线粒体16SrRNA和Cytb基因复合扩增进行种属鉴定
菌种鉴定的分子生物学方法
菌种鉴定的分子生物学方法——16S rDNA 测序鉴定菌种一． 原理细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5S rRNA 、16S rRNA 、23S rRNA 。
5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍，分析较困难。
而16S rRNA 相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16S rRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16S rDNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。
在细菌的16SrDNA 中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA 片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA 互补，而细菌的16S rDNA 可变区的差异可以用来区分不同的菌。
因此，16SrDNA 可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。
随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA 序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
二． 技术路线该方法包括细菌基因组DNA 提取、16S rDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
具体技术路线如下：三． 方法步骤（一）细菌基因组DNA 提取（酶解法）1. 挑取单菌落接种到10 mL LB 培养基中37℃振荡过夜培养。
细菌培养液基因组DNADNA 提取PCR 扩增16S rDNA 片段片段回收连接克隆载体阳性克隆鉴定 测序2. 取2 mL培养液到2 mLEP管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。
16S鉴定细菌的种属(PPT30页)
10、雨中黄叶树，灯下白头人。。07:17:1207:17:1207:173/4/2021 7:17:12 AM
11、以我独沈久，愧君相见频。。21.3.407:17:1207:17Mar-214-Mar-21
12、故人江海别，几度隔山川。。07:17:1207:17:1207:17Thursday, March 04, 2021
2μL 0.2 μL 2 μL 1 μL 0.5 μL 0.5 μL 13.8 μL
1min30s
判断16Sr DNA序列扩增是否成功:经琼脂糖凝胶电泳在1500 bp附近 出现条带，说明16s rDNA已经扩增成功。
9、静夜四无邻，荒居旧业贫。。21.3.421.3.4Thursday, March 04, 2021
守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类 生物亲缘关系的研究。 bp=base pair
图 16S rDNA基因组成（灰色为保守区，绿色为可变区）
16S rDNA基因全长1542 bp，由9个可变区和10个保守区组成。其中保守区反 映了生物物种间的亲缘关系，而可变区则表明物种间的差异，且变异程度与细 菌的系统发育密切相关。
14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏L。or2e0m21ip年su3m月d4o日lor星sit期am四et上, c午ons7e时ct1e7tu分r a1d2ip秒is0ci7n:g17e:l1it2. 2F1u.s3c.4e id urna blandit, eleifend nulla ac,
17、空山新雨后，天气晚来秋。。上午7时17分12秒上午7时17分07:17:1221.3.4
9、杨柳散和风，青山澹吾虑。。21.3.421.3.4Thursday, March 04, 2021
16SrDNA鉴定细菌的方法具体操作步骤与注意事项
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树试剂：1、培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
）。
2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。
3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。
4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
5、10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
室温保存。
用之前在65℃溶解。
配置时要戴口罩。
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。
用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
用16S rDNA方法鉴定细菌种属
