实验十三血清尿素氮测定(脲酶—Berthelot比色法)
生物化学的基本操作与血清尿素测定实验报告
生物化学的基本操作与血清尿素测定实验报告
一、实验原理：
二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的二甲基氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。
因二乙酰不稳定，故由试剂中二乙酰与强酸作用产生二乙酰。
二、实验试剂：
1、酸性试剂：在三角烧瓶中加去离子水约100ml，然后加入浓硫酸
44ml、85%磷酸66ml。
冷至室温，加入氨基硫脲50mg及硫酸镉2g，溶解后用去离子水稀释至IL。
置棕色瓶中，4℃可保存半年。
三、基本操作及注意事项：
1、试剂中加入氨基硫脲和镉离子，可增进显色强度和色泽稳定性，但仍有轻度褪色现象，（每小时小于5%）。
煮沸显色经冷却后，应及时比色。
2、尿液中尿素也可用此法测定，但因浓度高，需先用去离子水作50倍以上稀释。
四、评价：
1、本法试剂单一，方法简便，但试剂毒性和腐蚀性。
在标本数量多时加热开始难以达到100℃，各管间受热温度也可能不一致，因而本法重复性不佳。
酶的测定(详细)
一、脲酶测定(比色法)1.方法原理脲酶广泛存在于土壤中，它能酶促尿素分解生成氨、二氧化碳和水。
测定脲酶的方法很多，包括比色法、扩散法、电极法等，其中比色法最为常用。
现介绍苯酚一次氯酸钠比色法，该方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚次氯酸钠作用(在碱性溶液中及在亚硝基铁氰化钠催化剂作用下)生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。
2.试剂配制（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
3.操作步骤取5g风干土置于50mL三角瓶中，加1mL甲苯。
15min后加10mL10％尿素溶液和20mLpH=6.7柠檬酸盐缓冲液。
摇匀，37℃恒温箱中培养24h。
过滤，取1mL滤液注入50mL 容量瓶中，然后按配制标准曲线显色方法进行比色测定（为了消除土壤中原有的尿素而引起的误差，每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。
）。
标准曲线配制：分别取0、l、3、5、7、9、11、13mL氮工作液，移于50mL容量瓶中，然后加蒸馏水至20mL。
再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液。
随加随摇匀。
20min 后显色，定容。
lh内在分光光度计上于波长578nm处比色。
根据吸光值与氮溶液浓度绘制标准曲线。
测血清尿素含量实验报告
一、实验目的1. 掌握血清尿素含量测定的原理和方法；2. 熟悉实验操作步骤，提高实验技能；3. 了解血清尿素在临床医学中的意义。
二、实验原理血清尿素含量测定采用二乙酰-肟法，其原理如下：在强酸条件下，二乙酰与尿素发生缩合反应，生成红色的4,5-二甲基-2-氧咪唑化合物。
该化合物的颜色深浅与尿素的含量成正比。
通过比色法，可以计算出血清中尿素的含量。
三、实验材料1. 试剂：二乙酰-肟试剂、血清、盐酸、氢氧化钠、蒸馏水等；2. 仪器：紫外可见分光光度计、移液器、试管、试管架等。
四、实验步骤1. 标准曲线绘制：（1）取6支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的标准尿素溶液；（2）向各试管加入2ml的二乙酰-肟试剂，充分混匀；（3）将试管置于60℃水浴中反应30分钟；（4）取出试管，用蒸馏水定容至5ml；（5）以蒸馏水为空白，在波长540nm处测定各管的光密度（OD）；（6）以尿素浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 血清尿素含量测定：（1）取6支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的血清样本；（2）按照标准曲线绘制步骤中的操作，进行反应和测定；（3）以蒸馏水为空白，在波长540nm处测定各管的光密度（OD）；（4）根据标准曲线，计算血清中尿素的含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：绘制标准曲线，结果显示尿素浓度与光密度呈线性关系，相关系数R²=0.998。
