免疫原和抗血清的制备
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免疫原和抗血清的制备
4.亲和层析：
• 利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间
的具有的专一性亲和力而设计的层析技术。 eg：Ag和Ab，酶和酶的抑制剂，酶
蛋白和辅酶，激素和激素受体等其之间有特殊亲 和力，可紧密结合成复合物. 1）亲和层析支持物的选择：
常用：琼脂糖珠（Sepharose 2B、4B、6B）
稀酸、稀碱、浓盐、加温等）时又可将抗原抗体解离。如果将抗原或抗体 固定在不溶性的载体上能从液相中专一性分出抗体或抗原。
• 根据这一原理，将可溶性抗原（或抗体）用化学方法偶联到不溶性载体上，
当将相应的抗血清（或抗原）按层析方法加入柱中，抗血清中的相应的抗 体与抗原特异性结合。其他蛋白成分随洗脱液流出。再改变缓冲液的PH 值和离子强度，则可以使抗体和偶联在载体上的Ag解离（加入解脱剂）， 经洗脱，从而得到纯化的Ab。
免疫原和抗血清的制备
免疫原和抗血清的制备
第一节免疫原的制备
•
免疫原是能够引起机体产生抗体，并能与之发生反 应的物质
• 一、颗粒性抗原的制备： • 1.颗粒抗原指细胞抗原或细菌抗原。
2.细菌抗原：
• H抗原 有动力的菌株 O抗原 100℃ 2-2.5h 为
了 破坏H抗原，获得O抗原Vi抗原
• 3.虫卵、细胞膜颗粒抗原呈乳浊状，多用V内免疫，较
免疫原和抗血清的制备
2）配体的选择：
• 抗原或抗体与支持物的结合：
步骤： （1）活化支持物上的功能基团
溴化氰PH11 与支持物上的羟基形成氨基甲酸酯基团 （2）交联（联接） （3）清洗：除去未结合的pro （4）亲和层析条件的选择：
• 原理：在一定条件下，Ag和Ab能可逆性地结合成复合物，当条件改变
微生物
室温
（5）溶菌酶法：一定PH（PH8.0），溶菌酶可专一破坏菌胞。蜗牛
酶，纤维素酶消化细菌和组织cell
（6）表面活性剂处理法
免疫原和抗血清的制备
蛋白质抗原的制备和纯化：
可溶性抗原绝大部分为蛋白质
1.超速离心和梯度密度离心法： 用来分离亚细胞部分及大分子蛋白质
1）差速离心：高低速交替进行。将大分子物质分离 2）梯度密度离心：区带分离法，通过梯度密度来维持重 力的稳定性，通常分离的悬液中的颗粒比液体重，要使之 上浮，必须加入第三种成份，其密度连续或不连续升高， 即所谓梯度 3）第三种成份多用甘油、蔗糖氯化色，氯化铷 适合于少部分大分子抗原，对于大量的中、小分子量的蛋 白质抗原不适用此法
免疫原和抗血清的制备
2.细胞抗原的制备：
•
细胞抗原 细胞膜蛋白抗原
细胞浆抗原
细胞核及核膜抗原
粉碎：
（1）反复冻融法
（2）冷热交替法：适合细菌，病毒蛋白质及核酸
（3）超声破碎法：适合于微生物和组织细胞
Βιβλιοθήκη Baidu
细菌，尤其真菌厚膜孢子难破坏
（4）自溶法：利用组织和微生物的自身酶系
需一定PH和温度动物组织cell 0-4℃
免疫原和抗血清的制备
3.凝胶过滤和离子交换层析：
•
1）分析筛层析又名凝胶过滤，将Ag分成大、中、小三种 大分子较快出来，小分子因被阻留，出来较慢。根据分
子量不同 2）离子交换层析：离用带离子基因的纤维素 流动相逐步增加离子强度，蛋白质按电荷不同或量的差
异分组常用DEAE纤维素（二乙基氨基乙基纤维素） 根据pro携带电荷不同（溶液中等电点不同） 常用于分离IgM 因为IgM分子量大 凝胶过滤洗脱曲线
免疫原和抗血清的制备
• 2）配体的选择：
3）抗原或抗体与支持物的结合： 步骤：
（1）活化支持物上的功能基因 溴化氛PH11 与支持物上的羟基形成氨基形成氨基甲酸酯基因
（2）交联（联接） （3）清洗：除去未结合的pro （4）亲和层析条件的选择：
• 原理：一定条件下，Ag和Ab能可逆性地结合成复合物，当条件改变（如
（如稀酸、稀碱、浓盐、加温等）时又可将抗原抗体解离。如果将抗 原或抗体固定在不溶性的载体上就能从液相中专一性地 分出抗体或抗原。根据这一原理，将可溶性抗原（或抗体）用化学方 法偶联到不溶性载体上，当将相应的抗血清（或抗原）按层析方法加 入柱中，抗血清中的相应的抗体与抗原特异性结合。其他蛋白成分随 洗脱液流出。再改变缓冲液的PH值和离子强度，则可以使抗体和偶联 在载体上的Ag解离（加入解脱剂），经洗脱，从而得到纯化的Ab。
