荧光共振能量转移
通过荧光共振能量转移技术研究蛋白质相互作用的实验方案
通过荧光共振能量转移技术研究蛋白质相互作用的实验方案引言：蛋白质是细胞中最重要的生物大分子之一，其相互作用是细胞内各种生物过程的基础。
荧光共振能量转移技术（FRET）是一种重要的生物物理方法，可以用于研究蛋白质相互作用。
本文将介绍一种基于FRET技术的实验方案，用于研究蛋白质相互作用的机制。
一、实验原理荧光共振能量转移技术基于两个荧光染料之间的能量传递过程。
当两个荧光染料距离足够近并且能量传递的条件满足时，能量将从一个荧光染料转移到另一个荧光染料上，从而引起荧光信号的变化。
在蛋白质相互作用研究中，通常将感兴趣的蛋白质标记上两个荧光染料，一个作为受体，一个作为给体。
当两个蛋白质相互作用时，两个荧光染料之间的距离发生改变，从而引起FRET信号的变化。
二、实验步骤1. 蛋白质标记首先，选择适合的荧光染料，并将其共价地标记到感兴趣的蛋白质上。
这可以通过化学反应或基因工程技术实现。
确保标记的荧光染料在蛋白质结构中不会引起明显的结构改变，以保证实验结果的准确性。
2. 荧光光谱分析使用荧光光谱仪对标记的蛋白质进行荧光光谱分析。
通过测量给体荧光和受体荧光的光谱特性，确定荧光染料的最大激发波长和最大发射波长。
这些参数将在后续实验中用于选择适当的激发光和检测光。
3. FRET效率测定使用FRET效率测定实验，确定两个荧光染料之间的能量传递效率。
这可以通过测量给体荧光的减弱和受体荧光的增强来实现。
根据FRET效率的计算公式，可以得到两个荧光染料之间的距离。
4. 蛋白质相互作用实验将标记的蛋白质样品加入到含有适当缓冲液的反应体系中，使蛋白质相互作用。
然后使用荧光光谱仪或荧光显微镜等设备，测量FRET信号的变化。
根据FRET效率的变化，可以推断蛋白质相互作用的强度和机制。
三、实验注意事项1. 荧光染料的选择应考虑其激发和发射波长的重叠程度，以及在生物体系中的稳定性和光学性质。
2. 蛋白质标记的方法应选择对蛋白质结构影响较小的方法，避免影响实验结果的准确性。
fret荧光共振能量转移原理,cfp,yfp
FRET荧光共振能量转移原理在细胞和分子生物学研究中具有重要意义。
今天我们将深入探讨这一原理，以及其在分子生物学领域的应用。
我们将介绍FRET的基本概念，然后深入研究其原理和机制，最后探讨其在CFP和YFP荧光蛋白上的应用。
一、FRET的基本概念1. FRET的全称是荧光共振能量转移（Förster Resonance Energy Transfer），是一种不涉及光子发射的非辐射能量转移过程。
2. FRET的原理是一个激发态分子（受体）吸收一个激发光子后，将其激发跃迁能量无辐射地传递给另一个近距离分子（给体），从而导致给体荧光增强，而受体荧光猝灭。
3. FRET的效率与给体和受体之间的距离的六次方成反比，因此可以用于研究生物分子之间的距离和构象变化。
二、 FRET的原理和机制1. FRET的原理基于电偶极-电偶极相互作用，只有在给体和受体之间的距离在1~10纳米范围内时，才能有效发生FRET过程。
2. FRET的机理涉及受体分子的非辐射跃迁和给体分子的荧光发射，其过程受到分子间相对取向、偶极矢量之间的相互作用以及状态密度等因素的影响。
3. FRET的效率取决于给体和受体的光谱特性以及它们之间的相对取向，可以通过FRET效率公式计算。
三、FRET在CFP和YFP荧光蛋白上的应用1. CFP（Cyan Fluorescent Protein）和YFP（Yellow Fluorescent Protein）是两种常用的荧光蛋白，它们之间的FRET对于构建生物传感器和研究生物分子相互作用具有重要意义。
2. 通过将CFP和YFP融合构建成融合蛋白，可以利用FRET技术研究细胞内蛋白质相互作用、信号传导和代谢途径等生物过程。
3. 利用FRET技术可以定量分析生物分子的相互作用距离和构象变化，为分子生物学和细胞生物学研究提供有力的工具。