2. 血清尿素含量测定：根据标准曲线，计算各血清样本中尿素的含量，结果如下：样本1：尿素含量为5.2mmol/L；样本2：尿素含量为6.8mmol/L；样本3：尿素含量为7.4mmol/L；样本4：尿素含量为8.2mmol/L；样本5：尿素含量为9.0mmol/L；样本6：尿素含量为10.0mmol/L。
六、实验讨论1. 实验过程中，二乙酰-肟试剂的浓度、反应时间、温度等因素对实验结果有较大影响，应严格控制实验条件，以保证结果的准确性。
尿素氮测定
取4只试管，具体操作按下表进行。 加入物(ml) 空白管（B） 标准管（S） 测定管（人） 测定管（牛）
血清
尿素标准应用液 蒸馏水 二乙酰一肟溶液 尿素氮试剂
—
— 0.1 0.5 5.0
—
0.1 — 0.5 5.0
0.1
— — 0.5 5.0
0.1
— — 0.5 5.0
各管混匀后，置沸水中加热15min，取出置冷水中冷却后，分光光度计波长540nm，
【注意事项】 1．试剂中加入硫氨脲和镉离子可增加显色强度和色泽的稳 定性，还可消除羟胺的干扰，但仍有轻度退色现象，故应及时
比色。
2．尿液中尿素亦可用此法测定，但因尿液中尿素浓度较高，
需将尿液作50倍以上稀释后再行测定。
3．尿素浓度以前习惯用尿素氮表示，尿素分子中含有二个 氮原子，因此1mmol/L尿素等于2 mmol/L尿素氮。世界卫生组 织推荐使用尿素，并以mmol/L表示浓度单位，我国卫生部也已 规定一律使用尿素，不再使用尿素氮一词。
响肾小球滤过的疾病，都可使血液尿素含量增高。
3) 肾后性疾病：所有使尿路阻塞的因素都可引起血液尿素含量增加，如前列腺肿 大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致尿道受压等。
2.血液尿素浓度降低较为少见，除婴儿、妊娠（血容量增加）及低蛋白高糖饮食
外，常见于严重肝病患者，如肝炎合并广泛性肝坏死、肝功能衰竭等。
血清（血浆）尿素氮测定
（二乙酰一肟显色法）
非蛋白含氮化合物包括除蛋白质以外的 尿素、肌酐、肌酸、尿酸、氨基酸、核苷酸、 嘌呤、谷胱甘肽等多种含氮有机物。体内氨 基酸代谢产生的氨，主要经肝脏生成尿素， 而后又主要经肾脏排出体外。因此，血清尿 素浓度的测定是临床上应用较多的反映肾小
血清尿素测定(精)
样本（微升） 校准液（微升） 蒸馏水（微升） 试剂R1（微升） 试剂R3（微升）
测定 10
50 1000
混匀，置37摄氏度水浴恒温5分钟 试剂R4（微升） 1000
校准 10 50 1000
1000
空白
10 50 1000
1000
混匀，置37摄氏度水浴恒温5分钟，600纳米波长，以空白管调零，测定 各管吸光度值。
血清尿素测定
尿素的测定方法
尿素（urea）是氨基酸分解代谢的最 终产物，在肝脏合成，通过血液运至肾 脏，从尿中排除。检测尿素的方法有二 乙酰一肟法和酶法。二乙酰一肟法操作 简便，仍为大多数基层医疗单位所采用。
脲酶波氏法是我们今天实验课所选用的 酶法。
பைடு நூலகம்
实验原理
脲酶水解样本中的尿素，产生两分子氨和一分 子的二氧化碳。氨在碱性条件下与酚及次氯酸 反应，在亚硝基铁氰化钠催化作用下生成蓝色 化合物，与经过同样处理的校准液进行比较， 即可计算出样本中尿素的含量。（终点法）
方法局限性
1.尿液尿素也可用此法测定，但因浓度 高（超过28mmol/L），需先用去离子 水稀释。
再乘以稀释倍数。 2.试剂变混浊或空白吸光度大于0.150，
将不能使用，应弃去。 3.所用试验器材必须清洁，避免氨污染。 4.试剂含化学成分，应避免氨污染。
环功能不全、心功能不全，休克等引起肾血流 量减少，肾小球滤过率减低而使血中尿素潴留； ②肾性：急性肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能 衰竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾炎都可出现血 中尿素含量增高。③肾后性疾患：如前列腺肿 大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道 受压等都可能使尿路阻塞引起血液中尿素含量 增加。 2.血清尿素减少 较少见，尿素减少表示严重 肝病，如肝炎合并广泛性肝坏死。
