有技术的不足，本技术的目的是提供香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物，用以解决现有技术存在的使用的RAPD、ISSR等共显性DNA标记，重复性差、多态性低的问题；本技术的另一目的是提供香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物在古樟遗传多样性分析和古樟谱系分析中的应用，用以解决现有技术难以全面揭示香樟遗传多样性真实水平的问题。
为了实现上述技术目的，本技术采用的技术方案为：香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物，包括11对多态性引物，其引物核苷酸序列如下：CpSNP1上游引物如SEQ ID NO.1所示；CpSNP1下游引物如SEQ ID NO.2所示；CpSNP2上游引物如SEQ ID NO.3所示；CpSNP2下游引物如SEQ ID NO.4所示；CpSNP9上游引物如SEQ ID NO.5所示；CpSNP9下游引物如SEQ ID NO.6所示；CpSNP13上游引物如SEQ ID NO.7所示；CpSNP13下游引物如SEQ ID NO.8所示；CpSNP14上游引物如SEQ ID NO.9所示；CpSNP14下游引物如SEQ ID NO.10所示；CpSNP15上游引物如SEQ ID NO.11所示；CpSNP15下游引物如SEQ ID NO.12所示；CpSNP16上游引物如SEQ ID NO.13所示；CpSNP16下游引物如SEQ ID NO.14所示；CpSNP18上游引物如SEQ ID NO.15所示；CpSNP18下游引物如SEQ ID NO.16所示；CpSNP19上游引物如SEQ ID NO.17所示；CpSNP19下游引物如SEQ ID NO.18所示；CpSNP20上游引物如SEQ ID NO.19所示；CpSNP20下游引物如SEQ ID NO.20所示；CpSNP21上游引物如SEQ ID NO.21所示；CpSNP21下游引物如SEQ ID NO.22所示。
多态性引物的PCR-HRM扩增体系为：上下游引物各10μM，1μL；2×Froget-Me-NotEvaGreen qPCR Master Mix 5μL，H2O 2μL，DNA模板30ng，1μL，体系的总体积为10μL。
多态性引物的PCR-HRM扩增程序为：95℃2min，95℃5s，60℃30s，30-35个循环；95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。
香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物在古樟遗传多样性分析中的应用。
香樟叶绿体SNP分子标记的多态性引物在古樟谱系分析中的应用。
上述应用，包括以下步骤：1)提取不同品种香樟的基因组DNA；2)用权利要求1SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.22所示的引物对步骤1)提取的基因组DNA进行PCR 扩增和HRM分析；3)数据分析叶绿体SNP位点多态性，古樟谱系分析，古樟遗传多样性分析。
有益效果：与现有技术相比，本技术筛选了11对香樟叶绿体基因组SNP分子标记的多态性引物，将其应用在古樟遗传多样性分析和古樟谱系分析中，基于叶绿体单倍型分析显示，不同单倍型分布差异明显，大部分单倍型只存在于特定的群体中，只有少数单倍型为共享单倍型，表明单倍型间存在一定的地理分化。
18个古樟群体的遗传分化系数Fst为0.212，基因流Nm为0.929，表明古樟群体间存在中等的基因流。
本技术的SNP分子标记重复性好，能够全面揭示香樟遗传多样性真实水平，为野生香樟资源保护利用提供理论依据。
附图说明图1是部分单倍体网络图。
具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本技术，但这些实施例并不用来限制本技术。
实施例11)供试材料供试材料来源于香樟自然分布区的18个群体，分别为四川泸州、江西靖安、江西宁都、四川宜宾、贵州道真、广西桂林、江西恩江、江西龙岗、安徽安庆、江西乐安、江西瑞洪、江西萍乡、广东广州、江西南昌、贵州贵阳、贵州荔波、福建武夷山和江苏南京。
选择胸径大于60cm的古樟树，每个个体采集5-10片新鲜叶片干冰运输，经液氮速冻于-80℃冰箱保存。
具体采集群体位置、经纬度、样本数等见表1。
表1 18个古樟群体采样信息来源样本量群体经度纬度四川泸州11SCLZ105.2628.58四川宜宾5SCYB104.2528.25江西靖安7JXJA115.1528.54江西宁都10JAND115.5126.26江西恩江6JXEJ115.4327.31江西龙岗5JXLG115.6026.75江西瑞洪21JXRH116.4328.88江西萍乡10JXPX114.0627.64江西南昌31JXNC115.8228.75江西乐安11JXLA115.7327.28贵州道真5GZDZ107.4328.45贵州贵阳15GZGY106.7226.63贵州荔波5GZLB107.8925.42广西桂林5GXGL110.3025.17安徽安庆14AHAQ117.0430.51广东广州5GDGZ113.3623.19福建武夷山10FJWYS117.9627.67江苏南京15JSNJ118.8432.052)香樟总DNA提取与检测采用改良后的CTAB法进行香樟总DNA的提取，具体操作步骤如下：打开水浴锅，设置65℃预热；取10mL离心管，加入4mL CTAB裂解液与80μL的β-巯基乙醇，放入水浴锅中进行预热；取2g左右香樟叶片，放入预先准备好的研钵中，导入液氮研磨，直至样品呈均匀粉末状，加入上一步骤中的离心管中，放入水浴锅65℃水浴30min，期间每隔5min颠倒混匀；取出离心管，置于冰上冷却三分钟后，加入等体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1)，充分混匀后放入离心机中4℃、12000r离心10min；准备新的10mL离心管，用移液器吸取上清液至新离心管中，再次加入等体积的氯仿异戊醇混合液，混匀后置于离心机中，4℃、12000r离心10min；分别吸取500μL的上清液，分装入3个1.5mL离心管中并分别加入1mL的乙醇和50μL的醋酸钠溶液，颠倒混匀放入冰箱-20℃静置2h，等待絮状物析出；将剩余上清液移至2mL离心管，置于冰箱-20℃备用；准备新的1.5mL离心管，分别加入1mL75％的乙醇溶液，将3个离心管中析出的絮状物挑入新离心管中，涡旋1min，10000r离心5min；小心倒掉乙醇溶液，再加入新的1mL75％乙醇溶液，重复上一步骤；再次倒掉乙醇溶液，利用真空干燥仪进行干燥；加入200μL 1×TE溶液，溶解3h，取出后进行离心，上清液即为所提取的DNA。