芽孢杆菌胞外多糖的结构初步分析_万红贵
产胞外多糖乳杆菌的筛选及其多糖的分离、结构和生物活性研究
产胞外多糖乳杆菌的筛选及其多糖的分离、结构和生物活性研究乳酸菌胞外多糖（LAB EPS）是乳酸菌在其生长、代谢过程中分泌到细胞外的粘液或荚膜多糖。
LAB EPS不仅具有重要的物理化学特性，如良好的流变学特性，能改善发酵乳的粘度、质构和口感，防止缩水和乳清析出，使产品增稠、稳定，质地细腻均匀，口感润滑。
而且LAB EPS还具有良好的生理活性，如抗肿瘤、免疫调节、抗病毒、抗溃疡、抗氧化、降胆固醇、降血压等，还可作为益生元促进肠道内其他益生菌的生长，调节肠道菌群。
近年来关于乳酸菌和乳酸菌胞外多糖的研究成为热点。
本文对产胞外多糖的乳杆菌的筛选和鉴定、多糖的分离纯化、多糖的生物活性、分子特性以及结构进行了研究。
主要研究结果如下：采用菌落拉丝法与多糖产量相结合的方法，从健康人体粪便中筛选到一株产EPS较高的Lactobacillus rhamnosus KF5。
该菌株在脱脂乳中培养产230mg/L的EPS。
研究了菌株KF5的生物学特性，该菌株在MRS培养基中生长良好，最适生长温度37℃，最适生长pH6.0，能够在含7%NaCl的MRS中生长。
菌株KF5在胆盐浓度0.2%以下，生长良好，能够耐受0.3%的胆盐。
菌株KF5耐酸性能好，在pH3.0的环境下，保持3h活菌数几乎不下降。
菌株KF5具有很强的粘附能力（23个bacteria/Caco-2细胞），优于对照菌株LGG（9个bacteria/Caco-2细胞）。
抑菌实验表明，菌株产酸抑制S. aureus、E. coli和B. subtilis的生长。
KF5的发酵乳经煮沸、离心、乙醇沉淀、除蛋白、透析、冷冻干燥得到粗多糖。
粗多糖经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析分离得到中性糖组分EPS1和酸性糖组分EPS2，再分别经Sephacryl HR S200和Sepharose Cl-6B凝胶柱分离，获得均一组分S1和S2。
结合HPSEC分析、紫外分析，两组分均不含蛋白。
多糖结构分析
一：多糖中的单糖组分分析一般对多糖进行完全水解，水解条件：封管0.5~3M硫酸或1~6M盐酸，80℃~100℃水解2.5~8h 即可。
或控制水解条件，进行逐步水解，如封管0.025M硫酸，100℃水解15min，30min，45min 等，水解液用碳酸钡或氢氧化钡中和，滤液浓缩后可用纸层析、薄层层析、气相层析或高压液相层析等鉴定。
二：相邻单糖基连接方式分析将甲基化多糖水解得到甲基化的单糖，而此单糖上甲基化之羟基所在的碳原子就是连接键所在。
高碘酸氧化是定量反应，Smith降解是将高碘酸氧化产物进行还原，酸水解或部分水解，从高碘酸的消耗量和不同产物的生成，便可进行糖苷键位置的判断-产物中若有一分子比例的甲酸生成而消耗两分子比例的高碘酸根时，表明多糖的非还原末端或非末端部分有1-6苷键相连的单糖基存在；产物中若有赤藓醇生成，则提示有1-4结合苷键；若有甘油生成，有1-6、1-2结合的苷键或有还原性末端葡萄糖基等；若产物中能检出单糖，如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等，则有1-3苷键存在。
结合¹³C-NMR确定连接位置。
三：端基碳苷键构型分析1：酶解实验：不被淀粉酶水解的多糖，无α-苷键，与纤维素酶有作用者，存在β-苷键。
2；IR：α-型差向异构体的C-H键在844±8cm‾¹处有一个吸收峰；β-型的C-H键在891±7cm‾处有一个吸收峰。
但是，海藻糖、阿洛糖和异阿洛糖的α-型和β-型同时存在的情况下，就不能以次来判断。
3：¹H-NMR：端基碳的δ值大于5.00ppm者，糖苷键为α-型，小于5.00ppm者，则为β-型。
4；¹³C-NMR：α-型连接的C₁化学位移在97-101ppm，β-型的在103~105ppm。
对甘露聚糖不能用化学位移判断α-型或β-型。
可用裂分常数决定，一般¹Jｃ-ｈ=170HZ，为α-型，160HZ 者为β-型。
解淀粉芽孢杆菌胞外多糖发酵条件的优化
解淀粉芽孢杆菌胞外多糖发酵条件的优化
1. 背景介绍
解淀粉芽孢杆菌是一种能够合成胞外多糖的细菌，其胞外多糖具有广泛的生物活性和应用价值。
因此，解淀粉芽孢杆菌的胞外多糖发酵条件的优化具有重要的理论与应用价值。
2. 胞外多糖发酵条件的影响因素
胞外多糖发酵的关键因素主要包括菌株的选择、培养基的配方、发酵条件等。
其中，菌株的选择是胞外多糖产量的前提条件，培养基的配方是为了提供充足的营养和能量，而发酵条件则是控制细胞代谢和增加胞外多糖产量的关键。
3. 菌株的筛选与选择
根据文献报道，目前已知世界上有多个不同的解淀粉芽孢杆菌菌株能够产生胞外多糖。
因此，采用较高的胞外多糖产量的菌株进行后续的优化实验。
4. 培养基的配方优化
常见的培养基配方包括碳源、氮源、微量元素等。
在碳源方面，常用的有葡萄糖、玉米粉等。
在氮源方面，可以使用天然的酵母粉、食用菇粉等。
此外，添加若干微量元素，如MgSO4、KH2PO4等，则有助于产生胞外多糖的合成。
5. 发酵条件的优化
针对细胞代谢和胞外多糖合成，一些发酵条件需要进行优化，比
如 pH 值控制、温度、搅拌条件、氧气输送等。
据文献报道，较好的
pH 值是以5.0~7.0为宜，温度以30°C为宜。
此外，适当的搅拌条件
和氧气输送有利于微生物的生长和胞外多糖的合成。
6. 结论
综上所述，解淀粉芽孢杆菌胞外多糖发酵条件的优化是多方面综
合影响的结果。
通过选择较高的胞外多糖产量的菌株，配制合适的培
养基，以及优化发酵条件等措施，可以有效增加胞外多糖的合成产量，具有重要的理论意义和实践应用价值。
甲基营养型芽孢杆菌产胞外多糖发酵条件及生物活性研究
第38卷第2期2020年3月食品科学技术学报Journal of Food Science and TechnologyVol.38No.2Mar.2020 doi:10.3969/j.issn.2095⁃6002.2020.02.007文章编号:2095⁃6002(2020)02⁃0048⁃11引用格式:蔡淼,陈超,曹永强,等.甲基营养型芽孢杆菌产胞外多糖发酵条件及生物活性研究[J].食品科学技术学报,2020, 38(2):48-58.CAI Miao,CHEN Chao,CAO Yongqiang,et al.Research on fermentation conditions and bioactivity of exopolysaccharide produced by Bacillus methylotrophicus[J].Journal of Food Science and Technology,2020,38(2):48-58.甲基营养型芽孢杆菌产胞外多糖发酵条件及生物活性研究蔡 淼1, 陈 超2, 曹永强2, 杨贞耐1,*(1.北京工商大学北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京 100048;2.