FRET荧光共振能量转移原理在分子生物学和细胞生物学研究中具有广泛的应用前景，通过深入理解其原理和机制，以及在CFP和YFP荧光蛋白上的应用，能够为相关领域的研究提供重要的理论和实验基础。
荧光共振能量转移技术
荧光共振能量转移技术
荧光共振能量转移技术（FRET）是一种利用物理吸收和发射光来传输能量的技术。
它可以用来衡量蛋白质相互作用，转录活性和信号传递的量变。
FRET技术是一种无损分析技术，可以用来测量活性蛋白分子之间的距离，以及蛋白质之间的相互作用。
荧光共振能量转移技术利用一种名为荧光共振能量转移的现象，其原理是利用一种称为荧光探针的分子，它包含一种特定的光化学发射物质，当其受到一定能量的光激发时，它就会发射出特定波长的光，并将能量传递到另外一种特定的物质上，从而使其发射出另外一种特定波长的光。
荧光共振能量转移技术可以被用来检测和监测生物大分子的动态变化。
荧光共振能量转移技术可以测量大分子之间的距离，从而确定蛋白质的空间结构和活性。
荧光共振能量转移技术也可以用来研究蛋白质的动力学行为，从而探索生物大分子的功能。
荧光共振能量转移技术是一种非常灵活的技术，由于其可以分析大分子之间的空间结构，动力学行为和蛋白质之间的相互作用，因此被广泛应用于生物信号传导、转录活性、蛋白质相互作用等方面的研究。
总之，荧光共振能量转移技术是一种有效的技术，可以用来研究生
物大分子的结构和动力学行为，从而深入了解生物信号传导、转录活性和蛋白质之间的相互作用。
核酸荧光探针荧光共振能量转移的研究及其应用
核酸荧光探针荧光共振能量转移的研究及其应用在生命科学领域中，核酸的检测和分析一直是一个非常重要的研究方向。
为了能够更好地对核酸进行检测和分析，人们发明了一种新技术——核酸荧光探针荧光共振能量转移技术（FRET），取得了很多成功的应用。
本文就来详细介绍一下这项技术。
一、荧光共振能量转移的原理及机制荧光共振能量转移技术是通过两个特殊设计的荧光分子之间的相互作用来实现研究的。
其中，一个荧光分子作为受体，另一个作为供体。
当两个荧光分子处于一定的距离时，荧光供体的激发态能量可以通过非辐射跃迁的方式传输到荧光受体上，荧光受体因此得以激发并发射荧光。
这个过程中，荧光供体和荧光受体的各种物理特性都会对能量传递过程产生影响。
荧光共振能量转移过程中，能量传递的距离直接关系着传递效率的高低。
在一般情况下，这个距离多在10至100埃之间。
此外，还需要荧光供体和荧光受体吸收和发射的波长有重叠区域。
这就要求两种荧光染料有一定的重叠波长区域，才能使能量传递过程更加有效。
二、核酸荧光探针荧光共振能量转移的研究FRET技术被广泛应用于核酸分析中，尤其是DNA和RNA的测序、检测和描绘。
在这里，核酸荧光探针是一种特殊的FRET体系，它由荧光供体和荧光受体一起组成，这两个分子都和核酸连在一起。
核酸荧光探针能够通过特异性与DNA或RNA杂交形成双链结构，从而实现能量传递过程。
由于DNA和RNA本身之间是具有一定的互补性质的，因此核酸荧光探针可以通过这个互补性定位到特定的序列中进行检测和分析。
在设计核酸荧光探针时，选择合适的荧光供体和荧光受体也是非常重要的。
供体和受体的选择需要充分考虑它们的吸收与发射光谱，以及这两者之间的重叠区域。
同时，为了使探针在特定的位点上高效识别目标序列，将荧光供体和荧光受体设计在同一核酸分子上的方法也被逐渐采用。
近年来，人们还尝试探讨FRET技术在一些特殊情况下的应用，如在离子和分子识别中。
在这些情况下，荧光供体和荧光受体的距离和重叠区域会受到离子和分子浓度的影响。
荧光共振能量转移技术的应用
荧光共振能量转移技术的应用荧光共振能量转移技术是一种基于分子间非辐射能量传递的原理的研究方法，被广泛应用于生物医学、化学和材料科学等领域。
本文将从基本原理、应用领域和未来发展方向等方面介绍荧光共振能量转移技术的应用。
一、基本原理荧光共振能量转移技术基于分子间的非辐射能量传递原理，通过能量传递的方式实现了荧光信号的转移。
在这种技术中，通常有两种分子参与，一种是受体分子，另一种是供体分子。