免疫原和抗血清的制备
2.选择性沉淀法：
• 用沉淀剂或改变某些条件促使抗原成分沉淀
1）核酸除去法： （1）提取沉淀剂： （2）核糖核酸酶降解法：用DNA或RNA酶与提取液
作用30-60min（4℃），即可除去核酸 2）盐析沉淀法：
（1）抗原的粗筛 33-50％饱和度的硫酸铵 （2）提取丙种球蛋白 主要为IgG 33-40％饱和 度的硫酸铵 （3）抗原的浓缩 3）有机溶剂沉淀法： 有机溶剂多为酒精和丙酮 4）水溶性非离子型聚合物沉淀法： PEG+蛋白质颗粒→沉淀、复合物、蛋白质发生水的 重分配分子量2000-6000PEG可用于沉淀蛋白PEG浓度不同可沉淀不同 pro3-4％沉淀免疫复合物6-7％沉淀IgM 8-12％沉淀IgG 12-15%沉 淀其他球蛋白 25％沉淀白蛋白
免疫原和抗血清的制备
以免疫亲和层析为例 （三）免疫球蛋白片段的制备：
• 1）温和 分离亚单位：
（1）改变PH值 PH＜3或＞10，Ig亚单位自动解离 （2）利用强度性剂
适合载脂蛋白Ag和胶原肽的提取 2）二硫键的解离：
适合于将轻、重链分开 3）溴化氰裂解法：
与蛋白质中的甲硫氨酸侧链的硫醚基起反应，生成溴化亚氨内酯 4）酶法裂解：
木瓜酶 将IgG分解为Fc和Fab（×2）三个片段 胃蛋白酶 IgG分解为（Fab）2和几个小肽段 胰蛋白酶 IgG切成不规则肽链 应用：木瓜酶切断，得Fc段，制备抗重链血清 胃蛋白酶切取，得F（ab）2，用于诊断（用Ab鉴别Ag）
少用佐剂作皮内注射
免疫原和抗血清的制备
二、可溶性抗原的制备：
组织和细胞粗抗原的制备：
1.组织和细胞混合抗原的制备： 组织匀浆制备： 标本要求：新鲜或低温（＜-40℃）保存的去除表面包膜或
结缔组织或一些大血管，脏器应进行 灌注，除去血管内残留 血液
制备 处理好组织→0.05％NaN3生理盐水洗净→剪成小块 粉碎→高速组织捣碎机法→2000-3000rpm离心10min 研磨法：玻璃匀浆器,乳钵研磨 →上清 10000-20000rpm 20-30min高速离心
4.亲和层析：
• 利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子间
的具有的专一性亲和力而设计的层析技术。 eg：Ag和Ab，酶和酶的抑制剂，酶
蛋白和辅酶，激素和激素受体等其之间有特殊亲 和力，可紧密结合成复合物. 1）亲和层析支持物的选择：
常用：琼脂糖珠（Sepharose 2B、4B、6B）
稀酸、稀碱、浓盐、加温等）时又可将抗原抗体解离。如果将抗原或抗体 固定在不溶性的载体上能从液相中专一性分出抗体或抗原。
• 根据这一原理，将可溶性抗原（或抗体）用化学方法偶联到不溶性载体上，
当将相应的抗血清（或抗原）按层析方法加入柱中，抗血清中的相应的抗 体与抗原特异性结合。其他蛋白成分随洗脱液流出。再改变缓冲液的PH 值和离子强度，则可以使抗体和偶联在载体上的Ag解离（加入解脱剂）， 经洗脱，从而得到纯化的Ab。
免疫原和抗血清的制备
免疫原和抗血清的制备
第一节免疫原的制备
•
免疫原是能够引起机体产生抗体，并能与之发生反 应的物质
• 一、颗粒性抗原的制备： • 1.颗粒抗原指细胞抗原或细菌抗原。
2.细菌抗原：
• H抗原 有动力的菌株 O抗原 100℃ 2-2.5h 为
了 破坏H抗原，获得O抗原Vi抗原
• 3.虫卵、细胞膜颗粒抗原呈乳浊状，多用V内免疫，较
免疫原和抗血清的制备
2）配体的选择：
• 抗原或抗体与支持物的结合：
步骤： （1）活化支持物上的功能基团
溴化氰PH11 与支持物上的羟基形成氨基甲酸酯基团 （2）交联（联接） （3）清洗：除去未结合的pro （4）亲和层析条件的选择：
• 原理：在一定条件下，Ag和Ab能可逆性地结合成复合物，当条件改变
微生物
室温
（5）溶菌酶法：一定PH（PH8.0），溶菌酶可专一破坏菌胞。蜗牛
酶，纤维素酶消化细菌和组织cell
（6）表面活性剂处理法
免疫原和抗血清的制备
蛋白质抗原的制备和纯化：
可溶性抗原绝大部分为蛋白质
1.超速离心和梯度密度离心法： 用来分离亚细胞部分及大分子蛋白质