东君乳业(禹城)有限公司,山东德州 253000)摘 要:针对一株从传统酒曲中分离出的高产胞外多糖的菌株,经16S rDNA鉴定,得知该菌株为甲基营养型芽孢杆菌GSBm-1,采用单因素实验及响应面法优化其培养条件㊂实验结果表明,在培养基组成为酵母提取物5.0g/L㊁胰蛋白胨10.0g/L㊁氯化钠10.0g/L㊁大豆蛋白胨40.0g/L㊁蔗糖26.0g/L㊁pH值6.26,培养温度37℃㊁培养时间48h㊁转速140r/min㊁接种量4%的条件下,胞外多糖的产量达到最大值,为(520.1±1.2)mg/L㊂对胞外多糖的生物学活性进行研究,结果表明,胞外多糖具有抗氧化作用,能够清除DPPH和ABTS+自由基,对Fe2+有螯合能力㊂此外,胞外多糖对α⁃葡萄糖苷酶有抑制作用,因此具有降血糖作用㊂实验结果以期为微生物胞外多糖的工业生产以及食品产业的功能性原料研发提供技术参考㊂关键词:芽孢杆菌;胞外多糖;发酵条件;抗氧化;降血糖中图分类号:TS201.3;TQ929.2 文献标志码:A收稿日期:20190722基金项目:国家自然科学基金面上项目(31871823);北京市人才培养质量建设项目(PXM2019_014213_000010);北京工商大学大学生科研与创业行动计划项目(G001)㊂第一作者:蔡 淼,女,硕士研究生,研究方向为乳品生物技术㊂ *通信作者:杨贞耐,男,教授,博士,主要从事乳品科学及加工技术方面的研究㊂ 微生物胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是微生物在生长代谢过程中分泌到细胞外的高分子化合物,具有易提取㊁生产不受季节影响㊁生产周期短等优势[1]㊂但其产量受多种因素的影响,不仅与自身的遗传性质有关,还容易受到菌体生长环境的影响,培养基的组成以及培养条件都会对多糖的产量产生影响[2]㊂因此,选择合适的培养条件至关重要㊂微生物EPS具有多种生物学活性㊂Sasikumar等[3]研究发现,Lactobacillus plantarum BR2产生的EPS具有DPPH自由基清除能力,对α⁃葡萄糖苷酶具有抑制作用㊂许女等[4]对干酪乳杆菌KW3EPS进行抗氧化研究,体外研究结果显示,EPS具有DPPH自由基清除能力;体内实验结果显示,KW3胞外多糖可显著降低衰老小鼠血清㊁肝和脑组织中的MDA含量,提高其SOD活性和GSH-Px活性㊂甲基营养型芽孢杆菌广泛存在于自然界,具有重要的商业价值,目前对其代谢物的研究主要集中在蛋白酶㊁氨肽酶的培养条件优化㊁抗菌肽对罗非鱼片的保鲜效果等方面[5-7],但对EPS的研究报道较少㊂本研究针对一株从传统酒曲中分离筛选得到的高产EPS的菌株GSBm-1,16S rDNA进行菌株鉴定,响应面法优化培养条件,旨在提高其EPS的产量,探究EPS生物活性,包括体外抗氧化和降血糖活84性,为EPS在功能性食品中的应用提供理论支持㊂1 材料与方法1.1 材料与试剂菌株GSBm-1由实验室从传统酒曲中分离纯化并保藏㊂胰蛋白胨㊁酵母浸粉㊁氯化钠㊁蔗糖㊁果糖㊁麦芽糖㊁葡萄糖㊁乳糖㊁蛋白胨㊁牛肉膏㊁硫酸铵㊁柠檬酸铵㊁尿素㊁大豆蛋白胨㊁三氯乙酸(TCA)㊁无水乙醇㊁苯酚㊁浓硫酸,分析纯,国药集团化学试剂有限公司㊂菌株GSBm-1基础培养基组成:酵母浸粉5.0g㊁胰蛋白胨10.0g㊁氯化钠10.0g,去离子水1L㊂调节pH值为7.2,121℃高温灭菌15min㊂1.2 仪器与设备低温冰箱(-80℃),美国Thermo公司;MLS-3750型高压灭菌锅,日本Sanyo公司;CR21GⅢ型高速冷冻离心机㊁HZQ-Q型气浴恒温摇床,日本Hita⁃chi公司;Elx800型酶标仪,美国博腾仪器有限公司; S20型数显pH计,上海Mettler Toledo仪器有限公司;透析袋(8000~14000D),北京生物技术有限责任公司㊂1.3 实验方法1.3.1 基于16S rDNA的菌种分子生物学鉴定样品由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司进行测序,测序结果与Gen Bank中已知菌株的相应序列进行比对,构建系统发育进化树㊂1.3.2 菌株活化将菌株接种到基础培养基中,接种量为3%,37℃㊁140r/min培养18h,连续活化两代后备用㊂1.3.3 胞外多糖的提取参照Wang等[8]的方法,略作改动㊂将活化后的菌株接种在基础培养基中,接种量为3%,140 r/min㊁37℃培养24h,加入TCA使其最终质量分数为4%,140r/min震荡2h除去杂蛋白,而后9810 r/min㊁4℃离心45min,收集上清液㊂将2倍体积的无水乙醇加入到上清液中,并4℃静置24h㊂沉淀后的溶液在9810r/min㊁4℃的条件下离心30min 后,除去上清液,用蒸馏水溶解沉淀,4℃条件下透析48h,每8h换一次水㊂1.3.4 胞外多糖的测定采用苯酚-浓硫酸法测定菌株胞外多糖的产量:从透析袋中取100μL样品用蒸馏水稀释至1mL,加入500μL质量分数为6%苯酚及2.5mL浓硫酸,摇匀,避光静置30min㊂取200μL混合静置后的溶液于96孔板中,在490nm条件下测吸光度㊂将葡萄糖溶液作为标准品,490nm条件下测吸光度,得到回归方程,y=0.0063x+0.0019,R2=0.9997㊂1.3.5 单因素实验设计首先对影响多糖产量的因素进行单因素实验,分别选取碳源(蔗糖㊁果糖㊁麦芽糖㊁葡萄糖㊁乳糖)㊁氮源(尿素㊁蛋白胨㊁大豆蛋白胨㊁硫酸铵㊁柠檬酸铵㊁牛肉膏)㊁pH值(5㊁6㊁7㊁8㊁9)㊁温度(27㊁32㊁37㊁42㊁47℃)㊁转速(100㊁120㊁140㊁160㊁180r/min)㊁时间(12㊁24㊁36㊁48㊁60h)㊁接种量(1%㊁2%㊁3%㊁4%㊁5%)为单因素,按照1.3.3的方法提取多糖,1.3.4的方法测定菌株胞外多糖的产量㊂1.3.6 Plackett-Burman试验设计依据前期单因素实验的因素水平,用MINITAB 15.0选取N=12的Plackett-Burman设计试验,对影响胞外多糖产量的7个因素进行考察,每个因素取2个水平,因素与水平见表1㊂表1 Plackett-Burman试验因素与水平Tab.1 Factors and levels of Plackett-Burman design变量因素低水平高水平X1转速/(r㊃min-1)120160X2温度/℃3242X3ρ(大豆蛋白胨)/(g㊃L-1)4020X4ρ(蔗糖)/(g㊃L-1)3010X5时间/h3660X6接种量/%35X7pH值68 1.3.7 响应面试验设计用Design⁃Expert8.0.6设计响应面试验,以胞外多糖产量作为响应值,对3个因素进行考察,以单因素实验中胞外多糖产量最高的条件为0水平,设计因素水平见表2㊂表2 响应面试验因素水平Tab.2 Factors and levels of response surface method因素水平-101Aρ(大豆蛋白胨)/(g㊃L-1)203040Bρ(蔗糖)/(g㊃L-1)102030C培养基初始pH值67894第38卷第2期 蔡 淼等:甲基营养型芽孢杆菌产胞外多糖发酵条件及生物活性研究1.3.8 体外抗氧化活性测定取EPS 样品,配制成0㊁2㊁4㊁6㊁8㊁10㊁15㊁20㊁25mg /mL 的样品溶液,分别测定抗氧化指标㊂DPPH 自由基清除能力测定:参照Xu 等[9]的方法,略作改动㊂取1mL 多糖样品与2mL 0.2mmol /L 的DPPH 甲醇溶液混合,室温避光反应1h,离心,于517nm 处测定吸光度㊂DPPH 自由基清除率计算见式(1)㊂DPPH 清除率=[1-(A 1-A )/A 0]×100%㊂(1)式(1)中,A ,以等体积甲醇代替DPPH 溶液的空白组吸光度;A 0,以等体积无菌水代替样品的对照组吸光度;A 1,样品组吸光度㊂ABTS +自由基清除能力测定:采用ABTS +测定试剂盒㊂图1 菌株GSBm-116S rDNA 系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of bacterial