第三章固定化酶反
固定化酶和固定化细胞ppt课件
❖（3）溴化氰法 即用溴化氰将含有羟基的载体，如 纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚 氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联， 制成固定化酶。
❖ 任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。
22
❖（4）烷基化和芳基化法 以卤素为功能团的载体 可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷 基化或芳基化反应而使酶固定化。
❖ （4）其他：半胱氨酸残基的巯基；丝氨酸、苏氨酸和酪 氨酸残基的羟基；组氨酸残基的咪唑基；色氨酸残基的吲 哚基。
❖ 酶共价偶联的载体的功能基团：芳香氨基、羟基、羧 基和羧甲基等。
18
载体活化的主要反应 ❖ 重氮法 ❖ 叠氮法 ❖ 溴化氰法 ❖ 芳香烃化法
19
❖（1）重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体 的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法， 是共价键法中使用最多的一种。
14
❖ （1）凝胶包埋法 ▪ 将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合 促进剂(包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包 埋在聚合物中以达到固定化。 ▪ 凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉 菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以 及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成 凝胶或树脂。
15
❖ （2）微胶囊包埋法 ▪ 微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半 透膜微胶囊内的方法。它使酶存在于类似细胞 内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外 的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常 用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋 酸纤维素等。
❖ 常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸 的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。
20
❖（2）叠氮法 即载体活化生成叠氮化合物，再与 酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。
高中生物第三章酶的应用技术实践第二节固定化酶的制备和应用学案苏教版选修1
⾼中⽣物第三章酶的应⽤技术实践第⼆节固定化酶的制备和应⽤学案苏教版选修1第⼆节固定化酶的制备和应⽤学习导航明⽬标、知重点难点固定化酶和固定化细胞的应⽤。
(重点)固定化酶与固定化细胞的制备⽅法。
(难点)[学⽣⽤书P43]⼀、阅读教材P63分析固定化酶1．概念：是指⽤物理学或化学的⽅法将酶与固相载体结合在⼀起形成的仍具有酶活性的酶复合物。
2．优点：在催化反应中，它以固相状态作⽤于底物，反应完成后容易与⽔溶性反应物和产物分离，可被反复使⽤，且保持了酶的催化性能，可实现酶促反应的连续化和⾃动化。
3．制备固定化酶的常⽤⽅法⽬前，制备固定化酶的⽅法主要有物理吸附法、化学结合法、包埋法等。
⼆、阅读教材P64～65分析固定化细胞技术的应⽤1．应⽤：固定化细胞可以取代游离的细胞进⾏发酵，⽣产各种物质。
2．优点(1)固定化细胞技术⽆须进⾏酶的分离和纯化，减少了酶的活⼒损失，同时⼤⼤降低了⽣产成本。
(2)固定化细胞不仅可以作为单⼀的酶发挥作⽤，⽽且可以利⽤细胞中所含的复合酶系完成⼀系列的催化反应。
(3)对于活细胞来说，保持了酶的原始状态，酶的稳定性更⾼。
(4)细胞⽣长停滞时间短，反应快等。
3．缺点(1)固定化细胞只能⽤于⽣产细胞外酶和其他能够分泌到细胞外的产物。
(2)由于载体的影响，营养物质和产物的扩散受到⼀定限制。
(3)在好氧性发酵中，溶解氧的传递和输送成为关键的限制因素。
4．酵母菌细胞的固定化技术的主要流程准备各种实验药品和器材↓制备麦芽汁↓活化酵母菌细胞↓配制物质的量浓度为0.05 mol/L的氯化钙溶液↓制备固定化细胞↓浸泡凝胶珠，⽤蒸馏⽔洗涤↓发酵麦芽汁判⼀判(1)酶在催化时会发⽣变化，不可反复利⽤。
(×)(2)某种固定化酶的优势在于能催化⼀系列⽣化反应。
(×)(3)固定化细胞所固定的酶都在细胞外起作⽤。
(×)(4)制备固定化细胞的⽅法主要有包埋法、化学结合法和物理吸附法。
(×)连⼀连固定化酶技术[学⽣⽤书P44]由于酶的分离与提纯有许多技术性难题，造成酶制剂来源有限、成本⾼、不利于⼤规模使⽤。
高中生物第3章酶的制备及应用第4节酶的固定化教案中图版
第四节酶的固定化一、固定化酶1．含义通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与不溶性的载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应。
2．方法(1)共价键结合法：通过化学反应将酶以共价键结合到尼龙等载体上。
(2)包埋法：将酶包埋到多孔性凝胶中的固定化方法。
(3)物理吸附法。
3．优点(1)固定化酶的活性稳定，可反复使用；(2)固定化酶能与反应液分开，制品较易纯化；(3)工业化生产可实现大批量、连续化、自动化；(4)极大地降低了生产成本。
4．缺点需要制备纯净的酶，稍有不慎，酶就会失活。