用16S rDNA 方法鉴定细菌种属一、实验目的1. 掌握16S rDNA 对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA 提取、PCR 原理及方法、DNA 片段回收等实验操作。
二、实验原理细菌rRNA （核糖体RNA ）按沉降系数分为3种，分别为5S 、16S 和23S rRNA 。
16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA 相对应的DNA 序列，存在于所有细菌染色体基因中。
16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
16S rDNA 是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA 含量的80％），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。
在大多数原核生物中rDNA 都具有多个拷贝，5S 、16S 、23S rDNA 的拷贝数相同。
16S rDNA 由于大小适中，约1.5Kb 左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
16SrRNA 的编码基因是16SrDNA ，但是要直接将16SrRNA 提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase 降解，因而利用16S rDNA 鉴定细菌，其技术路线如下：细菌基因组的提取：PCR 的基本原理 ：PCR 技术的基本原理 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。
PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引 物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
16s核糖体rna作为菌种鉴定的原理和方法
16s核糖体rna作为菌种鉴定的原理和方法嘿，咱今儿就来聊聊 16s 核糖体 RNA 作为菌种鉴定那点事儿！你知道不，这 16s 核糖体 RNA 就像是每个菌种的独特身份证一样。
咱先说说原理哈，为啥它能用来鉴定菌种呢？这就好比每个人都有自己独特的长相和性格，菌种也有它们特有的特征呀！16s 核糖体RNA 在不同的菌种里可是有着不一样的序列呢，这就好比是它们的“基因密码”。
通过对这个“密码”的解读，咱就能分清谁是谁啦！那具体咋个鉴定法呢？这可就有讲究啦！就像警察破案得找线索一样，我们得先把菌种里的 16s 核糖体 RNA 给提取出来，这可是个精细活儿，得小心翼翼地操作，不然就把重要的“线索”给弄丢啦。
提取出来后，再用一些高科技的手段去分析它的序列。
这就好像给这个“身份证”做个详细的检查。
然后呢，把得到的序列和已知菌种的序列进行比对，这就像是在一个大数据库里找匹配的信息一样。
一旦找到了匹配的，那不就知道这个菌种是啥啦！这过程是不是挺神奇的？你想想啊，以前要鉴定一个菌种得多麻烦呀，得观察它的形态、生理特征啥的，还不一定能准确鉴定出来呢。
现在有了 16s 核糖体 RNA 这个法宝，就方便多啦！而且哦，这 16s 核糖体 RNA 鉴定菌种的方法还特别灵敏，哪怕只有一点点的菌种，也能给它鉴定出来，厉害吧！这就好比是在一堆沙子里找到那颗特别的小石子一样。
当然啦，这也不是说这个方法就完美无缺啦。
有时候也可能会出现一些小误差，就像人也会偶尔犯错一样。
但总体来说，它可是为我们研究菌种立下了大功呢！总之呢，16s 核糖体 RNA 作为菌种鉴定的原理和方法，那可是相当重要的。
它让我们对菌种的认识更加深入、准确。
以后咱再看到那些小小的微生物，可不能小瞧它们啦，说不定它们的“身份”可大有来头呢！这就是科学的魅力呀，能让我们发现那些隐藏在微小世界里的大秘密！你说是不是很有趣呢？。
16s rdna测序原理
16s rdna测序原理16S rDNA测序是一种常用的微生物多样性分析方法，通过对16S rDNA基因的测序和分析，可以揭示微生物群落的组成和结构，对环境微生物的研究具有重要意义。
本文将介绍16S rDNA测序的原理及相关内容。
1. 16S rDNA基因简介。
16S rDNA是细菌和古细菌的小亚基核糖体RNA基因，其序列在细菌中高度保守，但又存在一定的变异性，这使得16S rDNA成为研究微生物系统发育和分类的理想分子标记。
在细菌和古细菌中，16S rDNA一般由9个高度保守的区域（称为conserved region）和10个变异区域（称为variable region）组成，其中变异区域的序列差异较大，可用于微生物的分类和鉴定。
2. 16S rDNA测序原理。
16S rDNA测序的原理是通过PCR扩增获得16S rDNA基因片段，然后对扩增产物进行测序，最后对测序结果进行分析和解读。
首先，从样品中提取微生物DNA，然后利用通用或特异引物对16S rDNA基因进行PCR扩增，得到所需的16S rDNA片段。
接下来，对PCR产物进行纯化和测序，通常采用Sanger测序法或高通量测序技术（如Illumina、454、Ion Torrent等）。
最后，利用生物信息学方法对测序结果进行分析，包括序列比对、物种注释、多样性分析等。
3. 16S rDNA测序分析。
在16S rDNA测序分析中，首先需要对测序结果进行质控和过滤，去除低质量序列和引物污染，然后进行序列比对和物种注释。
序列比对是将测序结果与16S rDNA数据库进行比对，找到最佳匹配的参考序列，从而确定微生物的分类和系统发育关系。