1）差速离心：高低速交替进行。将大分子物质分离 2）梯度密度离心：区带分离法，通过梯度密度来维持重 力的稳定性，通常分离的悬液中的颗粒比液体重，要使之 上浮，必须加入第三种成份，其密度连续或不连续升高， 即所谓梯度 3）第三种成份多用甘油、蔗糖氯化色，氯化铷 适合于少部分大分子抗原，对于大量的中、小分子量的蛋 白质抗原不适用此法
免疫原和抗血清的制备
2.细胞抗原的制备：
•
细胞抗原 细胞膜蛋白抗原
细胞浆抗原
细胞核及核膜抗原
粉碎：
（1）反复冻融法
（2）冷热交替法：适合细菌，病毒蛋白质及核酸
（3）超声破碎法：适合于微生物和组织细胞
Βιβλιοθήκη Baidu
细菌，尤其真菌厚膜孢子难破坏
（4）自溶法：利用组织和微生物的自身酶系
需一定PH和温度动物组织cell 0-4℃
免疫原和抗血清的制备
3.凝胶过滤和离子交换层析：
•
1）分析筛层析又名凝胶过滤，将Ag分成大、中、小三种 大分子较快出来，小分子因被阻留，出来较慢。根据分
子量不同 2）离子交换层析：离用带离子基因的纤维素 流动相逐步增加离子强度，蛋白质按电荷不同或量的差
异分组常用DEAE纤维素（二乙基氨基乙基纤维素） 根据pro携带电荷不同（溶液中等电点不同） 常用于分离IgM 因为IgM分子量大 凝胶过滤洗脱曲线
免疫原和抗血清的制备
• 2）配体的选择：
3）抗原或抗体与支持物的结合： 步骤：
（1）活化支持物上的功能基因 溴化氛PH11 与支持物上的羟基形成氨基形成氨基甲酸酯基因
（2）交联（联接） （3）清洗：除去未结合的pro （4）亲和层析条件的选择：
• 原理：一定条件下，Ag和Ab能可逆性地结合成复合物，当条件改变（如
（如稀酸、稀碱、浓盐、加温等）时又可将抗原抗体解离。如果将抗 原或抗体固定在不溶性的载体上就能从液相中专一性地 分出抗体或抗原。根据这一原理，将可溶性抗原（或抗体）用化学方 法偶联到不溶性载体上，当将相应的抗血清（或抗原）按层析方法加 入柱中，抗血清中的相应的抗体与抗原特异性结合。其他蛋白成分随 洗脱液流出。再改变缓冲液的PH值和离子强度，则可以使抗体和偶联 在载体上的Ag解离（加入解脱剂），经洗脱，从而得到纯化的Ab。
免疫原和抗血清的制备
2.选择性沉淀法：
• 用沉淀剂或改变某些条件促使抗原成分沉淀
1）核酸除去法： （1）提取沉淀剂： （2）核糖核酸酶降解法：用DNA或RNA酶与提取液
作用30-60min（4℃），即可除去核酸 2）盐析沉淀法：
（1）抗原的粗筛 33-50％饱和度的硫酸铵 （2）提取丙种球蛋白 主要为IgG 33-40％饱和 度的硫酸铵 （3）抗原的浓缩 3）有机溶剂沉淀法： 有机溶剂多为酒精和丙酮 4）水溶性非离子型聚合物沉淀法： PEG+蛋白质颗粒→沉淀、复合物、蛋白质发生水的 重分配分子量2000-6000PEG可用于沉淀蛋白PEG浓度不同可沉淀不同 pro3-4％沉淀免疫复合物6-7％沉淀IgM 8-12％沉淀IgG 12-15%沉 淀其他球蛋白 25％沉淀白蛋白
免疫原和抗血清的制备
以免疫亲和层析为例 （三）免疫球蛋白片段的制备：
• 1）温和 分离亚单位：
（1）改变PH值 PH＜3或＞10，Ig亚单位自动解离 （2）利用强度性剂
适合载脂蛋白Ag和胶原肽的提取 2）二硫键的解离：
适合于将轻、重链分开 3）溴化氰裂解法：
与蛋白质中的甲硫氨酸侧链的硫醚基起反应，生成溴化亚氨内酯 4）酶法裂解：
木瓜酶 将IgG分解为Fc和Fab（×2）三个片段 胃蛋白酶 IgG分解为（Fab）2和几个小肽段 胰蛋白酶 IgG切成不规则肽链 应用：木瓜酶切断，得Fc段，制备抗重链血清 胃蛋白酶切取，得F（ab）2，用于诊断（用Ab鉴别Ag）
少用佐剂作皮内注射
免疫原和抗血清的制备
二、可溶性抗原的制备：
组织和细胞粗抗原的制备：
1.组织和细胞混合抗原的制备： 组织匀浆制备： 标本要求：新鲜或低温（＜-40℃）保存的去除表面包膜或
结缔组织或一些大血管，脏器应进行 灌注，除去血管内残留 血液
制备 处理好组织→0.05％NaN3生理盐水洗净→剪成小块 粉碎→高速组织捣碎机法→2000-3000rpm离心10min 研磨法：玻璃匀浆器,乳钵研磨 →上清 10000-20000rpm 20-30min高速离心