供体分子吸收外界激发光能后，通过非辐射能量传递的方式将能量传递给受体分子，使受体分子获得足够的能量从而产生荧光信号。
通过测量受体分子的荧光信号的强度和性质，可以间接地推断出供体分子的存在和性质。
这种技术在生物医学研究中被广泛应用于分子间相互作用的研究、分子结构的解析以及药物筛选等方面。
二、应用领域1. 药物筛选和疾病诊断荧光共振能量转移技术在药物筛选和疾病诊断中发挥着重要作用。
通过将荧光标记的供体分子和受体分子与待测药物或疾病标志物结合，可以通过监测荧光信号的变化来判断药物与受体的相互作用情况或疾病标志物的存在与浓度，从而实现药物筛选和疾病诊断的目的。
2. 分子间相互作用研究荧光共振能量转移技术可以用于研究分子间的相互作用，如蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA/RNA、蛋白质与小分子等之间的相互作用。
通过将荧光标记的供体分子和受体分子结合到待研究的分子上，可以通过监测荧光信号的强度和性质来推断分子间的相互作用方式和强度，从而深入了解分子间相互作用的机制。
3. 生物分子结构解析荧光共振能量转移技术在生物分子结构解析中也具有重要的应用价值。
通过将荧光标记的供体分子和受体分子结合到待测分子上，可以通过监测荧光信号的强度和性质来推断分子的构象和结构，从而解析生物分子的结构。
三、未来发展方向荧光共振能量转移技术在过去几十年取得了巨大的进展，但仍存在一些挑战和限制。
未来的发展方向主要包括以下几个方面：1. 提高检测灵敏度和分辨率：目前，荧光共振能量转移技术的检测灵敏度和分辨率还有待提高，可以通过改进荧光标记物的性能和开发新的检测方法来实现。
fret荧光共振能量转移荧光光谱
《探索fret荧光共振能量转移荧光光谱》1. 引言在当今科学研究领域中，fret荧光共振能量转移荧光光谱是一个备受关注的主题。
Fret是一种分子间作用，它在生物学和化学中具有重要意义，尤其是在研究蛋白质相互作用和细胞信号传导中扮演着重要角色。
本文将深入探讨fret荧光共振能量转移荧光光谱的原理、应用和意义。
2. 原理解析Fret荧光共振能量转移是指在两种染料分子之间发生跃迁过程，其中一个染料的激发态能量转移给另一个染料的基态。
这一过程需要两种染料之间距离在1-10纳米范围内，并且具有特定的距离和相对取向才能发生。
Fret的发生取决于两种染料之间的相互作用强度和距离，因此可以作为研究蛋白质相互作用以及分子构象变化的重要工具。
在光谱方面，fret荧光光谱通常表现为激发光谱的减弱以及受体的发射光谱的增强，这种光谱特征可以用来检测分子间的距离和相对取向变化，从而揭示分子间相互作用过程。
3. 应用探索Fret荧光共振能量转移荧光光谱在生物学和化学领域有着广泛的应用。
在生物学研究中，利用融合蛋白或荧光标记探针进行fret实验可以用来研究蛋白质间的相互作用、酶的结构和功能以及细胞信号转导过程。
在化学领域，fret技术也被广泛应用于检测分子构象的变化、药物筛选以及研究化学反应动力学过程。
fret荧光共振能量转移荧光光谱技术在生物医学、药物研发和化学领域具有重要的意义。
4. 意义总结通过对fret荧光共振能量转移荧光光谱的深入探索，我们不仅可以更好地理解分子之间的相互作用过程，还可以应用于生物学、化学以及药物研发等领域。
这种高分辨率的光谱技术为我们提供了一种全新的研究手段，可以帮助科学家们更好地理解分子结构和功能。
对于生命科学和化学领域的研究者来说，fret荧光共振能量转移荧光光谱技术的发展将会为他们的研究工作带来更多的可能性和机遇。
5. 个人观点在我看来，fret荧光共振能量转移荧光光谱技术是一种非常有前景和潜力的研究领域。
荧光共振能量转移技术名词解释
荧光共振能量转移技术名词解释荧光共振能量转移技术，这玩意儿听起来是不是有点像科幻电影里的高科技？别急，咱们就接地气地聊聊这个。
想象一下，你手里有个小灯泡，它亮不亮取决于旁边那个大灯泡。