物种注释是根据比对结果，将未知序列注释为已知的微生物分类单元，如属、种等。
此外，还可以进行多样性分析，如Alpha多样性指数（反映微生物群落的丰富度和多样性）、Beta多样性分析（比较不同样品间的微生物群落差异）等。
16SrRNA基因在细菌菌种鉴定中的应用
收稿日期： ２００６－ ０５－ １２； 作者简介： 都立辉（ １９８１－ ） ， 男， 硕士研究生， 主要从事食品微生物 方面的研究； 基金项目： 国家“８６３ 计划”课题资助（ ２００２ＡＡ２４８０４１） 。
出来， 利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种 的 细 菌 进 行 分 类 鉴 定 。 但 较 其 它 方 法 而 言 ， １６Ｓ ｒＲＮＡ 序列测定分析更适用于确定属及属以上分 类单位的亲缘关系。
表 １ 目前比较通用的几种 １６Ｓ ｒ ＲＮＡ 基因 ＰＣＲ 扩增引物
引物
序列（ ５’－ ３’）
ｆＤ１
ｃｃｇａａｔｔｃｇｔｃｇａｃａａｃＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＣ
ｆＤ２
ｃｃｇａａｔｔｃｇｔｃｇａｃａａｃＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＣ
ｆＤ３
ｃｃｇａａｔｔｃｇｔｃｇａｃａａｃＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＴＡＧ
２ １６Ｓ ｒ ＲＮＡ 在乳酸菌鉴定方面的研究进 展
近年来 Ｔ Ｙａｍａｍｏｔｏ 等设计和合成出人肠道 区系中常见的双歧杆菌属 ５ 个种（ 两歧双歧杆菌、 青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌和长双 歧杆菌） 的特异性的寡核苷酸探针， 它们具有 １６￣
１９ 个碱基长度， 并与这 ５ 个种的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 序列 互补。用天然高分子量的 ＲＮＡ 制备物作为靶子， 这些寡核苷酸探针对于人肠道中这些种的菌株具 有高度的种特异性， 结果表明用此法检测这 ５ 个 种的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 序列能取得所期望的结果， 并且 整个试验过程从获得纯细胞物后只需 ６ｈ 可完成。
菌群16s测序解读
菌群16s测序解读菌群16s测序，是一种广泛应用于微生物群落研究的技术。
通过对16s rRNA基因进行测序，并对其序列进行分析，可以对群落中存在的细菌进行分类和鉴定。
这项技术能够帮助我们了解细菌的多样性、丰度和功能，对于研究环境微生物群落结构、人体菌群与健康之间的关系等具有重要意义。
在进行菌群16s测序时，首先需要从样品中提取细菌的DNA，并进行PCR扩增。
常用的扩增方法是利用16s rRNA的保守序列设计引物，将目标序列扩增出来。
扩增后的DNA片段进一步纯化和测序，最终得到的测序数据即为16s rRNA的序列信息。
在得到16s测序数据后，需要对数据进行处理和解读。
首先是序列质量控制，去除低质量的序列。
接下来，对序列进行去噪声处理，去除PCR扩增产生的噪声和测序错误。
然后，利用聚类算法对序列进行分割，将相似的序列分为同一个OTU（操作分类单元）。
最后，通过比对数据库，将OTU与已知菌种进行分类和鉴定。
通过菌群16s测序，我们可以获得菌群的多样性指数。
多样性指数反映了菌群的物种丰富度和均一性。
常用的多样性指数包括Shannon指数、Simpson指数等。
这些指数能够告诉我们菌群内的物种多样性和优势菌种。
除了菌群的多样性，16s测序还可以帮助我们了解菌群的功能。
通过比对菌群16s测序数据和已知的功能基因数据库，我们可以推断菌群在代谢、信号传导、抗性等方面的功能。
这对于研究菌群与宿主的相互作用机制、菌群在环境中的重要功能等具有重要意义。
菌群16s测序的应用十分广泛。
在环境科学方面，可以通过菌群16s测序了解不同环境样品中细菌的组成和功能，帮助了解细菌在环境生物地球化学循环中的作用。
在医学研究中，菌群16s测序可以用于研究肠道菌群与人体健康之间的关系，探索微生物在疾病发生发展中的作用。
在食品安全检测中，通过菌群16s测序可以追踪食品中可能存在的致病菌，提供相关的病原菌检测和风险评估。
尽管菌群16s测序在微生物群落研究中具有广泛应用，但也存在一些限制。
16S鉴定细菌的种属
1525R 5' AAG GAG GTG WTC CAR CC 3'
试剂使用量（ 20μL体系）
模板DNA （10ng~100ng） 2μL Taq 酶(5U/μL) μL 10×Taq Buffer(Mg2+) dNTPs(2.5mM) μL 引物F(10 μM) μL 引物R(10 μM) μL
DNA的提取
挑取单菌落,然后置于装有100 μLPrepMan Ultra的离心管 中,涡旋震荡混匀30s左右，然后100℃水浴10min 后，以离 心机最大转速离心3min，取10μL上清液与490μL ddH2O （即稀释50 倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。提取 的DNA 于-20℃保存。
PCR 反应条件
0.2 2 μL
1 0.5 0.5
1min30s
判断16Sr DNA序列扩增是否成功:经琼脂糖凝胶电泳在1500 bp附 近出现条带，说明16s rDNA已经扩增成功。
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精品课件