二乙酰一肟法测定血清尿素
二乙酰一肟法测定血清尿素二乙酰一肟法测定血清尿素【目的】掌握血清尿素氮的测定原理和方法；了解尿素氮测定的临床意义及正常值。
【原理】二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。
因二乙酰不稳定，故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用产生二乙酰。
【器材】可见分光光度计、微量移液器、刻度吸管、试管【试剂】1．酸性试剂在三角烧瓶中加去离子水约100ml，然后加入浓硫酸44ml、85%磷酸66ml。
冷至室温，加入氨基硫脲50mg及硫酸镉(CdSO4·8H2O)2g，溶解后用去离子水稀释至1L。
置棕色瓶中，4℃可保存半年。
2．179.9mmol/L二乙酰一肟溶液称二乙酰一肟20g溶于去离子水中并定容至1L。
置棕色瓶中，4℃可保存半年。
3．尿素标准贮存液(100mmol/L) 精确称取于60～65℃干燥恒重的尿素(Mw为60.06)0.6g，溶解于无氨去离子水，并定容至100ml，加0.1g叠氮钠防腐，4℃可保存6个月。
4．尿素标准应用液(5mmol/L) 取5ml上述贮存液用无氨去离子水稀释至100ml。
【操作步骤】按下表操作。
二乙酰一肟法操作步骤加入物(ml) 空白管标准管测定管血清－－0.02尿素标准应用液－0.02 －去离子水0.02 －－二乙酰一肟溶液0.5 0.5 0.5酸性试剂 5.0 5.0 5.0混匀，置沸水浴加热12min，取出置冷水中冷却5min，以空白管调零，在540nm 处读取各管吸光度。
【计算】 5)/(?=标准测定尿素A A L mmol【参考范围】血清尿素1.78～7.14mmol/L 。
【临床意义】1．血液尿素浓度增高分生理性和病理性因素两方面。
(1) 生理因素：高蛋白饮食引起血清尿素浓度和尿液排出量显著增高。
血清尿素浓度男性比女性平均高0.3～0.5mmol/L ，随年龄增加有增高倾向。
成人日间生理变异平均为0.63mmol/L 。
尿素测定方法的概述
尿素测定方法的概述【摘要】尿素是人体内蛋白质代谢的最终产物，由肝脏合成主要通过肾脏排出。
血清尿素的测定是临床上用于诊断和观察各种肾脏疾病的一项重要指标。
尿素浓度处于各个不同的医学决定水平有着不同的临床意义。
并且尿素的检测对慢性肾脏疾病的病程、病情观察及预后判断均有意义，但它并不是肾功能损伤的特异性指标[1]。
以往测定尿素采用尿素氮报告结果，但无论在生理或病理情况吓，能够确切反映肾功能、体液渗透压等有效成分实为尿素而非为尿素氮。
固现推荐统一采用尿素报告结果。
换算公式为：1mmol/L尿素氮=1/2mmol/L[2]。
【关键词】尿素;脲酶;比色法1 标本血清和肝素抗凝血浆在二乙酰一肟法，脲酶/GLDH，离子导电法中均可应用。
氟化物能抑制脲酶反应，故不能用氟化物作为血清的抗凝剂，肝素铵抗凝剂也不能在脲酶法中使用。
尿标本按照1：20到1：50稀释后，可用以上三种方法测定。
由于尿素易于被细菌降解，故血清和尿样品在分析前应放置在4—8℃。
2 测定方法血清尿素的测定是临床上用来诊断和观察各种肾脏疾病的重要生化指标，尿素的测定方法包括：氨电极法、脲酶-波氏法，脲酶-谷氨酸脱氢酶偶联法，脲酶-亮氨酸脱氢酶偶联法等等[3]2.1 化学法2.1.1 二乙酰一肟显色法：尿素可与二乙酰作用，在强酸加热条件下，生成粉红色的二嗪化合物，在540nm比色，因二乙酰不稳定，常用二乙酰一肟代替，后者遇酸水解成二乙酰。
反应式如下：此法专一性差，线性范围狭窄，且试剂中含有烈性化学物，易腐蚀仪器和污染环境。
2.1.2 邻苯二甲醛比色法：尿素在强酸性环境下，与邻苯二甲醛缩合产生橙红色产物，比色测定之。
2.1.3 二苯吡喃醇比浊法：尿素与二苯吡喃醇结合形成不溶性沉淀，比色测定之。
[5]采用化学法检测尿素，特异性均不高，如瓜氨酸对二乙酰反应有正干扰；甘氨酸、精氨酸、瓜氨酸及磺胺类药物对邻苯二甲醛反应有正干扰。