strain GSBm-1based on 16S rDNA sequence亚铁螯合能力的测定:参照Tang 等[10]的方法,略作改动㊂多糖样品1mL,2mol /L 氯化亚铁溶液0.05mL,5mol /L 菲啰嗪0.2mL,2.75mL 蒸馏水,室温下放置10min,于562nm 处测定其吸光度㊂亚铁螯合能力计算见式(2)㊂Fe2+螯合能力=[A 0-(A 1-A 2)]/A 0×100%㊂(2)式(2)中,A 0,对照组的吸光度(蒸馏水代替样品);A 1,样品组吸光度;A 2,空白组吸光度(蒸馏水代替氯化亚铁)㊂1.3.9 降血糖活性测定参照Wang 等[11]的方法,略作改动㊂5μL α⁃葡萄糖苷酶,20μL EPS 溶液与165μL PBS(0.1mmol /L,pH 值6.8)混合,37℃放置10min,加入10μL 含0.95mmol /L PNP -Glu 的0.1mol /L 的PBS 溶液(pH 值6.9),37℃放置10min,加入100μL 的1mol /L Na 2CO 3㊂测定405nm 处的吸光度㊂α⁃葡萄糖苷酶抑制率计算见式(3)㊂α⁃葡萄糖苷酶抑制率=[1-(A 3-A 4)/(A 1-A 2)]×100%㊂(3)式(3)中,A 1,PBS㊁酶㊁底物㊁Na 2CO 3溶液的吸光度;A 2,PBS 和Na 2CO 3溶液的吸光度;A 3,PBS㊁酶㊁样品㊁底物㊁Na 2CO 3溶液的吸光度;A 4,PBS㊁酶㊁样品㊁Na 2CO 3溶液的吸光度㊂1.4 数据处理每组样品重复实验3次,实验数据采用Sigma⁃plot 10.0绘图,结果均用 平均值±方差”表示㊂2 结果与分析2.1 基于16S rDNA 的序列相似性比对及系统进化树分析将菌株的16S rDNA 基因序列与在Gen Bank 中序列大小相近的已知菌株的序列进行比对后,选取与菌株序列相似性较高的菌株序列,构建系统进化树,结果如图1㊂由图1可知,菌株与Bacillus meth⁃ylotrophicus 261AY3在同一分支上,且置信度支持率高,可将菌株鉴定为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus )㊂目前对甲基营养型芽孢杆菌EPS 的研究较少,本实验主要针对甲基营养型芽孢杆菌产EPS 的发酵条件及其生物活性进行研究㊂2.2 单因素实验结果分析2.2.1 碳源的影响碳源对微生物生长繁殖有至关重要的作用,对胞外多糖产量也有重要影响㊂对于不同的菌株,最适合其生长的碳源种类及质量浓度不一定相同,因此,选择合适的碳源及添加量是十分必要的㊂已有研究发现,在蔗糖质量浓度为25.449g /L 时,枯草芽孢杆菌胞外多糖产量达到最大值[12]㊂本实验选取5种不同的碳源进行研究,结果如图2(a)㊂甲基营养型芽孢杆菌能利用多种碳源合成EPS,其中当05食品科学技术学报 2020年3月图2 碳源对EPS 产量的影响Fig.2 Effect of carbon sources on yield of EPS蔗糖作为碳源时,甲基营养型芽孢杆菌EPS 的产量最大㊂研究进一步测定了添加不同质量浓度的蔗糖时胞外多糖的产量,结果如图2(b)㊂当蔗糖质量浓度低于20g /L 时,随蔗糖添加量升高,胞外多糖产量升高,胞外多糖产量最大值为434.9mg /L;但超过20g /L 时,胞外多糖产量呈现出下降的趋势㊂赵雯等[13]对解淀粉芽孢杆菌GSBa -1产EPS的培养条图3 氮源对EPS 产量的影响Fig.3 Effect of nitrogen sources on yield of EPS件优化的研究中发现,当蔗糖的质量浓度为40g /L 时,EPS 产量有明显的提升,当超过40g /L 时出现下降的趋势㊂可能由于蔗糖含量相对过高时会对菌体产生渗透压胁迫,抑制菌体的生长及EPS 的合成㊂2.2.2 氮源的影响氮源主要影响菌体细胞的生长,与其次级代谢产物的合成有关㊂本实验选取6种不同的氮源进行探究,实验结果如图3(a)㊂当加入的氮源为大豆蛋白胨时,胞外多糖的产量明显升高,为434.5mg /L㊂因此,选取大豆蛋白胨进行后续实验㊂不同大豆蛋白胨质量浓度下胞外多糖的产量如图3(b)㊂添加不同质量分数的大豆蛋白胨时,菌株产生胞外多糖的能力不相同㊂随添加量的增加,胞外多糖产量呈现出先升高后降低的趋势㊂当添加量达到30g /L 时,菌株胞外多糖产量达到最大值㊂根据姜云芸等[14]的研究,植物乳杆菌K25也是以大豆蛋白胨为最佳氮源,当其质量浓度为8g /L 时,EPS 的产量有显著提升㊂在添加量过低时,大豆蛋白胨不足以为菌体的生长提供氮元素,导致产糖量偏低;当添加量过大时,可能由于大豆蛋白胨对菌体的渗透压胁迫作用导致产糖量偏低㊂2.2.3 培养基初始pH 值的影响本研究选择培养基初始pH 值为5~9进行实验,结果如图4㊂随着pH 值的升高,胞外多糖的产量先呈现出升高的趋势,当初始pH 值为7时,产糖量达到最大值;当pH 值大于7时,EPS 产量逐渐下降㊂不同菌体所要求的生长环境pH 值不同,研究发现,酒酒球菌(Oenococcus oeni )在pH 值为4.3时EPS 产量达到最大值[15]㊂因此,酸性过大或者碱性过大都可能导致菌株生长缓慢,进而影响次级代谢15第38卷第2期 蔡 淼等:甲基营养型芽孢杆菌产胞外多糖发酵条件及生物活性研究物的产量;这可能是由于pH 值能够影响菌体对营养物质的吸收及酶的活性㊂图4 培养基初始pH 值对EPS 产量的影响Fig.4 Effect of initial pH of growth medium on yield of EPS2.2.4 发酵温度的影响每株菌都有适宜自身生长的最适温度,生产不同代谢产物的菌株的最适温度不相同㊂实验测定了在不同温度下胞外多糖的产量,结果如图5㊂随着发酵温度的升高,胞外多糖产量呈先升高后降低的趋势,在37℃条件下达到最大值,在此条件下,产糖量为313.7mg /L㊂张爱梅等[16]的研究发现,菌株TT207的EPS 产量随温度变化也呈现出先升高后下降的趋势,当培养温度达到34℃时,EPS 产量最高,说明温度过高或过低都不利于EPS 的产生㊂温度过低,可能不利于微生物的生长代谢及次级代谢产物的合成;温度过高可能导致微生物体内合成胞外多糖的酶活性降低甚至失去活性㊂因此应选择适当的发酵温度,合适的温度可以使菌株的生长速度加快,进而提高胞外多糖的产量㊂图5 发酵温度对EPS 产量的影响Fig.5 Effect of fermentation temperatures on yield of EPS2.2.5 转速的影响转速对胞外多糖产量的影响见图6㊂由图6可知,当转速低于140r /min 时,产糖量随转速的升高而增多;但超过140r /min 时,产糖量呈现出下降的趋势㊂可能是由于当转速过低时,菌液的透气性不好,导致菌体生长缓慢;转速过高时,虽然菌液透气性较好,但可能会由于震荡过于剧烈而对菌体造成机械损伤,生物量偏低,也导致产糖量偏低㊂图6 转速对EPS 产量的影响Fig.6 Effect of shaking speed on yield of EPS2.2.6 接种量的影响接种量会对生物量造成直接影响,从而间接影响次级代谢产物的产量(见图7)㊂由图7可知,当接种量为4%时,产糖量达到最大值,为355.9mg /L㊂接种量过低时,生物量也偏低;随着接种量增加,产糖量并非持续增加㊂接种量过高时,培养基中的养分可能不足以为菌体提供足够的营养,EPS 合成能力不足,还可能由于氧气供应量较低导致菌体生长缓慢㊁次级代谢产物产量偏低㊂图7 接种量对EPS 产量的影响Fig.7 