生物素标记抗体的免疫荧光方法
免疫荧光检测的基本原理与技术
免疫荧光检测的基本原理与技术免疫荧光检测是一种常用于生物医学研究和临床诊断的技术手段，它通过标记抗体或抗原的荧光探针来实现对特定生物分子的高度敏感和选择性检测，具有很高的灵敏度和分辨率。
本文将介绍免疫荧光检测的基本原理与技术。
一、基本原理免疫荧光检测是基于免疫学理论的，其中最重要的原理是抗体与抗原的特异性结合。
抗原是指能够诱导机体免疫反应并与抗体特异性结合的分子，抗体则是由生物体对抗原刺激产生的特异性蛋白质。
在免疫荧光检测中，首先需要标记荧光物质的抗体或抗原，一般常用荧光染料如荧光素和荧光素同功酶等。
这些荧光染料可以通过共价偶联或非共价结合的方式与抗体或抗原结合，形成荧光标记的抗体或抗原。
当标记好的抗体或抗原与待检测的样品中的目标生物分子结合时，通过荧光显微镜观察，荧光信号可以被捕捉和记录下来。
荧光信号的强弱与待测物质的浓度有关，可以通过定量分析来获得样品中目标生物分子的含量。
因此，免疫荧光检测可以实现对各种生物分子的定性和定量分析。
二、技术步骤免疫荧光检测通常需要进行一系列的步骤，包括试样制备、标记物制备、免疫反应、荧光显微镜观察和结果分析等。
下面将详细介绍每个步骤的具体操作。
1. 试样制备试样制备是免疫荧光检测的第一步，它决定了后续免疫反应的成功与否。
首先需要从待测样品中提取目标生物分子，并将其纯化和浓缩。
这些样品可以是血液、组织、细胞等。
对于血液样品，可以通过离心和纯化步骤来获取血清或血浆，使样品中的干扰物质最小化。
2. 标记物制备标记物制备是将荧光染料与抗体或抗原结合的步骤。
一般来说，需要事先准备好标记物，如标记荧光素的抗体。
标记荧光染料可以通过化学反应或酶促反应将其与抗体或抗原发生结合。
3. 免疫反应免疫反应是免疫荧光检测的核心步骤，它通过免疫荧光染色来实现对样品中目标生物分子的检测。
在进行免疫反应时，将标记好的抗体或抗原加入到准备好的样品中，允许它们与样品中的目标生物分子结合。
随后，对免疫反应进行洗涤和缓冲处理，以去除未结合的抗体或抗原，并减少背景噪音信号。
免疫荧光技术
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四、免疫学方面
该领域应用较多的为间接荧光抗体法，如抗肾上腺皮质抗体、抗肝细胞膜抗
原自身抗体、抗胰岛细胞抗体，抗骨骼肌抗体、抗平滑肌抗体、抗线粒体抗体、 抗胃壁细胞抗体、抗肾小球基底膜抗体，抗组蛋白抗体，抗DNA抗体、抗核抗 体等。用该组织制作冷冻切片为底物片用异硫氰酸荧光素标记抗人IgG。
异硫氰酸荧光素(FITC)
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谢谢！
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免疫荧光技术 常用实验类型
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免疫荧光技术在临床检验中的应用
一、细菌学方面
国内纪宝宏根据对854名不同对象的检查,证实麻风间接荧光抗体吸收 （FLA-ABS） 试验对发现麻风亚临床感染有较高的敏感性和特异性,免疫流行 病学调查如同时使用麻风菌素和FLA-ABS试验,可发现以后可能发展为多菌型 麻风的高危人群,即麻风菌素阴性,FLA-ABS阳性者。 庄玉辉用荧光抗休染色检查脑脊液(CSF)内结核菌，阳性率为28.30，而 抗酸染色法阳性率为18,9帕，后者较前者差。结果表明结核菌用荧光抗体检 查技术检查结脑者的CSF显示快速、敏感等优点，对结核性脑膜炎早期诊断 有意义。
Megakaryocytes with or without anti-megakaryocyte antibodies detected by indirect im-munofluorescent methnod
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36例SLE伴血小板减少患者中抗巨核细胞抗体阳 性者占7例(19. 4% ),30例血小板正常的SLE患者中有2 例(6.7%)，而30名正常人对照组中仅有1例(3.3% )， 后者与SLE伴患者血小板减少患者与正常人对照组相 比，差异有显著性。同时我们发现，在血小板减少和 血小板正常的SLE患者中抗巨核细胞抗体阳性病例在 幼稚巨核细胞分类中无差异(2.8%vs3.3%)。 本研究通过检测抗巨核细胞抗体，初步探讨了自 身抗巨核细胞抗体在SLE伴发血小板减少中的作用。
免疫荧光实验步骤大全
免疫荧光实验步骤大全免疫荧光实验是一种常见的实验技术，用于检测特定抗原和抗体的相互作用。
