热稳定葡萄糖脱氢酶的表达及在合成L-叔亮氨酸中的应用
L-赖氨酸的生产工艺研究
L-赖氨酸的发酵生产工艺研究摘要: L-赖氨酸是人体和动物所不能合成的八种必需氨基酸中最重要的一种。
L-赖氨酸是国际市场上发展前景良好的产品，消费需求每年以7-10%的速度递增，国内年产量则以每年20-30%以上的速度递增。
其广泛应用于医药、食品和饲料等领域。
目前生产赖氨酸最主要的方法是微生物发酵法。
本文从赖氨酸的生产现状、生产方法，发酵过程中的代谢调控以及赖氨酸生产菌种的选育和生产赖氨酸的前景展望这几个方面综述了赖氨酸生产工艺。
关键词: 赖氨酸；发酵；菌种；展望前言赖氨酸(Lysine) 的化学名称为2，6-二氨基己酸，有L-型(左旋)、D-型(右旋)和DL 型(消旋)三种旋学异构体。
赖氨酸是人和动物营养的必需氨基酸之一，不能参加转氨作用[1]。
人类和动物可吸收利用的只有L型。
它对调节体内代谢平衡、提高体内对谷类蛋白质的吸收、改善人类膳食营养和动物营养、促进生长发育均有重要作用。
L-赖氨酸主要用于医药、食品和饲料工业。
全球约9 0％的赖氨酸用作饲料添加剂，约5％用作食品添加剂，其余5％用作医药中间体[2]。
目前，全球赖氨酸年总需求量约为85万t/a，年增长率为7％一8％。
现全球赖氨酸总产能约为80万t/a，产量较大的是日本味之素公司(26万t/a)、美国ADM公司、BASF韩国公司和协和发酵工业公司等。
国内赖氨酸需求量估计在13万t/a左右。
赖氨酸应用范围较广，2003年以后，我国已成为全球最大的赖氨酸生产大国。
目前已建成和正在建设的赖氨酸厂主要有广西赖氨酸公司、福建大泉赖氨酸有限公司、四川川化味之素有限公司、大成赖氨酸厂、肇东赖氨酸厂等。
文章从赖氨酸的生产现状、生产方法，发酵过程中的代谢调控以及赖氨酸生产菌种的选育和生产赖氨酸的前景展望等方面论述了赖氨酸生产工艺的研究进展。
1赖氨酸生产现状L-赖氨酸最初是从蛋白质水解物中分离得到的，蛋白质水解法一般以动物血粉为原料，此法最多的特点是工艺流程简单，但是原料来源很有限，仅适合小规模生产。
糖的代谢习题
第七章一、名词解释1.代谢：生物活体与外界环境不断进行的物质（包括气体、液体和固体）交换过程。
2．糖酵解：糖的无氧酵解是指葡萄糖在无氧条件下分解生成乳酸并释放出能量的过程。
其全部反应过程在胞液中进行，代谢的终产物为乳酸，一分子葡萄糖经无氧酵解可净生成两分子ATP。
3．糖有氧氧化：葡萄糖在有氧条件下彻底氧化分解生成CO2和H2O，并释放出大量能量的过程称为糖的有氧氧化。
绝大多数组织细胞通过糖的有氧氧化途径获得能量。
4．三羧酸循环：三羧酸循环是指在线粒体中，乙酰CoA首先与草酰乙酸缩合生成柠檬酸，然后经过一系列的代谢反应，乙酰基被氧化分解，而草酰乙酸再生的循环反应过程。
这一循环反应过程又称为柠檬酸循环或Krebs循环。
5．磷酸戊糖途径：磷酸戊糖途径是指从G-6-P脱氢反应开始，经一系列代谢反应生成磷酸戊糖等中间代谢物，然后再重新进入糖氧化分解代谢途径的一条旁路代谢途径。
是体内生成NADPH的主要代谢途径，是体内生成5-磷酸核糖的唯一代谢途径。
6．糖异生作用：由非糖物质转变为葡萄糖或糖原的过程称为糖异生。
在肝脏中进行。
其途径基本上是糖酵解过程的逆过程。
7．三碳途径：肝中可经糖异生途径利用糖无氧酵解产生的丙酮酸、乳酸等三碳化合物来合成糖原的过程，就是肝糖原合成的三碳途径或间接途径。