Effect of inoculum on yield of EPS2.2.7 发酵时间的影响随着发酵时间的延长,胞外多糖产量呈现出先升高后降低的趋势,在发酵48h 时达到最大值,见图8㊂发酵时间过短,只能保证菌体自身生长,而胞外多糖可能尚未有效产出㊂曹永强等[2]和Zhang 等[17]研究发现,当培养时间过长时,植物乳杆菌YW11和植物乳杆菌C88的EPS 产量都出现了下降25食品科学技术学报 2020年3月图8 发酵时间对EPS产量的影响Fig.8 Effect of fermentation time on yield of EPS 的趋势,可能由于菌体自身产生了降解EPS的酶,使EPS产量下降[18]㊂因此,选择合适的培养时间至关重要㊂2.3 主因素选取结果分析实验以多糖产量为响应值Y,实验结果和方差分析见表3㊁表4㊂从表4方差分析中可以看出此实验模型的P 值为0.004小于0.05,且R2=0.9760,R2(调整)= 0.9339,表明此模型显著,拟合性好㊂由T值可得知转速㊁培养温度㊁氮源㊁碳源㊁接种量对胞外多糖产量的影响是正向的,培养时间㊁培养基初始pH值对 表3 Plackett-Burman试验设计与响应值变化Tab.3 Design scheme and results of Plackett-Burman design实验号X1X2X3X4X5X6X7EPS产量/(mg㊃L-1) 11604240106056394.7±0.8 21203240306038388.3±2.1 31204240106036366.2±3.2 41604220306038335.2±1.8 51603240103638341.2±2.5 61204220103658313.7±0.9 71203220103636285.6±1.4 81204240303658415.2±1.0 91604220303636381.8±1.5 101603240303656449.5±3.6 111203220306056341.2±1.9 121603220106058295.1±2.8表4 Plackett-Burman试验方差分析Tab.4 Analysis of variance on Plackett-Burman design因素水平-11T P转速/(r㊃min-1)1201601.990.118温度/℃32422.410.074ρ(大豆蛋白胨)/(g㊃L-1)40209.160.001**ρ(蔗糖)/(g㊃L-1)30105.160.022*时间/h3660-1.510.206接种量/%352.530.065 pH68-2.970.041* R20.9760R2(调整)0.9339模型P=0.004** *表示显著水平(P<0.05),**表示极显著水平(P<0.01)㊂胞外多糖产量的影响是负向的㊂由表4可知,大豆蛋白胨对EPS产量影响非常显著(P<0.01),蔗糖㊁培养基初始pH值对EPS产量影响显著(P<0.05)㊂由此得知,大豆蛋白胨添加量㊁蔗糖添加量㊁培养基初始pH值对EPS影响最大,以上述3个因素为研究对象进行后续优化实验㊂2.4 响应面试验结果分析2.4.1 响应面结果分析响应面试验的结果如表5,以胞外多糖产量作为响应值,得到Y对自变量A㊁B㊁C的二次多项拟合方程:Y=496.40+37.69A+5.88B-10.26C+36.65AB-92.13AC-27.25BC-56.84A2-52.56B2-80.24C2㊂模型方差分析见表6,模型F值为135.95,P< 0.0001,影响极显著;失拟项F值为5.94,P值为35第38卷第2期 蔡 淼等:甲基营养型芽孢杆菌产胞外多糖发酵条件及生物活性研究表5 响应面试验设计及响应值结果Tab.5 Design scheme and results of responsesurface method序号A B C EPS 产量/(mg ㊃L -1)110-1492.3±1.22110475.5±2.03-101248.8±1.54000505.4±0.85000493.8±1.76-110310.7±2.6701-1405.8±2.18-1-10371.8±1.89-101410.6±3.210000495.9±0.511000496.0±1.612000490.9±2.3130-11375.9±0.914011332.7±2.1150-1-1340.0±1.616101285.6±1.1171-10390.0±3.3图9 大豆蛋白胨和蔗糖含量对EPS 产量的影响Fig.9 Effects of soy peptone concentrations and sucrose concentrations on EPS yield0.0590>0.05,失拟项不显著㊂且函数的相关系数为R 2=0.9843,R 2(调整)=0.9770,说明该模型能够充分反应胞外多糖产量的情况㊂通过比较各因素的F 值,各个因素对胞外多糖产量影响的大小顺序依次是大豆蛋白胨添加量㊁培养基初始pH 值㊁蔗糖添加量㊂单独分析各因素可知,大豆蛋白胨添加量影响极显著,培养基初始pH 值影响显著,所有二次项以及交互项的影响极显著㊂由此可知,各因素对胞外多糖产量的影响不是线性关系㊂表6 回归模型的方差分析Tab.6 Analysis of variance on regression model来源平方和自由度均方F 值P 值模型1.13×105912551.10135.95<0.0001**A 11362.78111362.78123.080.0001**B 276.131276.132.990.1274C 842.551842.559.130.0194*AB 5372.8915372.8958.200.0001**AC 33948.06133948.06367.71<0.0001**BC 2970.2512970.2532.170.0008**A 213602.11113602.11147.33<0.0001**B 211632.91111632.91126.00<0.0001**C 227107.61127107.61293.61<0.0001**残差646.27792.32失拟项527.853175.955.940.0590纯误差118.42429.60总和1.136×10516*表示显著水平(P <0.05),**表示极显著水平(P <0.01)㊂2.4.2 响应面交互作用分析各个因素之间的相互作用如图9至图11,其含义为当其中一个因素取0水平时,另两个因素之间的相互作用,等高线图可表示交互作用的强弱,其中圆形表示相互作用较弱,椭圆形则表示交互作用显著㊂大豆蛋白胨含量与蔗糖含量交互作用的等高线图呈椭圆形,说明二者交互作用比较显著(如图9)㊂45食品科学技术学报 2020年3月图10 大豆蛋白胨含量和初始pH 值对EPS 产量的影响Fig.10 Effects of soy peptone concentrations and initial pH on EPSyield图11 蔗糖含量和初始pH 值对EPS 产量的影响Fig.11 Effects of sucrose concentrations and initial pH on EPS yield当固定pH 值为7时,相同蔗糖质量浓度下,大豆蛋白胨质量浓度对胞外多糖产量有较大影响,随大豆蛋白胨质量浓度的增大而呈现升高的趋势㊂大豆蛋白胨含量与培养基初始pH 值交互作用的等高线图呈椭圆形,说明二者交互作用比较显著(如图10)㊂固定蔗糖添加量为20g /L 