免疫组织化学步骤详解

免疫组织化学技术

取材

将小鼠麻醉，打开胸腔充分暴露心脏，在心尖处剪一个小口，将注射器针头经小口送入左心室并插至升主动脉起始部，用线将针头固定，剪破右心耳，灌注50ml 生理盐水。随后缓缓注入150ml4%多聚甲醛(pH

7.4),固定1h后将脑取出，浸于4%的多聚甲醛中放入4C冰箱内固定12h,然后转入30%的蔗糖溶液中浸泡48h。

石蜡包埋

1•取出皮层及海马，流水冲洗24h，用梯度浓度的酒精进行脱水，酒精浓度梯度为70%酒精—80%酒精—90%酉精，各30min, 95%酒精I —95%酒精II，各

20min, 100%酒精I —100%酉精I ,各15min。

2•取出皮层及海马，浸入到二甲苯中透明，1h X2次。

3. 取出皮层及海马,浸入到二甲苯与石蜡1:1 混合液中,浸泡1 小时。

4•取出皮层及海马，浸入到石蜡中，浸泡1小时X2次。

5•在石蜡包埋机上进行组织包埋，冷却后保存在 4 C冰箱中备用。

切片

将组织用石蜡切片及进行切片，切片厚度为 2 am。连续切片5次，取1张

切片，水浴锅展片后贴附在多聚赖氨酸包被的载玻片上。每个组织取5张切片。所有切片在烤箱中60C烤片2h。

脱蜡及水化(48min)

1. 切片在二甲苯中脱蜡10min x次。

2•切片在梯度浓度酒精中水化，酒精梯度浓度为100%酒精I —100%酉精I—95%!精I —95%!精I，各5min，90%酒精—80%!精，各3min，70%酒

精，2min。

3.最后蒸馏水中浸泡1min。

灭活内源性的过氧化物酶(40min)

1. 用

0.01M PBS冲洗3次，每次5min

2. 滴加3%H

2O

2(先用现配)到切片上，孵育10分钟。

3. 切片用

0.01M PBS洗5 分钟X3次。

抗原修复(70min)

1•将事先配制好的抗原修复液在水浴锅中加热到95C。

2 .将切片浸入到

0.01M 的柠檬酸盐缓冲液( pH

6.0)修复液中，进行抗原修复15分钟。

3 .修复后，取出切片，室温下冷却复温40分钟。

4. 切片用

0.01M PBS洗5 分钟X3次。

膜打孔(25min)

1. 滴加

0.3% Trit on X-100曲拉通，现用现配)到组织片上，室温下孵育10 分钟

2. 切片用

0.01M PBS洗5分钟X3次。

封闭(20min)

1.滴加10% BSA至组织片，室温下孵育20分钟。

2•倾去BSA勿洗。免疫反应

1. 滴加一抗至组织片上。用于DAB显色的组织片一抗浓度为1:500,用于免疫荧光的组织片一抗浓度为1:2000。

2. 组织片4C孵育过夜。

3. 第二天取出组织片,室温下复温1h。

4. 组织片用

0.01M PBS洗5min X 次。

5. 滴加二抗，用于DAB显色的组织片滴加山羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗,浓度为

0.4:250;用于免疫荧光的组织片滴加山羊抗兔FITC标记的二抗，浓度为1:150。

6. 滴加二抗后,酶标组织片室温下孵育一个小时,用

0.01M PBS洗5分钟X3次，进行后续实验步骤。FITC标记组织片室温下孵育30 分钟,缓冲甘油封片,镜检。

显色

滴加DAB显色液，光镜下显色，待颜色满意后，自来水冲洗终止显色，冲洗时间5min。

xx 素复染

组织片浸入苏木素染液染色2min，自来水冲洗1mi n,取出后1%盐酸酒精

分化10s,自来水冲洗2min,氨水返蓝15s,双蒸水冲洗1min。

封片

将切片依次浸入70%、80%和90%的梯度酒精中各2min,随后浸入2次95%的酒精和2次无水乙醇中各3min。接着浸2次二甲苯，每次5min。最后用树胶封片。

普通：

在载玻片组织上滴一滴封片液,然后使盖玻片倾斜,一侧先接触液体,缓慢盖在组织上,避免其产生气泡。

用荧光封片剂封片,不能滴太多,放盖玻片的时候避免气泡,尤其组织周围。然后用中性树胶滴盖玻片的四角,少滴。30min 后放锡纸盒中,冰箱四度保存。

免疫组织化学配方

0.1M PBS：

NaH2PO42H2O

15.5g, Na2HPO412H2O 6g NaCl

87.75g,双蒸水溶解后调pH至

7.2，用双蒸水定容至1L。

0.01M PBS：

用双蒸水将

0.1M PBS稀释10 倍。

4%多聚甲醛磷酸缓冲液：40g 多聚甲醛和500ml

0.1M PBS混匀后加热至60C，搅拌并滴加1N NaOH至溶液清晰为止，冷却

后用

0.1M PBS 定容至1000ml。

3%H2O2 30%H2O2 100 □与

0.01M PBS 900混匀。现用现配。

Tris-EDTA抗原修复液：

将Tris碱

1.21g，EDTA

0.37g 溶于双蒸水，调pH 至

9.0,加入吐温-20 500从双蒸水定容至1000ml。

10%BSA 10g BSA溶于100ml

0.01M PBSxx。

0.3%TritonX-100xx:

TritonX-1003 □同

0.01MPBS997^混匀。现用现配。

盐酸酒精：1ml 盐酸同99ml 75%的酒精混匀。

抗原修复液（柠檬酸钠缓冲液）（10mM 柠檬酸钠，

0.05%吐温20，PH

6.0）的配方：

柠檬酸钠（2H2O2）

2.94g，双蒸水溶解，用1mol/L的盐酸调PH至

6.0，力口500 □吐温20,定容到1L,室温下可保存3个月