加之要用强酸或强碱环境，或需要较高温度（90℃）反应，较难实现自动化，故这类方法已经较少使用[5] 。
脲酶波氏比色法和全酶法测定UN 医学课件
【计算】
尿素(mm ol/ L) A测定 7.14 A标准
1mmol/L尿素=6.02mg/dl尿素 =2.802mg/dl尿素氮
【参考范围】 1.8-6.8 mmol/L。
【注意事项】
1.呈色稳定性 在1h内吸光度的波动仅为0.005，12h后较最 初吸光度读数也仅增高0.01～0.02。
二、脲酶－波氏比色法
【原理】
脲酶水解尿素产生2分子氨和1分子二氧化 碳，氨在碱性介质中与苯酚及次氯酸钠反应， 生成蓝色的吲哚酚阴离子，此过程需用亚硝 基铁氰化钠催化反应。蓝色吲哚酚的生成量 与尿素含量成正比，在630nm波长比色测定。
脲酶
尿素+H2O
2NH3 +CO2+2H2O
NaOH
氨+次氯酸钠+苯酚
吲哚酚（蓝色）
亚硝基铁氰化钠
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
【试剂】
1.脲酶应用液（R1） 脲酶≥5000U/L， EDTA-Na21.26g/L，磷酸氢二钾
5.77g/L。 2.酚显色剂（R2） 苯酚10g，亚硝基铁氰化钠(含2分子水)0.05g，溶于1L
无氨去离水中。 3.碱性次氯酸钠溶液（R3） 氢氧化钠5g溶于无氨去离子水中，加“安替福明”8ml (相当于次氯酸钠0.42g)，再加无氨去离子水至1L。 4. 尿素标准液:7.14mmol/L
2、尿酶法 是直接或间接测定经脲酶作用后由尿 素转变成的氨，氨的测定方法有： 1) 利用电导电极测量导电率的变化。 2) 利用pH电极或pH指示剂测量反应前后pH值的 变化。 3) 波氏法。波氏比色法在基层实验室较多用。 4) 偶联谷氨酸脱氢酶340nm测定吸光度下降率。 5）干化学法。
与谷氨酸脱氢酶偶联，使用连续监测法测定，可自 动化，目前在多数医院普遍使用。
尿素检测实验报告
一、实验目的1. 了解尿素的性质和检测方法；2. 掌握尿素检测的原理和操作步骤；3. 提高实验技能和数据分析能力。
二、实验原理尿素检测方法有多种，本实验采用酶偶联法检测血液中的尿素含量。
该法基于尿素酶催化尿素分解生成氨和二氧化碳，氨与酚试剂反应生成蓝色化合物，通过测定蓝色化合物的吸光度，计算出尿素的含量。
三、实验材料1. 试剂：尿素酶试剂、酚试剂、氨试剂、盐酸、蒸馏水、去离子水；2. 仪器：分光光度计、移液器、试管、烧杯、滴定管、天平等。
四、实验步骤1. 样品处理：取新鲜血液约1ml，加入抗凝剂，充分混合，离心分离血浆；2. 标准曲线绘制：取不同浓度的尿素标准溶液，按照实验方法测定吸光度，以尿素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；3. 样品测定：取血浆样品，按照实验方法测定吸光度，从标准曲线上查出对应的尿素浓度；4. 结果计算：根据样品测定结果和标准曲线，计算尿素的含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：根据实验数据，绘制标准曲线，得出标准曲线方程为y=0.0046x-0.0057，其中y为吸光度，x为尿素浓度；2. 样品测定：取血浆样品，测定吸光度为0.72，从标准曲线上查出对应的尿素浓度为12.2mmol/L；3. 结果计算：根据样品测定结果和标准曲线，计算尿素的含量为12.2mmol/L。
六、实验讨论1. 尿素是人体代谢产物，其含量反映了肾脏排泄功能。
尿素检测对于肾脏疾病的诊断和病情监测具有重要意义；2. 本实验采用酶偶联法检测尿素，该方法具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点；3. 实验过程中，需要注意以下几点：样品处理要迅速，避免尿素分解；试剂要新鲜，保证实验结果的准确性；标准曲线绘制要准确，避免实验误差。
七、实验结论本实验通过酶偶联法检测了血液中的尿素含量，结果表明，尿素检测方法具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点，适用于临床医学和科研工作中。
八、实验拓展1. 研究不同疾病状态下尿素的含量变化，为临床诊断提供依据；2. 探讨尿素检测在其他生物样品中的应用，如尿液、组织等；3. 优化尿素检测方法，提高检测灵敏度和特异性。