时,相同大豆蛋白胨质量浓度下,随pH 值的升高,胞外多糖产量呈现先升高后降低的趋势㊂蔗糖含量与培养基初始pH 值交互作用的等高线图呈椭圆形,说明二者交互作用比较显著(如图11)㊂固定大豆蛋白胨的添加量为30g /L 时,蔗糖含量的等高线更为紧密,培养基初始pH 值等高线更为稀松,这说明培养基初始pH 值对胞外多糖产量的影响更大㊂由Design⁃Expert 软件分析可得出,优化发酵条件为酵母提取物5.0g /L㊁胰蛋白胨10.0g /L㊁氯化钠10.0g /L㊁蔗糖26.0g /L㊁大豆蛋白胨40.0g /L㊁pH 值6.26㊁接种量4%㊁温度37℃㊁时间48h㊁转速140r /min,预测胞外多糖产量为522.8mg /L㊂利用软件给出的培养条件进行验证实验,设置3个平行实验组,对测量结果取平均值㊂经验证在此条件下,胞外多糖产量为(520.1±1.2)mg /L,与预测结果基本一致㊂2.5 EPS 抗氧化活性分析DPPH 自由基是一个稳定的自由基,若能将其清除,则表明样品具有较强的自由基清除能力,因而DPPH 自由基清除能力常作为评价某物质抗氧化性的有效指标[19]㊂图12是不同质量分数EPS 的抗氧化活性㊂如图12(a),甲基营养型芽孢杆菌EPS 对DPPH 自由基有一定清除能力,且清除能力与EPS 质量浓度有关㊂董乐等[20]研究发现,当EPS 质量浓度为10mg /mL 时,EPS 对DPPH 自由基的清除率为55第38卷第2期 蔡 淼等:甲基营养型芽孢杆菌产胞外多糖发酵条件及生物活性研究19.32%㊂本实验研究中,当EPS 为10mg /mL 时,DPPH 自由基清除率已经达到40.04%㊂随着EPS 质量浓度的升高,DPPH 自由基清除能力继续升高;在EPS 质量浓度为25mg /mL 时,DPPH 自由基清除能力达到70.67%㊂这可能是由于EPS 存在一些官能团使自由基转化成了更稳定的形式,或与自由基反应终止了其链式反应[21]㊂不同来源的EPS 在DPPH 自由基清除能力上存在差异,可能与EPS 的单糖组成㊁羟基和羧基的含量以及供氢能力有关㊂图12 不同质量浓度胞外多糖的抗氧化活性Fig.12 Antioxidant activity of EPS with different concentrations ABTS +自由基是一种稳定的有机自由基,在抗氧化剂存在的情况下,ABTS +自由基将会减少[22]㊂如图12(b),当EPS 质量浓度为10mg /mL 时,对ABTS +自由基的清除能力超过了50%㊂随着EPS 质量浓度继续升高,ABTS +自由基清除能力也随之增强,EPS 质量浓度为25mg /mL 时,ABTS +自由基清除能力达到71.69%㊂铁是各种金属离子中最强的促氧化剂,催化脂质㊁蛋白质和其他细胞成分的氧化反应[23]㊂金属螯合剂可以将这些过渡金属转化为稳定的化合物,通过螯合作用抑制氧化反应㊂如图12(c),EPS 在质量浓度为2mg /mL 时,没有螯合作用,但随着EPS 含量的提高,逐渐体现其螯合作用;当EPS 质量浓度为25mg /mL 时,螯合作用最大为55.25%㊂据报道,具有⁃OH,⁃SH,⁃COOH,⁃PO 3H 2,⁃CO,⁃NR 2,⁃S⁃和⁃O⁃官能团中两个或更多个结构的化合物可以显示金属螯合活性[24]㊂因此甲基营养型芽孢杆菌产生的EPS 可能含有一部分以上官能团㊂2.6 EPS 降血糖活性分析食物中的淀粉㊁双糖等较大的分子不能直接被人体吸收,需通过协同作用生成单糖后才能被人体吸收,因此可以通过阻止α⁃葡萄糖苷酶的酶促反应来实现降低血糖的效果[25]㊂甲基营养型芽孢杆菌产生的EPS 对α⁃葡萄糖苷酶有一定抑制作用,且抑制率与EPS 质量浓度有关(如图13)㊂当EPS 质量浓度为10mg /mL 时,抑制率为33.79%;当EPS 质量浓度继续升高时,对α⁃葡萄糖苷酶的抑制率也呈现出上升的趋势㊂已有研究发现,来源于Probio 65的EPS 也对α⁃葡萄糖苷酶有抑制作用,且当EPS 质量浓度为10mg /mL 时,抑制率为7.05%[26],低于本实验中的研究结果㊂不同来源的EPS 对α⁃葡萄糖苷酶的抑制效果存在差异,可能是由于EPS 结构的不同㊂图13 不同质量浓度EPS 对α⁃葡萄糖苷酶活性的抑制率Fig.13 Different concentrations of EPS on inhibitionof α⁃glucosidase activity3 结 论一株从传统酒曲中分离的产EPS 的菌株,经16S rDNA 鉴定为甲基营养型芽孢杆菌GSBm -1㊂本实验通过单因素实验及响应面试验对其发酵条件进行了优化,优化发酵条件为氯化钠10.0g /L㊁酵母提取物5.0g /L㊁胰蛋白胨10.0g /L㊁蔗糖26.0g /L㊁65食品科学技术学报 2020年3月大豆蛋白胨40.0g/L㊁pH值6.26㊁温度37℃㊁时间48h㊁转速140r/min㊁接种量4%,在此条件下胞外多糖的产量达到最大值,为(520.1±1.2)mg/L㊂与优化前相比,EPS产量提高了33.8%㊂将提取得到的EPS进行体外抗氧化能力及降血糖活性的测定,结果表明,EPS具有DPPH㊁ABTS+自由基清除能力㊁Fe2+螯合能力,表现出一定的抗氧化性;且对α⁃葡萄糖苷酶有抑制作用,对降血糖有一定效果㊂因此,甲基营养型芽孢杆菌GSBm-1具有高产EPS 的能力,其EPS具有多种生物学功能,在功能食品研发领域具有潜在的应用价值㊂参考文献:[1] 朱桂兰,童群义.微生物多糖的研究进展[J].食品工业科技,2012,33(6):444-448.ZHU G L,TONG Q Y.Research progress on microbialpolysaccharide[J].Science and Technology of FoodIndustry,2012,33(6):444-448.[2] 曹永强,王辑,赵笑,等.植物乳杆菌YW11生产胞外多糖的发酵条件研究[J].食品科学技术学报,2016,34(1):42-49.CAO Y Q,WANG J,ZHAO X,et al.Optimization offermentation conditions of Lactobacillus plantarum YW11for exopolysaccharides production[J].Journal of FoodScience and Technology,2016,34(1):42-49. 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细菌胞外多糖的生物合成与基因控制_王正荣
如下 : Sucrose※ alternan +fructose[ 20]
的 , 其合成反应如下 :
2010年第 11期
王正荣等 :细菌胞外多糖的生物合成与基因控制
51
Sucrose※ levan+ D-glucose 另外一种多聚糖是 alternan, 由 Leuconostocmesenteroides菌株合成 , alternan类似于葡聚糖 , 其合成 过程中酶作为一种合成酶 , 其主要催化过程和反应
Keywords: Bacterial Exopolysaccharides Biosynthesis Geneclusters
近年来随 着对天然多聚物工业需求的与日俱
增 , 人们对微生物胞外多糖的兴趣逐渐增强 , 细菌多 糖作为一种新的 、工业化的重要多聚物与植物所产 生的天然树胶有同样经济利用价值 。 胞外多糖是指 细菌在生长发育过程中合成并分泌到细胞外的一类