8．光合作用：绿色植物、光合细菌或藻类等将光能转变成化学能的过程，即利用光能，由CO2和H2O 合成糖类化合物并释放出氧气的过程，称为光合作用。
9．光反应：光能转变成化学能的反应，即植物的叶绿素吸收光能进行光化学反使水分子活化分裂出O2、H+和释放出电子，并产生NADPH和ATP。
10．暗反应：由光反应产生的NADPH在ATP供给能量情况下，将CO2还原成糖的反应过程。
这是一个酶催化的反应过程，不需要光参加，所以称为暗反应。
11．光合磷酸化：通过光激发导致电子传递与磷酸化作用相偶联合成ATP的过程，称为光合磷酸化。
12．脂类：脂类是生物体内不溶于水而溶于有机溶剂的一大类物质的总称。
手性化合物苊醌的合成及性能研究
一、绪论（一）生物催化手性合成的产生与发展手征性是一切生命的基础。
因此人体及动植物对药物等有精确的手性识别作用。
旋光性化合物通常只有一种对映体具有特定的生理活性，其它异构体则无此活性，甚至有毒副作用。
60年代欧洲和日本一些孕妇因服用镇静剂外消旋沙利度胺而造成数千计的胎儿畸形，成为医药史上一个悲剧[1]。
随着社会的发展，人们对单一旋光物质的需求将会越来越高。
在这种需求下，生物催化技术得到了进一步的应用。
生物催化的手性合成是指利用纯酶或生物有机体催化无手性、潜手性化合物转变成为手性产物的过程。
生物催化中常用的有机体主要是微生物，其本质是利用微生物细胞内的酶催化非天然有机化合物的生物转化。
固定化酶和固定化细胞技术可使生物催化反应在固定床内连续进行生物转化，这将使生物催化法具有工业化应用价值。
因为生物催化的手性合成具有反应条件（温度、压力和pH值）温和、环境友好、效率高和高选择性的特点，使它成为当今手性合成方法研究的热点和发展方向。
人类利用细胞内酶作为生物催化剂实现生物转化已有几千年的历史了。
我国劳动人民在距今约8000年至4500年间，已发明了制曲酿酒工艺，在2500年前的春秋战国时期，已能制酱和醋。
在酿酒工艺中，利用霉菌淀粉酶对谷物淀粉进行糖化，然后利用酵母菌进行酒精发酵。
真正对酶的认识和应用还要归功于近代科学技术的发展。
酶这一术语在1867年由库内创造用以表述催化活性。
1894年，菲舍尔提出了“锁钥学说”用来解释酶作用的立体专一性。
1897年布赫奈纳等发现酵母的无细胞提取物也具有发酵作用，可以使葡萄糖转化为乙醇和二氧化碳[2]。
这些工作为近代酶学奠定了基础。
1858年，巴斯得研究发现外消旋酒石酸铵在微生物酵母或灰绿青霉生物转化下，天然右旋光性（+）-酒石酸铵盐会逐渐被分解代谢，而非天然的（-）-酒石酸铵盐被积累而纯化，该过程被称为不对称分解作用，而巴斯得也成为手性化合物研究的先驱。
1906年，瓦尔堡采用肝脏提取物水解消旋体亮氨酸丙酯制备L-亮氨酸。
脲酶在生物工程中的应用
生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2009年第3期·综述与专论·收稿日期：2008-11-13基金项目：“十一五”奶业国家科技支撑计划（2006BAD12B08，2006BAD04A10）作者简介：赵圣国（1984-），硕士研究生，研究方向：瘤胃微生物及酶学通讯作者：王加启，研究员，博士生导师，主要从事反刍动物营养和牛奶质量改良研究；E -mail ：wang -jia -**********脲酶（urease ），又称尿素酶或酰胺水解酶，编号为EC 3.5.1.5，是人类首次获得晶体的镍离子金属酶。
它能催化尿素水解，产生二氧化碳和氨，其催化反应速度是常规化学催化的1014倍。