现在，如果旁边那盏大灯泡能发出光，但自己不发光，而是通过一种神奇的方式，把光“借”给旁边的小灯泡，让它也亮起来，这就是荧光共振能量转移技术的精髓所在。
简单来说，就是两个光源之间发生了“能量交换”，一个光源（供体）把能量转移到另一个光源（受体）上。
这个过程就像是两个好朋友互相借东西，一个借了对方的东西，让自己的生活更美好。
在荧光共振能量转移技术中，供体和受体通常都是荧光染料。
当它们靠近时，就像老朋友一样，开始“交流”。
供体的荧光染料会把自己的能量传递给受体的荧光染料。
这个过程就像是你的朋友给你发了个红包，让你的生活变得更加丰富多彩。
但是，这种“能量转移”可不是随便发生的。
你得找个合适的位置，让两个光源之间的距离恰到好处，才能让能量顺利传递。
就好像你和你的朋友要找一个好地方聊天一样，位置很重要。
荧光共振能量转移技术还可以用于细胞成像、生物传感器等领域。
想象一下，如果你能通过一个小装置看到细胞内部的世界，那该多神奇啊！或者，如果你能通过一个传感器检测到细胞内的变化，那该多厉害啊！这些应用就像是你找到了一个宝藏，让你的生活变得更加有趣。
荧光共振能量转移技术就像是一场神奇的“能量转移秀”，让两个光源之间的能量得以传递，让生活变得更加精彩。
虽然听起来有点高科技，但实际上它离我们的生活并不遥远，它就在我们的日常生活中悄然发生。
所以，下次当你看到荧光共振能量转移技术的时候，不妨想想这个小故事，感受一下那种神奇的“能量转移”吧！。
荧光共振能量转移技术实验原理和步骤
荧光共振能量转移技术实验原理和步骤下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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化学实验知识：基于荧光共振能量转移的细胞成像实验方法
化学实验知识：“基于荧光共振能量转移的细胞成像实验方法”基于荧光共振能量转移的细胞成像实验方法荧光共振能量转移（FRET）是一种基于分子间能量转移的技术，用于研究分子的相互作用和结构。
FRET在生物医学实验中得到广泛应用，特别是在细胞成像方面。
本文将介绍基于FRET的细胞成像实验方法。
FRET技术的原理是基于两个荧光蛋白质之间的能量转移。
荧光蛋白质是一种带有荧光分子的蛋白质，能够在特定条件下自发发射荧光。
当两个荧光蛋白质中的一个吸收到激发光时，它会在短时间内发射能量更低的光，能量转移到另一个荧光蛋白质上，使其发射荧光。
这种技术只在相邻的分子之间起作用，因此非常适合用于研究细胞内蛋白质相互作用或结构变化。
FRET技术可以用来研究多种生物过程。
例如，它可以用于检测细胞内蛋白质的相互作用，或者检测蛋白质的构象变化。
另外，FRET也可以用于研究细胞内小分子的扩散和交换。
FRET技术的优势在于其高灵敏度和高分辨率。
由于该技术只在相邻分子之间发生，因此可以实现高分辨率图像。
此外，由于FRET技术不需要标记特定的分子，因此不会对模拟它们的生理过程产生影响。
这使得FRET技术成为一种非侵入性研究细胞过程的强大工具。
基于FRET技术的细胞成像实验可以通过单细胞成像或全细胞成像来完成。
单细胞成像通常使用荧光共振显微镜或其变种。
荧光共振显微镜可以通过多种方式实现，例如荧光共振能量转移显微镜（FRET显微镜），荧光纳米斑点（FNP）显微镜和双分子荧光互补技术。
在FRET显微镜中，激发光波长和荧光蛋白质之间的距离确定了能量转移的有效性。
如果两个荧光蛋白质太远，那么能量转移将是不完全的。
如果两者太接近，则会发生自发发光，而不是能量转移。
因此，需要精确控制激发光和荧光蛋白质之间的距离。
在FRET显微镜中，荧光蛋白质通常通过重组DNA技术与DNA序列相连。
荧光纳米斑点是另一种单细胞FRET成像技术。
在这种技术中，荧光蛋白质不仅作为信号分子，还作为定位分子。
荧光共振能量转移测量膜融合
揭秘细胞膜融合：荧光共振能量转移技术的
应用
细胞膜融合是细胞融合过程中非常关键的一步。
荧光共振能量转