·综 述与 专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
201 0年第 11 期
细菌胞外多糖的生物合成与基因控制
王正荣 生吉萍 申琳
(中国农业大学食品科学与营养工程学院 , 北京 100083)
摘 要 : 细菌胞外多糖是指细菌在生长发育过程中合成并分泌到 细胞外的长 链 , 高 分子糖类聚 合物 。 细菌胞 外多糖的 生物合成途径涉及装配 、多聚化及运输三个过程 , 是多种酶和转运系统的结果 , 其发生 的部位包括 胞内和胞 外 , 有些 合成过程 会发生在细胞壁上 , 对于胞外多糖合成相关基因的报道 , 发 现控制 胞外多糖 合成是 一大类 基因簇 , 不 同的菌株 其基因 簇的数 量和种类各不相同 。 这些研究 的不断更新为将来胞外多糖的应用提供了更加广阔的前景 。
乳酸菌胞外多糖制备与结构鉴定及应用研究
乳酸菌胞外多糖制备与结构鉴定及应用探究乳酸菌胞外多糖制备是指通过发酵乳酸菌，利用其代谢产物中的多糖类物质进行提取和分离纯化的过程。
多糖类物质是乳酸菌胞外分泌的主要产物之一，具有多种生物活性，包括抗肿瘤、抗氧化、抗炎、调整免疫功能等。
因此，提取纯化乳酸菌胞外多糖具有重要意义。
乳酸菌胞外多糖的结构鉴定是探究的重要内容之一。
目前，常用的结构鉴定方法主要包括红外光谱（IR）、核磁共振（NMR）和色谱质谱联用（LC-MS）等。
通过这些方法，可以确定乳酸菌胞外多糖的糖基组成、毗连方式、分子量等结构特征。
乳酸菌胞外多糖在食品工业中具有广泛应用前景。
起首，多糖在食品加工过程中可作为胶粘剂、稳定剂和乳化剂，提高食品的质地和口感。
其次，多糖还具有调整肠道菌群、增强免疫力、降低胆固醇等功能，被广泛应用于功能食品和保健品中。
此外，乳酸菌胞外多糖还具有抗氧化、抗菌和抗肿瘤等生物活性，广泛应用于医疗健康领域。
然而，乳酸菌胞外多糖的制备和应用探究仍存在一些挑战。
起首，目前多糖的提取纯化方法尚不够高效和经济。
其次，乳酸菌胞外多糖的结构多样性较大，导致结构鉴定工作相对复杂。
在应用方面，乳酸菌胞外多糖的功能机制仍需进一步探究明确，并解决多糖的稳定性和生物利用率等问题。
综上所述，乳酸菌胞外多糖制备与结构鉴定及应用的探究具有重要意义。
通过深度探究乳酸菌胞外多糖的制备工艺、结构特征和功能机制，将有助于进一步开发和应用乳酸菌胞外多糖在食品工业、医疗健康等领域。
信任随着科学技术的不息进步，乳酸菌胞外多糖必将在将来发挥更加重要和广泛的作用综合探究表明，乳酸菌胞外多糖在食品工业和医疗健康领域具有宽广的应用前景。
通过各种分析方法可以确定其结构特征，这对于制备工艺和应用探究至关重要。
然而，在提取纯化方法、结构鉴定和功能机制等方面仍存在一些挑战，需要进一步探究和解决。
信任随着科学技术的进步，乳酸菌胞外多糖将在将来发挥更加重要和广泛的作用。
干酪乳杆菌胞外多糖的单糖组成分析
干酪乳杆菌胞外多糖的单糖组成分析作者：王宗莹来源：《食品界》2017年第10期立题背景干酪乳杆菌作为益生菌的一种，能够耐受有机体的防御机制，其中包括胃液中低pH值、口腔中的酶和小肠的胆汁酸等。
所以干酪乳杆菌进入人体后可以在肠道内大量存活，起到促进人体消化吸收、调节肠内菌群平衡等作用。
目前已知乳酸菌发挥主要生理功能特性的机理，除了主要代谢产物（如乳酸等）改善肠道内环境外，乳酸菌的次生代谢产物如细菌素、SOD、胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）等也具有重要的作用。
乳酸菌胞外多糖（LAB EPS）即是这类细菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的粘液或夹膜多糖。
自20世纪40年代成功开发出由肠明串珠菌发酵产生右旋糖酐以来，新的微生物胞外多糖的研究与开发在世界范围内已成为研究的热点。
而乳酸菌胞外多糖因具有理论和实际应用价值已经引起了许多学者的兴趣。
许多乳酸菌是历史悠久的工业生产菌，乳酸菌EPS不仅对乳制品的质构和风味具有重要影响，而且有可能成为食品级多糖的一个极好的来源而广泛应用于各种食品的增稠、乳化、稳定、胶凝及保湿。
干酪乳杆菌干酪乳杆菌的生长特性。
干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）属于乳杆菌属（Lactobacillus），是革兰氏阳性菌，不产芽孢，不运动，无鞭毛，兼性异型发酵乳糖，不液化明胶；最适生长温度为37℃；菌体两端呈方形，长短不一，常成链；菌落粗糙，灰白色，有时呈微黄色，能发酵多种糖。
干酪乳杆菌存在于人的肠道、口腔内含物和大便及阴道中，也常常出现在牛奶和饲料、乳制品、面团、干酪和垃圾中。
干酪乳杆菌的生理功能。
（1）抗菌作用。
研究表明，干酪乳杆菌不仅对很多细菌有拮抗作用，有的菌株还可以抑制酵母及霉菌的生长。
Nemcova等报道L.paracasei可显著降低刚断奶幼猪体内梭菌属和肠杆菌的数量；雷虹等值乳酸菌发酵泡菜液中分离得到的干酪乳杆菌HD1-7对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、沙门氏菌等很多致病菌均有抑制作用。
不同海洋生境来源微生物胞外多糖的结构及抗氧化活性研究
不同海洋生境来源微生物胞外多糖的结构及抗氧化活性研究海洋微生物所处的独特生存环境,使其具有产生新颖化学结构和独特生物学活性胞外多糖的潜质,是开发海洋多糖类药物的新资源。
微生物胞外多糖作为天然活性生物大分子,在生物医药、日用化工等领域日益受到人们的广泛关注。
本论文以十六种海洋来源的微生物发酵液为研究对象,提取胞外多糖并对其得率、理化性质和单糖组成进行分析,从中筛选得到五株海洋微生物,分别为珊瑚共生真菌Penicillium commune518#;厚藤共生真菌Fusarium oxysporum Y24-2;苔藓共生真菌Penicillium purpurogenum ZZ05-4;红树林根泥真菌,Trichoderma.sp ghq-198和胶州湾海泥真菌Penicillium.sp ghq-18,对从中提取得到的胞外多糖进行进一步的分离纯化、结构解析和抗氧化活性评价。
研究结果如下：1.十六种微生物胞外多糖的提取得率在0.43-3.56g/L之间；总糖含量在55.45%～92.30%之间；蛋白含量在0.82%～13.65%之间；所有胞外多糖中均没有检测到硫酸根的存在。
在得到的十六种胞外多糖中,七种胞外多糖的单糖组成以甘露糖和葡萄糖为主,两种以甘露糖和半乳糖为主,三种以相似比例的甘露糖、葡萄糖和半乳糖为主,另外编号为AH17-3和GW3-13的两种微生物产胞外多糖还含有较高比例的葡萄糖醛酸和葡萄糖胺。
分析表明,不同来源的微生物产胞外多糖在得率单糖组成和理化性质上均有较大差异。
2.从海南直针尖柳珊瑚Muricella abnormalis共生真菌Penicillium commune518#发酵液中提取胞外多糖,经过Q Sepharose Fast Flow阴离子柱层析和Superdex75prep凝胶渗透色谱分离纯化得到三个组分F1P-1S, F1P-2S和F1P-3S,其中主要组分F1P-2S的总糖含量约为96.4%,蛋白含量约为1.23%,分子量为18.6kDa,单糖组成主要由Man、Glc和Gal以27.9%、14.7%和57.4%的比例构成。
三株海洋微生物胞外多糖的分离纯化及结构研究
三株海洋微生物胞外多糖的分离纯化及结构研究海洋中生活着物种丰富的微生物。
海洋环境下生活的微生物与陆地微生物所产的胞外多糖在很多方面有很大差别。