在自然界中，很多生物体都能合成脲酶，如细菌、植物和真菌。
脲酶有助于植物和微生物体利用内源性和外源性尿素作为氮源，并能将分解产生的氨合成机体蛋白质[1]。
脲酶能够参与植物系统氮转运通路和毒素的伤害[2]；参与反刍动物尿素再循环系统；还能引起人类和动物的胃肠道感染疾病的发生，如幽门螺杆菌脲酶导致胃炎，能引起尿路感染并诱导产生尿结石[3]。
因此，很多研究是针对如何寻找脲酶抑制剂，来抑制脲酶活性，保护机体感染或提高机体对氮的利用率。
同样脲酶蛋白自身的用途也非常广泛，尤其是近年来固定化脲酶技术大发展，极大的拓宽了脲酶的应用范围。
目前脲酶蛋白广泛应用于医学生化检测、工业制造和环境保护中。
现就脲酶蛋白在化学和临床分析、环境保护、生物医药工程、食品饮品和太空飞船水循环中的应用作一综述。
1固定化脲酶游离脲酶由于活力不易保持、难于重复利用和脲酶在生物工程中的应用赵圣国1，2王加启1刘开朗1李旦1于萍1卜登攀1魏宏阳1周凌云1李发弟2（1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室，北京100193；2甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州730070）摘要：脲酶是一种高效的尿素分解催化剂，化学反应速度是常规化学催化的1014倍，广泛应用于工业、农业和医药行业。
13_异亮氨酸
第十三章异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵第一节分支链氨基酸的生物合成途径和代谢调节机制在L型异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）和缬氨酸（Val）的分子中，都具有由甲基侧链形成的分枝结构（见表13-1），故称上述三种氨基酸为分枝链氨基酸（branched chain amino acids）。
分枝链氨基酸是合成蛋白质的素材，可以作为生物体的能源，也作为生物体成分的前体。
但是，高等动物不能合成这三种氨基酸，故Ile、Leu、Val称为必需氨基酸。
目前，分枝链氨基酸主要用作氨基酸输液的原料。
表13-1 分枝链氨基酸的结构名称结构式分子式分子量异亮氨酸（Ile）C6H13O2N 131.18亮氨酸（Leu）C6H13O2N 131.18缬氨酸（Val）C5H11O2N 117.15Ile分子内有两个不对称碳原子，因而，Ile存在着D、L、D别、L别四种光异构体（表13-2）。
很难用化学合成法，或用化学合成法与酶法相组合的方法，廉价制造纯度高的L型Ile。
Leu与Val分别只有两个光学异构体，能够用化工合成、酶法分割的方法，较廉价地制造。
要廉价生产高纯度的L型Ile，只有采用发酵法，因此，Ile发酵就成了分枝链氨基酸发酵的中心问题。
然而，从自然界中，只找到了分泌Leu或Val的菌株，却找不到分泌Ile的菌株。
直到20世纪60年代后半期，随着氨基酸生物合成系反馈调节机制的全部搞清，可以通过选育目的氨基酸代谢拮抗物抗性株的方法，从遗传上解除原菌株的反馈调节机制，从而可以利用这种抗性菌株，由糖直接发酵生产Ile（Leu或Val）。
表13-2 Ile的四种光学异构体L-Ile D-Ile D-别Ile L-别Ile 1960年，经过用粗糙链孢霉、大肠杆菌的营养缺陷型突变株，及用放射性同位素标记的前体，进行研究的结果，确定了Ile、Leu及Val的生物合成途径（图13-1）。