精品课件
精品课件
精品课件
精品课件
利用16S rDNA鉴定细 菌的种属
精品课件
1.什么是 16S rDNA？ ➢ 16SrRNA为原核生物核糖体RNA的一个亚基，16SrDNA就是
编码该亚基的基因。 ➢ 原核生物的rRNA含有3种类型：23S、16S、5S rRNA，它们分
别含有2900、1540和120个核苷酸。
2.用16S rDNA进行细菌鉴定的原因 ➢ 16S rDNA在原核生物中普遍存在。 ➢ 16 S rDNA的相对分子量大小适中，约1500 bp，便于序列分
析。 ➢ 在16S rRNA分子中， 既含有高度保守的序列区域，又有中度
16SrRNA基因序列分析在原核生物种的分类中的应用
16S rRNA的系统发育分析
NCBI Blast： /
与数据库中已知细菌比较获得样品种属的信息，找到 同源性比较高的细菌。
通过LPSNhttp://www.bacterio.cict.fr/index.html 查找得到比对后同源性较高细菌的DNA序列。
再将得到的DNA序列输入MEGA软件进 行建树。
16S rRNA 基因序列分析技术的问题：
1、首先是数据库的完整性,尽管数据库收录的细菌 种类在不断增加, 但还会遇到不能确定的情况;早期 所测定的结果也不尽正确。
2、数据库中有些序列中还存在很多不清楚的位点。 其序列中存在着突变速度很快的“热点”区域和 高度保守的区域 , 因此其确切的进化速度目前还不 清楚。
16SrRNA基因序列分析
—物种鉴rRNA 基因序列是编码 rRNA 相对应的 DNA序 列，存在于所有原核生物的基因组中。
特征
在众多的生物系统发育相关性水平指标 中，16SrRNA 基因序列由于具有如下特征：
(1)
具有重要且恒定的生理功能； (2) 既含有高度保守的序列区域，又有中度保守 和高度变化的序列区域； (3) 基因序列长度适中； (4) 普遍存在于原核生物中且易于提取。
ＤＮＡ测序获得 １６ＳｒＤＮＡ序列
判断16SrＤＮＡ序列扩增是否成功：
经琼脂糖凝胶电泳在1500bp附近出现条带， 说明16s rDNA已经扩增成功.由于16s rDNA序列 长度一般1500bp左右。
DNA测序获得16SrRNA处理后得到的结果
GCATGCGGCGTGCTATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGA ACTGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCG CATGGTCCGAGTTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACC ATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGT AGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTA AAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGG TAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGG CTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAG ATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATT AGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAG CATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAAT TCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACA GGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGC ATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCT GGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGG ATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTT GTACACACCGCCCGTCACACCTGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAGGTGACAG AGATGG
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线粒体16SrRNA和Cytb基因复合扩增进行种属鉴定
叶懿;吴谨;罗海玻;王卓;李英碧
【摘要】目的建立一种用于种属鉴定的线粒体DNA16SrRNA基因和细胞色素b 基因荧光标记复合扩增检测体系.方法利用引物设计软件Primer 5.0对mtDNA序列的16SrRNA基因和细胞色素b基因各设计一对引物,建立复合扩增体系.分别扩增人和牛、猪、狗、鸡、草鱼5种常见动物.用310遗传分析仪对产物进行分析.结果人和5种动物DNA扩增产物均出现两个峰.Cytb通用引物的扩增产物为人与动物的共有峰,为358bp;16SrRNA基因的扩增产物为人与动物间存在位置差异的特异峰,位于231～256bp之间.结论该复合扩增体系可以明确区分人和5种动物样本.可用于种属鉴定.