本文将介绍免疫荧光实验的详细步骤，以供参考。
实验材料准备：- 试验样本（包括细胞或组织）- 抗原或抗体- 包含荧光素的二抗- PBS缓冲液- 荧光显微镜- 封片胶实验步骤：1. 样本制备- 如果是细胞样本，在培养皿中培养并观察细胞的形态和生长状态。
- 如果是组织样本，将组织切片并进行固定，然后反复用PBS缓冲液进行洗涤。
2. 抗原或抗体的固定- 将样本固定在载玻片上，可以使用正硫酸盐和乙醇来进行固定。
- 固定后用PBS缓冲液进行洗涤，以去除多余的固定试剂。
3. 孵育抗原或抗体- 在固定后的样本上加入适量的抗原、抗体或荧光素标记的二抗。
- 在室温下或4摄氏度下孵育一定的时间，以实现抗原和抗体的特异结合。
4. 洗涤- 使用PBS缓冲液洗涤固定后的样本，可多次洗涤以去除非特异性结合。
5. 荧光显微镜观察- 将载玻片放置在荧光显微镜上，调整荧光滤镜组合以观察荧光信号。
- 使用合适的放大倍率观察细胞或组织中特定的抗原或抗体信号。
6. 影像采集与分析- 使用相机或图像采集系统记录荧光显微镜观察到的图像。
- 使用图像分析软件对图像进行处理和分析，如测量荧光强度、定量特定抗原或抗体的表达水平等。
7. 结果和讨论- 分析实验结果，比较不同样本之间的差异。
- 讨论实验结果与研究假设的一致性，并可进行进一步的实验验证。
8. 结论- 总结实验结果，并得出相应的结论。
- 可以进一步讨论实验结果在相关领域的应用和意义。
9. 实验清理- 定期清洗和消毒实验室工作区域和仪器设备，以确保实验环境的卫生和安全。
以上是免疫荧光实验的基本步骤，每一步都需要仔细操作和控制实验条件。
在实验过程中，要注意遵守实验室安全操作规范，确保自己和他人的安全。
希望本文对您的科研工作有所帮助！。
免疫荧光的技术介绍
免疫荧光的技术介绍免疫荧光技术是一种基于抗原-抗体反应的荧光标记技术，常用于生物医学研究领域中的细胞、组织以及溶液等样本的分析和检测。
以下是关于免疫荧光技术的详细介绍：1.技术原理免疫荧光技术利用抗原-抗体反应的特异性，将荧光标记物与抗体结合，从而实现对样本中特定抗原的精确检测。
抗原-抗体反应具有高度的特异性和灵敏性，使得免疫荧光技术成为一种具有高分辨率和高灵敏度的分析方法。
2.常用样本类型免疫荧光技术适用于多种类型的样本，包括细胞、组织、溶液等。
其中，细胞样本可以是单细胞悬液、细胞培养物或组织切片等；组织样本可以是病理切片、器官组织等；溶液样本则可以是血清、尿液、脑脊液等体液成分。
在制备样本时，需要保持样本的稳定性和活性，以便进行后续的实验操作。
3.标记方法免疫荧光技术的标记方法主要包括荧光素、生物素、抗生物素等。
其中，荧光素是最常用的标记物之一，其具有高荧光量子产率、良好的光稳定性以及优良的生物相容性等特点。
生物素和抗生物素则是一对亲和素和抗亲和素的标记物，可以用于放大免疫反应的信号，提高检测的灵敏度。
此外，标记过程中的关键控制参数包括抗体浓度、孵育时间、温度和pH值等，需要根据实验的具体情况进行优化和调整。
4.荧光显微镜观察在进行免疫荧光实验时，需要使用荧光显微镜对样本进行观察和拍照。
荧光显微镜的基本构造包括激发光源、滤光片、目镜和物镜等部分。
在观察时，需要选择适当的激发光源和滤光片，以最大程度地激发荧光信号并抑制背景噪声。
同时，需要调节物镜和目镜的焦距，以便清晰地观察到样本中的荧光信号。
拍照时，需要选择合适的曝光时间和增益，以便真实地记录样本中的荧光信号。
5.数据分析与解释对于观察到的荧光信号，可以使用相关的图像分析软件进行定性和定量分析。
这些软件通常具备多种图像处理功能，如背景噪声的去除、信号强度的测量、目标区域的识别等。
结合文献资料，可以对数据分析结果进行深入探讨，从而得出有关样本中抗原分布和含量的有价值的信息。
免疫荧光(单标和双标)注意事项及具体方法
免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法一、技术简介免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验流程免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1. 所需材料与试剂：a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。
b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。
d. 封闭液。
e. 0.01mol／LPBS缓冲液。
2. 染色方法：a. 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。
b. 加入0.3%的Tritonx-100，37℃，30 rain。