海洋微生物所产胞外多糖具有结构新颖及生物活性多样等特点。
因此,在医药和食品等行业得到了广泛应用,具有很大的商业开发价值。
本文以一株红树林来源真菌和两株深海来源放线菌所产水溶性胞外多糖作为研究对象,利用色谱分离技术分离纯化多糖,采用化学方法和现代波谱分析技术研究多糖的结构。
研究结果如下：1.从海南文昌地区红树林根泥真菌Aspergillus sp.oucmdz-1914发酵液中提取得到多糖粗品ouc,依次用Q-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephacryl S-100凝胶过滤层析法分离和纯化得到ouc-1、ouc-2、ouc-3和ouc-4四种多糖组分。
化学分析表明,四种多糖组分的总糖含量均在90%以上,蛋白含量均较低,除ouc-1外其他三种多糖组分中均含有少量氨基糖。
PMP柱前衍生高效液相色谱和高效凝胶渗透色谱分析表明,ouc-1、ouc-2、ouc-3和ouc-4单糖组成均以Man 为主,还含有少量的Glc和Gal,ouc-2、ouc-3口ouc-4含有少量的GlcN:四种多糖的分子量分别为2.9 kDa.4.26 kDa.3.7 kDa和4.1 kDa。
多糖ouc-2、ouc-3和ouc-4经甲基化衍生后进行GC-MS分析以判断糖苷键连接方式,结果表明,ouc-2. ouc-3和ouc-4单糖连接方式主要为Manp(1→、→2)Manp(1→、→3)Manp(1→、→6)Man9(1→和→2,6)Manp(1→,ouc→3中还含有Galf(1→和→4)Glcp(1→,ouc→4含有少量的→4)Glcp(1→。
2.从南海深海海泥放线菌oucmdz-2984和南大西洋中脊深海泥样放线菌oucmdz-3763的发酵液中分别提取得到两种多糖粗品MDZ和SH,用Q-Sepharose Fast Flow离子交换柱和Sephacryl S-100凝胶过滤层析柱分离和纯化两种多糖粗品,从MDZ中分离得到两种多糖mdz-1和mdz-2。
乳酸菌胞外多糖化学组成的研究的开题报告
乳酸菌胞外多糖化学组成的研究的开题报告一、选题背景乳酸菌是一种重要的微生物菌群，广泛存在于自然环境中，包括人体、动物肠道、食品、土壤等。
它们不仅可以发酵出牛奶、醋、酸菜、酸奶等食品，也可以用作益生菌来调节肠道菌群平衡、提高免疫力。
除此之外，乳酸菌还具有抗菌、抗肿瘤、降血糖等多种生理功能。
乳酸菌中的胞外多糖是一种重要的生物活性物质，可以作为调节免疫、增强人体免疫力的天然免疫增强剂，近年来备受研究者关注。
已有的研究表明，胞外多糖的不同化学组成和结构对于其生物活性有着非常重要的影响。
因此，对于乳酸菌胞外多糖的化学组成进行深入研究，对于进一步探究其免疫调节机制具有非常重要的意义。
二、选题目的本研究旨在分离纯化乳酸菌胞外多糖，并对其化学组成进行分析。
在此基础上，进一步探究其对于免疫系统的调节机制，为其应用于食品添加剂、抗肿瘤药物和医学治疗等领域提供理论和实践依据。
三、研究方法1.乳酸菌的培养和胞外多糖提取选取适合的乳酸菌菌株，进行培养和胞外多糖提取。
对提取的胞外多糖进行初步鉴定。
2.胞外多糖的纯化利用物理和化学方法对提取的胞外多糖进行纯化。
3.多糖的结构和性质分析利用光学旋光仪、紫外分光光度计和高效液相色谱等化学分析方法，对乳酸菌胞外多糖的组成进行分析和鉴定。
4.对免疫调节作用的实验验证通过细胞实验、动物实验等方法，探究乳酸菌胞外多糖对于免疫系统的调节作用。
四、预期结果1.成功分离纯化乳酸菌胞外多糖。
2.通过化学分析方法，初步确定乳酸菌胞外多糖的化学组成。
3.对于乳酸菌胞外多糖的免疫调节作用进行深入研究，为其应用提供理论依据。
五、研究意义乳酸菌胞外多糖具有重要的生物活性，对于免疫系统的调节作用已得到广泛研究。
本研究将通过对其化学组成和免疫调节机制的深入研究，为其在食品添加剂、抗肿瘤药物和医学治疗等领域的应用提供理论和实践支持。
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芽孢杆菌胞外多糖的结构初步分析万红贵,袁建锋,单咸旸,朱明新,宗素艳,石楠(南京工业大学制药与生命科学学院,江苏南京,210009)摘 要 从筛选自新疆罗布泊沙漠的1株芽孢杆菌的发酵滤液中分离得到胞外多糖EPS 和EP S ,其中EPS 为主要成分,占总糖的89 5%,EP S 为糖蛋白,其分子质量为96 292ku,多糖含量为93 79%,蛋白含量为5 62%,不含糖醛酸,是由D N 乙酰葡萄糖胺,D 木糖和D 甘露糖构成,它们的摩尔比例是2 36 0 98 1 75。
EPS 为 型吡喃糖,经高碘酸氧化和Smit h 降解,EPS 中含有(1 ),(1 3)和(1 4)糖苷键,且(1 )和(1 4)糖苷键的比例为1 24 05,其中的糖肽是O 糖苷键。
关键词 芽孢杆菌,糖蛋白,结构分析第一作者:硕士,研究员。
收稿日期:2008-10-24,改回日期:2008-11-19细菌多糖主要以3种形式存在:胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖。
广义上的胞外多糖指的是糖被(gly cocalyx ),包括微荚膜、荚膜、黏液层和菌胶团,对细菌本身来说它具有很多的功能。
例如:保护细菌免受干旱损伤、免受宿主细胞的吞噬、储藏养料、堆积某些代谢和表面吸附作用等等;狭义上的胞外多糖指的是黏液层,是一种扩散到培养基中的多糖,也是人们通常所说的胞外多糖[1]。
细菌胞外多糖除了其对细菌自身的生物学意义之外,更重要的是由于它具有安全无毒、理化性质独特、用途广泛、易与菌体分离及可通过深层发酵实现工业化生产等优良性质而备受关注[2]。
近些年来,一些具有生物活性的细菌胞外多糖开始引起人们的重视,它们同一些真菌多糖和中草药多糖一样,对机体具有很强的免疫增强和抗肿瘤作用。
因此,它们作为一种新型糖,成为科学工作者研究的一个新热点。
本课题报道了细菌发酵粘液中分离得到多糖EPS 的理化性质和一级结构,为以后的进一步生物学功效的研究打下基础。
1 材料与方法1 1 供试菌株芽孢杆菌(Bacillus),筛选自新疆罗布泊沙漠。
1 2 仪器和试剂TGL 16G 高速离心机,上海安亭科学仪器厂;RE 52AA 旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;All tech 高效液相色谱仪,426型H PLC 泵,ELSD 2000检测器,Alltech 色谱工作站,美国奥泰科技有限公司;SH B 循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;数显恒温水浴锅H H 4,国华电器有限公司;PH S 3C 精密pH 计,上海精密科学仪器有限公司;DZF 602型真空干燥箱,上海博讯实业有限公司;BS 100A 自动部分收集器,上海沪西分析仪器厂;N ico let380FT IR,美国热电公司T herm o;TU 1901双光束紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;柱层析系统;BS124S 电子天平,北京赛多利斯仪器系统有限公司。
活性炭;Sephadex G-100(Wolsen);标准葡聚糖(Dex tran)(A R,国药集团化学试剂有限公司);其余试剂除注明外都为分析纯试剂。
1 3 培养基和培养条件培养基使用葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基。