【期刊名称】《法医学杂志》
【年(卷),期】2008(024)004
【总页数】4页(P259-261,后插1)
【关键词】法医遗传学;生物学鉴定法;基因扩增;DNA,线粒体;基因,16SrRNA;基因,细胞色素b
【作者】叶懿;吴谨;罗海玻;王卓;李英碧
【作者单位】四川大学华西基础医学与法医学院物证教研室,四川,成都,610041;四川大学华西基础医学与法医学院物证教研室,四川,成都,610041;四川大学华西基础医学与法医学院物证教研室,四川,成都,610041;四川大学华西基础医学与法医学院物证教研室,四川,成都,610041;四川大学华西基础医学与法医学院物证教研室,四川,成都,610041
【正文语种】中文
【中图分类】DF795.2
在涉及动物交通事故、偷猎等案件时，有时需要鉴定检材的种属来源。
线粒体DNA(mtDNA)16SrRNA基因是线粒体非编码基因，变异较大，适合于遗传多样性、种属鉴定和亲缘关系的研究[1]，也有许多学者对mtDNA细胞色素b(Cytb)
基因进行序列分析，确定种属来源[2-4]。
本研究以线粒体16SrRNA和Cytb基因为目的基因，采用两对引物对人和5种动物的mtDNA进行PCR复合扩增，扩增产物经310遗传分析仪检测，根据16SrRNA基因扩增片段长度多态性进行种属
鉴定。
1.1 样本采集
取健康成年男性、女性新鲜外周血各20例，EDTA抗凝；动物样本包括牛、猪、狗、鸡、草鱼5种常见动物肌肉组织或者血液各20例。
1.2 引物设计
根据动物的NC序列号[5]，在NCBI基因数据库中查找获取人和牛、猪、狗、鸡、草鱼的线粒体DNA序列。
用引物设计软件Primer 5.0根据核心片段两端相似序
列设计引物。
本实验选取人和动物共有的Cytb基因作为阳性参照序列[2]，并进行荧光标记。
两对引物的序列如下：
16SrRNA：正向引物5’-CGAGAAGACCCTATGGAGCTTT-3’；反向引物5’-FAM-GGATTGCGCTGTTATCCCTA-3’。
Cytb：正向引物5’-FAM-CCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3’；反向引物5’-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3’。
1.3 DNA提取
Chelex-100法提取血痕、肌肉DNA。
1.4 PCR反应体系
总体积25μL，含1mmol/L dNTP 3.3μL，10×PCR Buffer缓冲液（无MgCl2）2.5 μL，10 μmol/L 16SrRNA引物各0.2 μL，Cytb引物各1.3 μL，25mmol/L MgCl21.5 μL，2.5 U/μL Taq聚合酶0.4 μL,模板DNA 5 μL（空白对照加
ddH2O)，H2O 9.3μL。
扩增循环条件为：94℃5 min，94℃30 s，52℃30 s，72℃45 s，29个循环，最后72℃20min。
1.5 扩增产物检测
扩增产物通过310遗传分析仪进行毛细管电泳,用Collection收集软件收集电泳信息,然后用基因扫描软件Genescan3.1分析扩增片段的大小。
将人和动物扩增产物混合构建动物分型标准物，用基因型分析软件Genotyper 3.7NT检测基因型。
1.6 扩增产物测序分析
人、牛、猪、狗、鸡、草鱼的扩增产物各1例，由上海英俊生物技术有限公司进行双向测序分析。
2.1 人和5种动物16SrRNA基因序列比对结果
应用序列同源分析工具Clustalw对人和5种动物的线粒体16SrRNA基因进行比对，发现有一段序列存在长度差异，比对结果见图1。
2.2 人和5种动物16SrRNA和Cytb复合扩增检测结果
用310遗传分析仪对荧光标记复合扩增产物进行分析，人和动物外周血DNA的扩增产物都出现两个峰，峰形对称尖锐，无双尖峰（图2）。
右侧的峰为人和动物共有峰，大小为358 bp；左侧的峰为人和动物存在差异特异峰，在231～256 bp 之间（图3，见S1）。
同一种属的20例个体，未见明显差异。
测序结果显示人、牛、狗、鸡、草鱼扩增所得目的序列与NCBI上提供的序列相同，猪的序列存在一个碱基变化：G→A。
由于分子生物学技术的发展，种属鉴定进入了DNA分析的时代。
mtDNA位于细
胞核外，拷贝数约为核DNA的1000倍，其编码区在同种动物内具有遗传稳定性。
王闯等[6]复合扩增mtDNA D环HVⅠ、HVⅡ片段和Cytb片段，根据聚丙烯酰
胺电泳条带的数目区分人和10多种动物。
田力等[7]复合扩增mtDNA的
16srRNA和ND4基因，根据310电泳峰数目区分人和14种动物。
但这些研究
都只限于区分检材的人类与非人类来源，不能判断出动物的种类。
Parson等[3]对Cytb基因扩增片段测序，分析序列同源性区分了44个脊椎动物，但是测序较为
耗时、复杂，在实际应用中受到限制。
本研究通过对人、牛、猪、狗、鸡、草鱼mtDNA全序列比对，发现人和5种动
物16SrRNA基因的一段序列存在长度差异，至少相差1bp，以这段序列为核心片段设计引物，加入Cytb基因通用引物做阳性对照，构建复合扩增体系。
扩增产物经310电泳，根据特异峰的位置可进行种属鉴定。
该方法不需要对扩增产物进行
测序分析，能够自动判断出动物的种类，灵敏度高，可用于已降解、陈旧及混合的检材。
但本研究中的动物种类仅包括常见家畜，对于其他动物种类还需要进一步的研究。
【相关文献】
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