出于V aI和Leu的所有碳原子，都来自于丙酮酸，所以，V al及Leu亦称丙酮酸族氨基酸。
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热稳定葡萄糖脱氢酶的表达及在合成L-叔亮氨酸中的应用
葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase,GDH,EC1.1.1.47)属于短链脱氢酶/
还原酶(Short-chain dehydrogenases/reductase,SDRs)。它具有四个相同亚基
(28.2×4kDa),能够催化D-葡萄糖为D-葡萄糖酸内酯,同时还原NAD(P)+为
NAD(P)H。
近些年,GDH的研究取得了一定进展,已经应用到很多领域,例如辅酶再生、
临床检测和生物燃料电池等。早期的GDH来源主要是动物新鲜肝脏,目前大部分
由微生物发酵而来。
国内的GDH产量还不高,主要依靠进口。本文研究的葡萄糖脱氢酶(GDH)来源
于巨大芽孢杆菌(Bacillus megtaterium IWG3)的一个突变体GDH-DN46[1],其通
过定向进化和96孔板法获得,提高了酶的热稳定性和耐碱性,不管NaCl的存在与
否都不会对这种突变酶的催化活性产生影响。
这种氧化还原酶在催化反应中需要依赖辅酶NAD(P)+,但辅酶价格昂贵并且
稳定性差,这大大限制了氧化还原酶在工业催化方面的应用[2]。本文以GDH的突
变体GDH-DN46作为研究对象,通过构建重组质粒并在大肠杆菌中成功表达,优化
表达条件提高酶的活性,研究该酶酶学性质。
将其用于辅酶再生系统,用以催化合成L-叔亮氨酸。同时本论文建立了可利
用仿生辅酶的GDH的高通量筛选平台,探索仿生辅酶替代NAD(P)+在工业催化方
面的应用。
论文的主要研究内容如下:1.构建了在大肠杆菌E.coli BL21中高效表达
GDH的重组表达质粒pET28a-GDH,E.coliBL21(pET28a-GDH)的酶活可达到 0.95
U/mg。对重组菌的培养和诱导条件进行优化,优化后的酶活提高到1.52 U/mg,比
初始酶活提高了 60%。
2.对GDH的酶学性质进行研究,通过研究温度对其酶活性的影响,该酶最适
温度为50℃,其酶活比在30℃测量条件下的酶活提高了 30%,最适pH是7.0,具
有很高的耐碱性。3.分别构建葡萄糖脱氢酶(GDH)和亮氨酸脱氢酶(LeuDH)表达质
粒pET28a-GDH和pET20b-LeuDH,并将其转化到大肠杆菌E.Coli BL21中,获得双
质粒表达系统E.Coli BL21(pET28a-GDH/pET20b-LeuDH)。
与用亮氨酸脱氢酶全细胞催化三甲基丙酮酸(TMP)生产L-叔亮氨酸的转化
率相比,双质粒表达系统全细胞催化合成的转化率提高了约三倍。4.研究了通过
定向进化筛选可利用仿生辅酶的GDH方法,建立了可利用仿生辅酶高通量筛选平
台,通过研究不同染料对辅酶NADH的颜色反应,确定高通量筛选染料为氮蓝四唑
(NBT)。
得到优化的筛选平台配方是:Tryptone 1%;Yeast extract 0.5%;NaCl
1%;Agar 1.8%;NBT O.1mg/mL;PMS 0.01 mM;Kan 0.05 mM;IPTG 0.1 mM;Glucose 1
mM;NMN+ 0.05 mM。通过对重组菌 700C 热处理1小时,可以使胞内辅酶NADH分
解,通过热处理可以有效避免显色筛选过程中胞内的辅酶NADH产生的背景干扰。