尿素酶试验原理
尿素酶试验原理
尿素酶试验是一种常见的生化检验方法，它能够检测血清或血浆中尿素的含量。尿素
酶试验的原理是利用尿素酶将尿素分解成氨和二氧化碳，然后测定生成的氨的含量，从而
计算出血浆或血清中尿素的浓度。
尿素是由肝脏合成的一种无机化合物，主要由血液循环送往肾脏以及其他组织。在肾
脏中，尿素被过滤，然后再通过肾小管重新吸收部分的尿素。因此，尿素的浓度与肝脏和
肾脏的功能密切相关。
尿素酶是一种特殊的酶，它可以将尿素分解成氨和二氧化碳。在尿素酶试验中，首先
需要将样本中的尿素和尿素酶混合，形成反应体系。在适当的反应温度和酸碱条件下，尿
素酶开始催化尿素的分解，产生氨和二氧化碳。
尿素酶试验通常使用比色法或电化学法进行测定。比色法是通过氨与某些化学试剂反
应，产生颜色变化，然后通过比色计测定颜色的强度来计算出氨的含量。电化学法是将反
应体系中产生的氨传递到电化学电极上，然后通过电位差变化来测定氨的含量。
尿素酶试验在临床应用中有着广泛的应用。它可以用于检测肝脏和肾脏的功能，尤其
是用于评估肝和肾的疾病，如肝硬化、肾病综合征和急性肾衰竭等。此外，尿素酶试验还
可以用于评估胃肠道出血、脱水和感染状态等。
总之，尿素酶试验是一种简单而有用的生化检测方法，它可以帮助医生评估肝脏和肾
脏的功能，为临床诊断和治疗提供重要的信息。
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实验十三 血清尿素氮测定（脲酶—Berthelot比色法）
一、 实验目的与要求
1 了解血液尿素氮（BUN）在人体营养学上的生理学意义及其在代谢上的重要性。
2 掌握血液尿素氮测定方法及721分光光度计或AT648半自动生化多用仪的使用方法和
现代生化检测试剂盒的应用。
二、 实验原理
尿素在脲酶作用下分解生成氨。在碱性条件下，经次氯酸氧化生成的氯胺与苯酚被亚硝基铁
氰化钠催化生成蓝色的靛酶。其反应式为： CH2NH2N尿素O+HOH脲酶NH3彩+CHOH2N氨基甲
酸O-2NH3+CO2
氨
NH3+OCl-NH2Cl+OH-
次氯酸氨胺催化剂
NH2Cl+OH+OH-Cl-+H2O+HONH2
苯酚P胺基苯酚
HONH2+OH-+O2==N——O-+H2O
酚靛三、 实验仪器与试剂
1 仪器
（1） AT648半自动生化分析仪1台；
（2） 4孔恒温水浴锅1个；
（3） 振动摇床1台。
2 分组及仪器2人一组，每组仪器包括：
（1） 试管架1个；
（2） 2ml试管10个；
（3） 20μl微量加样器1个；
（4） 1ml移液管1个；
（5） 5ml移液管2个；
（6） 吸耳球1个；
（7） 搪瓷盘1个；
（8） 微量加样滴头；
（9） 吸水纸。
3 本试剂盒内含5种试剂：
（1） 脲酶（冻干） 2瓶
（2） pH 8.0缓冲液： 由乙二胺四乙酸二钠盐和磷酸氢二钾组成 1×46ml
（3） 显色剂Ⅰ： 由苯酚和亚硝基铁氰化钠组成 1×225ml
（4） 显色剂Ⅱ： 由氢氧化钠和安替福民组成 1×225ml
（5） 尿素氮标准液 （20mg/dl） 2×2ml
四、 实验步骤
1 血清
（1） 取脲酶一瓶，用23.0ml pH 8.0缓冲液溶解。
（2） 于一系列试管中，按下表加入各溶液。表131系列反应管中所加溶液的量
空白管标准管样品管样品（μl）——20标准液（μl）—20—酶液（μl）0.50.50.5
（3） 于37℃水浴中保温15min，然后各管分别加入显色剂Ⅰ和显色剂Ⅱ各2.5ml。
（4） 再于37℃水浴中保温20min，取出冷却至室温，于721分光光度计/ AT648半自动生
化分析仪上550nm波长下比色。以空白管校正“0”点、读取各管的光密度。
2 尿液用无氨水将尿液稀释20倍，再按上法测定。
五、 实验结果与分析
尿素氮含量（mg/dl）=测定管吸光度标准管吸光度×稀释倍数×20mg/dl线性范围： 血清
中尿素氮含量为100mg/dl或尿液中尿素氮含量为2000mg/dl以内，用本试剂盒测得的结果
线性良好。
六、 实验报告
参照《营养学》、《生物化学》原理分析。
七、 注意事项
1 试剂为空白对照；
2 每组样品做2～3个平行实验；
3 正常参考值： 正常人血清尿素氮含量为5～17mg/dl；尿素氮标准液
20mg/dl=7.14mmol/L。