c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。
d. 正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
e. 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。
抗体以0.01mo/LPBS稀释（理想的抗体浓度需经试验而定）。
f. 用0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5min，0.01 M PBS洗5 rain。
免疫荧光技术操作步骤
免疫荧光技术操作步骤一. 直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。
其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。
试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4 的PBS 进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液1 份配制搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4 的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。
实验步骤1. 滴加0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。
2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）。
3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4 的PBS 冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4 的PBS 三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。
4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。
待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。
注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在1：20-100 之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min 到数小时，一般30 min 已足够。
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L 板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
免疫荧光技术原理与步骤
免疫荧光技术原理与步骤免疫荧光技术（immunofluorescence）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术，它通过利用抗体与特定抗原结合后对细胞或组织中的抗原进行标记，然后利用荧光显微镜观察标记物的位置和分布情况。
本文将介绍免疫荧光技术的原理和步骤，帮助读者更好地了解和应用这一技术。
原理。
免疫荧光技术的原理基于抗体与抗原的特异性结合。
当特异性抗体与其相应的抗原结合后，可以利用荧光染料标记抗体，使其在荧光显微镜下发出特定颜色的荧光信号。
这样就可以通过观察荧光信号的位置和强度来确定抗原在细胞或组织中的分布情况。
步骤。
免疫荧光技术的步骤通常包括样品处理、抗体标记、荧光染料标记和观察四个主要步骤。
1. 样品处理。
样品处理是免疫荧光技术的第一步，它包括固定、脱水和透明化等步骤。
固定是为了保持细胞或组织的形态结构和抗原的稳定性，常用的固定剂包括乙醇、乙酸和乙醛等。
脱水和透明化则是为了使样品透明，便于观察。
2. 抗体标记。
抗体标记是免疫荧光技术的关键步骤，它需要选择特异性较好的一抗和二抗。
一抗是直接与抗原结合的抗体，而二抗是与一抗结合的抗体。
在这一步骤中，需要将一抗和二抗分别标记上荧光染料。
3. 荧光染料标记。
荧光染料标记是将标记好荧光的抗体与样品中的抗原结合，形成荧光信号。
这一步骤需要在暗处进行，以避免荧光信号受到光照的干扰。
4. 观察。
观察是免疫荧光技术的最后一步，通过荧光显微镜观察标记物的位置和分布情况。
在观察过程中，需要根据实验设计选择合适的荧光滤光片，以获得清晰的荧光图像。