16h 的种子以1%(体积比)的接种量转接至发酵培养基,500mL 发酵摇瓶的装液量为50mL,于30 ,200r/m in 的条件培养48h 。
1 4 胞外多糖EPS 的制备发酵液经离心除去菌体,得到的上清液使用Sevag 法除去杂蛋白,调节pH 值为7 0,以1 4的体积比加95%的乙醇,4 放置24h,10000r/m in,10m in 离心收集沉淀,真空干燥得粗多糖。
将粗多糖溶解后上活性炭柱(1 5cm 24cm ),先用蒸馏水60mL 洗脱,再用60%乙醇60mL 洗脱,最后使用95%乙醇60m L 洗脱,每150s 收集1管洗脱液,硫酸 苯酚法跟踪多糖分布,同时用考马斯亮蓝法跟踪蛋白质分布,收集主峰部分。
经过真空浓缩,上SephadexG 100柱纯化,硫酸苯酚法监测,收集其主峰部分,使用95%乙醇沉淀,真空干燥得到多糖纯品。
1 5 多糖的理化性质及组成分析1 5 1 EPS 的分子质量测定采用凝胶过滤色谱法测定[3]。
1 52 多糖的组成分析1 52 1 多糖含量测定采用硫酸 苯酚法[4],以葡萄糖作标准曲线,490 nm检测波长。
同样的操作,取1m L的样品液,测定490nm吸收值,由标准曲线计算多糖含量。
1 52 2 蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法[5],以牛血清蛋白作标准曲线,检测波长595nm。
1 523 多糖中糖链 肽链的连接方式的确定( 消除反应)[4]称4mg样品,溶解于3mL蒸馏水中,加入3 mL的0 4mol/L NaOH,于25 下反应,在开始和反应后的1 5h,分别进行紫外测定,根据碱处理后的多糖在240nm处光吸收值的变化,即是否出现羟基不饱和氨基酸的特征吸收,来判断多糖中糖与蛋白质结合的连结方式。
1 52 4 单糖组成分析称取3mg样品,按1 5 2 3操作,除去蛋白质肽链,调节pH值为7 0,经过透析袋透析12h,流水透析24h,然后加入5mL的2mol/L三氟乙酸,塞紧试管塞子,于80 下水解2h,结束后加入3mL的甲醇,60 下真空浓缩除去三氟乙酸,所得样品进行H PLC分析,用标准单糖进行外标,确定单糖组成。
色谱分析条件:Prevail Carbohydrate ES(250 mm 4 6mm,5 m)糖柱;流动相:V(乙腈) V(纯水)=75 25;流速:1 0m L/min;检测器ELSD 2000漂移管温度:80 ;气体流量:2 0L/m in;进样量:80 L。
1 52 5 糖醛酸含量分析采用硫酸咔唑法[6]。
1 6 多糖一级结构的初步分析1 6 1 光谱全波长扫描配制1mg/mL多糖溶液,以蒸馏水作为对照,于200~600nm波长区域扫描。
1 62 红外光谱测定采用KBr压片法[4]。
1 6 3 高碘酸氧化[4]称取多糖样品25mg,用少量水溶解,加入30 mmo l/L NaIO4溶液,定容至25m L,置于暗处,室温下进行反应,于0,6,12,24,36,48 h间隔取样0 1 m L,蒸馏水稀释250倍后,使用紫外分光光度计在223nm处测定光密度。
至光密度值达到稳定值时,加乙二醇破坏过量的高碘酸以终止反应。
由此光密度值根据标准曲线计算出高碘酸的消耗量,即可推算出每个糖基的高碘酸量。
取2mL上述反应溶液,使用0 01m ol/L的NaOH标准溶液测定甲酸的生成量,剩余部分进行Sm ith降解。
1 6 4 Smith降解[4]将1 6 3操作所剩下的溶液加入乙二醇并搅拌30m in以还原剩余的高碘酸。
对流水透析48h,蒸馏水透析过夜,于40 以下减压浓缩至10mL左右,加入70mg硼氢化钾于室温,暗处搅拌18~24h以还原多糖醛。
用0 1mol/L醋酸中和至pH6~7,对流水透析48h,蒸馏水透析24h,减压蒸干,加1 m ol/L H2SO42mL,封管,100 水解8h,用BaCO3粉末中和,定量滤纸过滤,滤液减压浓缩。
薄层色谱法检测降解产物,展开剂为V(正丁醇) V(乙酸) V(水)=4 l 5;显色剂为A gNO3。
点样采用甘露糖、赤藓醇、甘油标准品作为对照。
2 结果2 1 理化性质分析纯化后的多糖样品EPS 为棕灰色粉末,易溶于水,不溶于高浓度的乙醇、甲醇、以及丙酮、乙酸乙酯、氯仿、乙醚等有机溶剂。
其水溶液呈棕灰色黏稠状,与咔唑 乙醇液反应呈粉红色,苯酚 硫酸液反应呈黄棕色,蒽酮 硫酸液反应呈蓝绿色,与碘溶液不反应。
2 2 分子质量的测定用蓝色葡聚糖-2000上Sephadex G-100柱,测得外水体积V o,用标准分子质量的葡聚糖上柱测得各自的洗脱体积V e。
用V e/V o值对标准分子质量对数(Lo g M W)绘制标准曲线,得到回归曲线方程y =-1 8322x+2 2259(R2=0 9987),由EPS 上柱的洗脱液体积V e计算得分子质量为96 292ku。
2 3 多糖组分分析2 3 1 多糖含量和蛋白质含量分析以葡萄糖为标样,采用苯酚 硫酸法在490nm处测定不同标糖光密度值,以葡萄糖质量(g)为横坐标,光密度值为纵坐标制作标准曲线。
测得样品光密度值,根据回归曲线方程y=0 07247x+0 00563(R2 =0 9983),计算得出纯化后的EPS 糖含量为93 79%。
以牛血清白蛋白为标准品,考马斯亮蓝法在595 nm波长处测定蛋白质含量,得到标准曲线,根据回归曲线方程y=0 5695x-0 0095(R2=0 9986)得到EPS 中蛋白质含量为5 62%。
2 3 2 糖链 肽链连接方式的确定EPS 经0 4mo l/L NaOH于25 水解1 5h 后,对比240nm处的紫外吸收值,其结果如表1所示,在240nm处有明显的增大趋势,即出现了羟基不饱和氨基酸的特征吸收,因而可确定EPS 中糖肽的结合方式为O 糖苷键。
表1 碱处理前后EPS 在240nm处的紫外吸收处理方式时间/h240nm吸光度碱处理前01 265 1 51 694碱处理后01 264 1 51 2652 3 3 单糖组分分析EPS 经1 5 2 4操作与D 葡萄糖、D 木糖、D 甘露糖、D 鼠李糖、D 半乳糖、D 葡萄糖醛酸、D N 乙酰葡萄糖胺进行H PLC分析,结果如图1。
D N 乙酰葡萄糖胺,D 木糖和D 甘露糖,响应时间分别为2 254,7 025和8 726。
与EPS 的图谱进行比对,确定EPS 的单糖组成为D N 乙酰葡萄糖胺,D 木糖和D 甘露糖,它们的摩尔比是2 36 0 98 1 75。
图1 标准单糖溶液和EPS 的色谱图2 3 4 糖醛酸含量测定以标准葡萄糖醛酸作为对照,通过硫酸咔唑法,制作糖醛酸含量标准曲线,由回归曲线方程y= 3 4634x-0 0101(R2=0 9994),得EPS 中不含糖醛酸。
2 4 多糖一级结构的初步分析2 4 1 光谱全波长扫描分析EPS 的光谱扫描(图2)表明,在260nm未发现核酸特征吸收,但在280nm发现有极微弱的蛋白吸收,这与蛋白含量测定中,蛋白质含量较低相对应。
图2 EP S 的紫外吸收图谱2 4 2 红外光谱分析EPS 的红外光谱(图3)表明,在3500cm-1~ 2800cm-1和1665cm-1~1635cm-1的吸收峰表明EPS 为糖类化合物,其中3420cm-1为羟基O H 的伸缩振动,2925cm-1为糖类的C H伸缩振动,1 650cm-1为糖的乙酰氨基的特征峰;1250cm-1~ 950cm-1的一组吸收峰,是吡喃糖环的醚键(C-O-C)和羟基吸收峰,890cm-1附近是吡喃糖 型C-H 变角振动的特征峰,由此可以推断EPS 中有 型糖苷键。