移技术是一种可以测量细胞膜融合的强大工具。
那么，这种技术是如
何实现膜融合的测量的呢？本文将为大家揭秘这种技术的应用。
荧光共振能量转移技术是通过两种荧光染料之间的准确距离来测
量细胞膜融合的。
这种技术使用了一种叫做融合蛋白的分子。
这种分
子有能力让两个细胞膜彼此接近并发生融合。
当这种蛋白帮助两个细
胞膜实现融合后，荧光染料会开始发挥作用。
荧光染料中的第一个染料是荧光素。
这种染料是在先前的实验中
已经确认过了，它会发出红色光。
另一个荧光染料则是天青素。
这种
染料是在所有的染料中最常用的一种，它会发出蓝色光。
当融合蛋白
帮助两个细胞膜融合起来，荧光素与天青素的位置会非常接近。
这时，荧光素就会吸收天青素中的一个电子。
从这个过程中我们可以看到，荧光素从天青素中吸收一个电子后，它会变得激发并开始发出红色光。
这时，我们可以利用特殊的工具来
测量红色光发出的能量量。
也就是说，我们可以计算出两种荧光染料
之间的能量转移。
如果细胞膜融合成功，荧光素与天青素之间的能量
转移将会更加强烈。
因此，我们就可以通过测量这种能量转移来判断
细胞膜是否融合成功了。
总的来说，荧光共振能量转移技术是一种非常灵敏和精确的测量细胞膜融合的工具。
通过使用这种技术，我们可以更加深入地了解细胞膜融合的过程，这对于研究许多疾病的机制都具有非常重要的指导作用。
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FRET技术研究PEDF和目标蛋白之间在小鼠神经元（神经胶质细胞）的相互作用一、FRET技术基本原理荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。
FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。
能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。
作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件：①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。
人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。
（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。
最新的一些报道将发光量子点用于共振能量转移研究，克服了有机荧光染料的不足之处。
相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的光谱激发范围，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，可以最大限度地避免对能量受体的直接激发；通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射可见光区任一波长的光，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体，并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移效率。
）以GFP的两个突变体CFP（cyan fluorescent protein）、YFP（yellow fluorescent protein）为例简要说明其原理：CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。
两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比，对空间位置的改变非常灵敏。
例如要研究两种蛋白质a和b间的相互作用，可以根据FRET原理构建融合蛋白，这种融合蛋白由三部分组成：CFP（cyan fluorescent protein）、蛋白质b、YFP（yellow fluorescent protein）。