总结。
免疫荧光技术是一种重要的生物医学研究和临床诊断技术，它通过标记抗体和抗原来观察细胞或组织中特定蛋白的位置和分布情况。
掌握免疫荧光技术的原理和步骤，可以帮助科研工作者和临床医生更好地开展相关工作，为生物医学领域的发展做出贡献。
免疫荧光技术原理与步骤
免疫荧光技术原理与步骤
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。
主要用于检测细胞内物质的定性、定位、定量及动态变化。
免疫荧光技术的基本原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来检测目标分子。
具体步骤如下：
1. 制备样本：将要检测的样本制备成适当的形式，如细胞涂片、组织切片等。
2. 固定样本：使用适当的固定剂将样本固定，以保持其形态和结构。
3. 抗原修复：对于某些样本，需要进行抗原修复以暴露抗原表位，使抗体能够更好地结合。
4. 封闭：使用适当的封闭液封闭样本表面的非特异性结合位点，以减少背景噪音。
5. 加一抗：将特异性的一抗加入样本中，使其与目标抗原结合。
6. 洗涤：洗涤样本以去除未结合的一抗。
7. 加二抗：将荧光标记的二抗加入样本中，使其与一抗结合。
8. 洗涤：再次洗涤样本以去除未结合的二抗。
9. 荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察样本，在合适的激发波长下，荧光标记的二抗将显示出荧光信号，从而指示目标抗原的存在和定位。
免疫荧光技术可以应用于多种领域，如细胞生物学、免疫学、遗传学等。
它不仅可以用于检测蛋白质、核酸等生物大分子，还可以用于检测细胞表面标志物、细胞内细胞器等。
需要注意的是，免疫荧光技术的结果解读需要结合荧光显微镜的成像特点和抗体的特异性等因素进行综合分析。
同时，在实验过程中需要严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可靠性。
免疫荧光技术（immunofluorescencetechnique）又称荧光抗体技术
免疫荧光技术免疫荧光技术（immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。
始创于40年代初，1942年coons等多次报道用异氰酸荧光素标记抗体。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
免疫荧光技术包括荧光抗体技术和荧光抗原技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。
主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
一、实验的基本原理免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。
由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。
免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验方法1、直接法这是荧光抗体技术最简单和基本的方法。
滴加荧光抗体于待检标本片上，经反应和洗涤后在荧光显微镜下观察。
标本中如有相应抗原存在，即与荧光抗体特异结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。
此法的优点是简单、特异。
但其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法。
图一、直接免疫荧光法原理示意图2、间接法根据抗球蛋白试验的原理，用荧光素标记抗球蛋白抗体(简称标记抗抗体)的方法。
检测过程分为两步：第一次，将待测抗体(第一抗体)加在含有已知抗原的标本片上作用一定时间，洗去未结合的抗体。
第二，滴加标记抗抗体。
如果第一步中的抗原抗体已发生结合，此时加入的标记抗抗体就和已固定在抗原上的抗体(一抗)分子结合，形成抗原-抗体-标记抗抗体复合物，并显示特异荧光。
此法的优点是敏感性高于直接法，而且无需制备一种荧光素标记的抗球蛋白抗体，就可用于检测同种动物的多种抗原抗体系统。
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生物素标记抗体的免疫荧光方法
生物素标记抗体的免疫荧光方法
*重要提示：在开始实验前请查阅所用抗体的说明书中第一页应用（APPLICATIONS）部分，确认这支抗体已经验证过可用于你计划采用的本实验方法中的特定方案。
A.所需溶液和试剂
注意：用Milli-Q超纯水或是相当级别的水配制溶液。
1.10 X磷酸盐缓冲液(PBS): 1升水中加入80 g 氯化钠(NaCl), 2 g 氯化钾(KCl), 14.4 g 磷
酸氢二钠(Na2HPO4) and 2.4 g 磷酸二氢钾(KH2PO4)。
调整pH 到7.4。
2.甲醛溶液，16%，无甲醇的类型，Polysciences, Inc. (cat# 18814) ，现配现用。
开封
以后放在4°C避光保存。
使用时用PBS稀释。
3.二甲苯
4.无水乙醇，组织学级，100%和95%。
5.蒸馏水(dH2O)
6.封闭缓冲液：配制25ml时，2.5 ml 10X PBS和1.25ml正常血清（来源与二抗相同，
例如正常山羊血清，正常驴血清）兑到21.25ml的蒸馏水中，混匀。
边搅拌边加入75μL Triton X-100(100%)
7.抗体稀释缓冲液配置40ml时，取4 ml 10X PBS兑入36 ml蒸馏水，混匀。
加入0.4
BSA，使溶解。
边搅拌边加入120μL Triton X-100(100%)。
8.10 mM 柠檬酸钠缓冲液配置1L时，称取2.94g二水合柠檬酸三钠(C6H5Na3O7?2H2O)
溶解在1L蒸馏水中。
调整pH为6.0。
9.荧光素标记的抗生物素蛋白Avidin/Streptavidin
注意：第一次使用不论是一抗还是荧光素标记的抗生物素蛋白
Avidin/Streptavidin时，都需要做滴定分析以判断何种稀释比例能在你的样品上得到最强的特异信号同时背景保持最低
11.Prolong? Gold 抗淬灭试剂(Invitrogen, Eugene, OR, Cat# P36930)
B.样品制备
I.细胞系培养物来源(IF-IC)
重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-IC。
注意：细胞应直接在多孔板，腔室玻片或是盖玻片上直接培养，处理，固定和染色。
1.用PBS稍加润洗。
2.吸去PBS，将细胞泡在2-3 mm厚的2-4%甲醛溶液（PBS配制）中。
注意：甲醛有毒，需要在通风橱中操作。
3.室温下固定细胞15分钟。
4.吸去固定剂，用PBS润洗三次，每次五分钟。
5.甲醇打孔步骤（是否需要参考抗体说明首页）在甲醛固定后，将细胞浸泡在冰纯甲
醇中（加入足量甲醇完全盖住细胞，液层厚度在3-5mm，千万别让细胞干掉），–20°C 孵育10分钟。
用PBS润洗5分钟。
6.继续C部分的免疫染色。
II.石蜡切片(IF-P)
重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-P。
脱蜡处理/再水化
1.用二甲苯浸洗切片3次，每次5分钟。
2.用无水乙醇浸洗切片2次，每次10分钟。
3.用95%乙醇浸洗切片2次，每次10分钟
4.在蒸馏水中润湿2次，每次5分钟。
抗原暴露：
1.室温下，将切片泡在10 mM柠檬酸盐缓冲液中（pH 6.0.）。
2.用水浴锅或是微波炉加热泡在柠檬酸盐缓冲液中的玻片使之接近沸腾，保持95-99°C
约10分钟。
3.取出玻片，放在实验台上自然冷却30分钟。
4.在蒸馏水中润洗3次，每次5分钟。
5.在PBS中润洗5分钟。
6.继续C部分的免疫染色。
III. 冰冻切片(IF-F)
重要提示：查阅说明书中APPLICATIONS部分，确认所用抗体可用于IF-F。
1.用PBS配置的2-4%甲醛溶液浸泡切片。
注意：甲醛有毒，这一步需要在通风橱中进行。
2.室温下，固定15分钟。
3.用PBS润洗3次，每次5分钟。
C. 免疫染色
注意：以下所有的孵育过程，除特殊说明外，需要在室温下的避光湿盒中进行，以免切片变干和荧光淬灭。
注意：本身高表达生物素的细胞或是组织需要用生物素封闭试剂盒在开始第一步前预先处理(比如Endogenous Biotin-Blocking Kit, Invitrogen Cat. #E21390)。
1.将样品在封闭液中封闭60分钟。
2.封闭结束前，按说明书的指示用抗体稀释缓冲液稀释一抗。
3.吸去封闭液，加入稀释的一抗。
注意：在做双染时，将两种抗体按各自合适的比例加入到抗体稀释缓冲液中配成混合液。
4.在4°C孵育过夜。
5.用PBS润洗3次，每次5分钟。
6.把荧光素标记的抗生物素蛋白Avidin/Streptavidin稀释在抗体稀释液中，将样品与稀
释抗体在室温下避光孵育1-2小时。
7.用PBS润洗3次，每次5分钟。
8.涂上Prolong? Gold抗淬灭试剂后盖上玻片。
处理多孔板时，抗淬灭试剂盖住细胞细
胞即可。
9.在盖玻片的周围涂上指甲油密封。
10.立即在显微镜下用相应波长激发光观察样品可以得到最佳的效果。
如果要长期保存，
将玻片放在4°C避光保存。