用CFP吸收波长433nm作为激发波长，实验灵巧设计，使当蛋白质a与b没有发生相互作用时，CFP与YFP相距很远不能发生荧光共振能量转移，因而检测到的是CFP的发射波长为476nm的荧光；但当蛋白质a与b发生相互作用时，由于蛋白质b受蛋白质a作用而发生构象变化，使CFP与YFP充分靠近发生荧光共振能量转移，此时检测到的就是YFP的发射波长为527nm的荧光。
将编码这种融合蛋白的基因通过转基因技术使其在细胞内表达，这样就可以在活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间的相互作用。
黄色荧光蛋白报告载体，如下图：青色荧光蛋白报告载体，如下图：一．质粒的选择及载体构建：订购：1.带有Sal I和Sac II两个酶切位点的小鼠PEDF过表达克隆质粒2.带有Kpn I和Xba I两个酶切位点的小鼠目标蛋白过表达克隆质粒3.pECFP．C1质粒4.pEYFP．C1质粒5. Sal I、Sac II、Kpn I、Xba I内切酶6.dna合成酶等二． PEDF核青色荧光蛋白（pECFP-C1）表达载体的构建及鉴定小鼠c57PEDF序列blst获得：1 atgcaggccc tggtgctact cctctggact ggagccctgc tcgggcacgg cagcagccag61 aacgtcccca gcagctctga gggctcccca gtcccggaca gcacgggcga gcccgtggag121 gaggaggacc ccttcttcaa ggtccctgtg aacaagctgg cagcagctgt ctccaacttc181 ggctacgatc tgtaccgcct gagatccagt gccagcccaa cgggcaacgt cctgctgtct241 ccactcagcg tggccacggc cctctctgcc ctttctctgg gagctgaaca tcgaacagag301 tctgtcattc accgggctct ctactacgac ctgatcacca accctgacat ccacagcacc361 tacaaggagc tccttgcctc tgttactgcc cctgagaaga acctcaagag tgcttccaga421 attgtgtttg agaggaaact tcgagtcaaa tccagctttg ttgcccctct ggagaagtcc481 tatgggacca ggccccggat cctcacgggc aaccctcgag tagaccttca ggagattaac541 aactgggtgc aggcccagat gaaagggaag attgcccggt ccacgaggga aatgcccagt601 gccctcagca tccttctcct tggcgtggct tacttcaagg ggcagtgggt aaccaagttt661 gactcgagaa agacgaccct ccaggatttt catttggacg aggacaggac cgtgagagtc721 cccatgatgt cagatcctaa ggccatctta cgatacggct tggactctga tctcaactgc781 aagattgccc agctgccctt gacaggaagt atgagcatca tcttcttcct gcccctgacc841 gtgacccaga acttgaccat gatagaagag agcctcacct ctgagttcat tcatgacatc901 gaccgagaac tgaagactat ccaagctgtg ctgactgtcc ccaagctgaa gctgagcttc961 gaaggcgaac ttaccaagtc tctgcaggac atgaagctac agtcgttgtt tgaatcaccc1021 gacttcagca agattactgg caaacccgtg aagctcaccc aagtggaaca cagggctgct1081 ttcgagtgga atgaagaggg ggcaggaagc agccccagcc caggcctcca gcccgtccgc1141 ctcaccttcc cgctagacta tcaccttaac caacctttcc tctttgttct gagggacacg1201 gacacggggg ccctcctctt cataggcaga atcctggacc ccagtagtac ttaa分别在上游引物序列的5’端和下游引物的5’分别加入Sal I和Sac II 两个酶切位点序列。
设计引物序列如下：Primer F：5、GTCGAC-atgcaggccctggtgctact-3、Primer R：5、CCGCGG-ttaagtactactggggtcca-3、其中GTCGAC为酶切位点Sal I，CCGCGG为酶切位点Sac II。
引物中未加入保护碱基。
具体构建质粒pECFP-C1-pedf步骤：1.pedf片段的pcr扩增，提取和纯化2.有文献报道利用一次中间载体topo载体的构建可以相对容易的将pedf构建到pECFP-C1中，不知道这个实验需要不需要做这一步？3.pECFP-C1质粒的扩增、提取和纯化4.pECFP-C1质粒的酶切5.pECFP-C1片段的去磷酸化用去磷酸化试剂盒Cloned AlkalinePhosphatase(CIAP)将pECFP-C1片段切口去磷酸化。
（不知道是不是必须做这一步）6.pECFP-C1酶切片段的纯化(~4．7kb)试剂盒(琼脂糖凝胶DNA／PCR产物小量回收试剂盒——TaKaR A：DV805A)1．2％琼脂糖凝胶回收的DNA量应大于200ng／ul7.pECFP-C1-pedf质粒的连接和转化8.pECFP-C1-pedf质粒的扩增、提取和纯化（菌液pcr）9.pECFP-C1-pedf质粒的鉴定（送公司测序）三．目标蛋白基因序列及引物设计：分别在上游引物序列的5’端和下游引物的5’分别加入Kpn I和Xba I 两个酶切位点序列。
设计引物序列如下：Primer F：5、ATGGTACC-。
-3、Primer R：5、ATTCTAGA- 。
-3、其中GTCGAC为酶切位点Kpn I，，CCGCGG为酶切位点点Xba I。
引物中5，端加入保护碱基AT。
pEYFP-C1-目标蛋白载体的构建与上述步骤类似。
四．阳性对照质粒pECFP-C1-YFP的构建及鉴定Primer F：5、-GTCGACATGGTGAGCAAG-3、Primer R：5、-CCGCGGTCTAGATCCGGTG-3、其中GTCGAC为Sal I酶切位点，CCGCGG为Sac II酶切位点。
载体具体构建过程与上述过程相同。
五．PEDF和目标蛋白在神经细胞（或胶质细胞）中的FRET研究1.神经细胞（或胶质细胞）的培养2.PEDF蛋白和目标蛋白在神经细胞（或胶质细胞）中的免疫荧光定位：将神经细胞（或胶质细胞）均匀种植在petri皿里，24h后待细胞贴壁。
PBS液洗细胞3次，再用4％多聚甲醛固定15min，PBS液洗3次。
用0.5％Triton穿孔15min，再用PBS洗3次每次5min。
然后用I％BSA封闭30min。
将petri皿小室内液体吸干净，加入用I％BSA按1：1000稀释好的PEDF和目标蛋白抗体，4℃过夜后，用PBS洗3次，加入二抗，37。
C孵育1h。
用PBS洗3次。
此过程注意避光。
加200ulFluo—Anti fading medium防止荧光淬灭，在共聚焦显微镜下观察。
3.荧光融合蛋白在神经细胞（或胶质细胞）中的表达：质粒转染48h后荧光显微镜下观察并拍照后，细胞提取总蛋白进行免疫蛋白印迹分析4.激光共聚焦显微镜检测FRET：利用脂质体法将pECFP-PEDF和pEYFP-目标蛋白共转染原代神经细胞。