二、固定化细胞1．含义用适当的载体将合成酶的细胞固定起来。
2．优点比固定化酶更简捷，使用寿命更长。
三、木瓜蛋白酶的固定化操作技术取尼龙布浸入等体积的CaCl2溶液和甲醇溶液中10 s左右―→盐酸溶液中室温下水解45 min―→蒸馏水冲洗至中性―→室温下放入戊二醛溶液中浸泡20 min―→磷酸缓冲液(pH 为7.8)反复洗涤―→木瓜蛋白酶溶液中固定3.5 h，温度为4_℃―→用NaCl溶液洗去多余的蛋白酶。
预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中一、酶、固定化酶与固定化细胞的比较①固定化细胞使用的都是活细胞，因此应提供一定的营养物质。
②固定化细胞由于保证了细胞的完整性，因而酶的环境改变较小，酶活性受外界影响也较小。
二、固定化酶的制备及利用1．酶的固定化：(1)18.6%的CaCl2溶液和甲醇溶液处理(10 s)，冲洗、吸干。
(2)3.65 mol/L的盐酸水解(45 min)，蒸馏水冲洗至中性。
(3)在5%的戊二醛溶液中浸泡(20 min)。
(4)0.1 mol/L的磷酸缓冲液洗涤，(多次)吸干。
(5)放1 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液中(4 ℃处理3.5 h)。
↓2．检验酶的活性：(1)用固定化酶在适宜温度下分解蛋白质(10 min)(2)用双缩脲试剂检验↓3．酶的再利用：用取出的固定化酶再分解蛋白质请参照细胞固定化技术的相关基础知识，完成下列问题。
3.3制备和应用固定化酶
一.固定化酶的应用实例
我们以高果糖浆的生产为例来了解固定化酶技术在生产实践中 的应用。高果糖浆的生产需要使用葡萄糖异构
酶，它能将葡萄糖转化成果糖。这种酶的稳 定性好，可以持续发挥作用。但是，酶溶解 于葡萄糖溶液后，就无法从糖浆中回收，造 成很大的浪费。
思考： 如果你是工程技术人员，如何解决这一缺点？
一.固定化酶的应用实例
问5、这种方法的优点是什么？
5优点是： （1）使酶既能与反应 物接触，又能与产物 分离； （2）固定在载体上的 没可以被反复利用。 反应柱能连续使用半 年，大大降低了生产 成本，提高果糖的产 量和质量。
问： 在生产实际中使用固定化酶技术有无不足？ 如有不足，怎么办? 有。一种酶只能催化一种化学反应，而在生 产实际中很多产物的形成都通过一系列的酶促反 应才能进行，所以操作比较麻烦。 可采用固定化细胞技术。
2.固定化酶的优点：既保持了酶的催化特性 ____________, 又具有____________________ 的优点。 反复使用
1．下面是制备固定化酵母细胞的步骤，正确的是 D ①配制CaCl2溶液 ②海藻酸钠溶化 ③海藻酸钠与酵 母细胞混合 ④酵母细胞活化 ⑤固定化酵母细胞 A. ①②③④⑤ B．④①③②⑤ C．④⑤②①③ D．④①②③⑤ 2． 下列图形依次表示包埋法、交联法、吸附法和包埋法 的一组是
问2：面对这些实际问题，你有什么设想？
将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接 触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被 反复利用。
现代的固定化酶技术已完全实现了这一设想。ห้องสมุดไป่ตู้
高果糖浆的生产就是固定化酶技术成功地应 用于工业生产的实例。
问3：酶是活细胞产生的，据此我们可以怎样 改进和创新？
固定化酶
Eschericia coli β-galactosidase
二硫苏糖醇DTT
Approaches to enzyme immobilization, irreversible methods.
赖氨酸 半胱氨酸 天冬氨酸和谷氨酸
凝胶、纤维膜 明胶、琼脂、琼脂糖、聚 丙烯酰胺、光交联树脂、 海藻酸钠
酶的固定化方法
制备固定化酶的方法有很多，一般分为三大类： 1. 载体结合法： 物理吸附法、离子结合法和共价结合法 2. 交联法 3. 包埋法 凝胶包埋法、微胶囊法
Approaches to enzyme immobilization, reversible methods.
活性炭、氧化铝、硅藻土、 多孔陶瓷、硅胶、羟基磷 灰石、大孔合成树脂 DEAE-纤维素、DEAE-葡 聚糖凝胶、Amerlite IRA-93等阴离子交换剂和 CM-纤维素、Amerlite CG-50、Dowex-50等阳 离子交换剂
包埋在高分子半透膜中 几微米到几百微米 胶囊和脂质体 硝酸纤维素、聚苯乙烯、 聚甲基丙烯酸甲酯等
双功能试剂或多功能试剂 戊二醛、乙二胺、顺丁烯 二酸酐等
酶的固定化方法
固定化方法
物理吸附法
载体结合法 离子结合法
共价结合法
交联法
包埋法
制备难易 结合程度 酶活回收率 对底物专一性
再生 固定化成本
易 弱 高，但酶易流 失 不变 可能 低
异麦芽糖
固定化酶在食品工业的应用
6. 在油脂改性中的应用 • 尼龙和纤维素酯固定脂酶对巴西棕榈油进行酶解
改性制备代可可脂 • 固定化酶用于催化酸解鳕鱼肝油制备富含多不饱
和脂肪酸的结构脂、改造猪油制备功能性脂 7. 在食品分析与检测中的应用 • 固定化酶多酶生物传感器用于乳制品中乳糖以及
反应器章节总结名词解释
复习题选择题（每小题2分，共16分）1．一简单酶催化反应，若初始酶浓度CE0=0.01mmol/L, 酶催化最大反应速率是0.197mmol/L.h,则产物生成速率常数是多少？( A )A 19.7h-1B 9.5h-1C 2.7h-1D 18.2h-12．有一均相酶反应，当底物的初始浓度CE0=1χ10-5mmol/L，若反应进行一段时间后，此时的底物浓度为0.9χ10-5mmol/L,则底物转化率为多少？( D )A.20%B.12%C.15%D. 10%3．某酶的Km值为2.0χ10-5mol/L，如果rmax值为4.0χ10-5mol/(L.min)，在底物浓度为1χ10-4mol/L和在竞争性抑制剂浓度为2χ10-4mol/L情况下，假定KI为2χ10-4mol/L，其反应速率为多少？（2.86×10的-5次方）A．2.0χ10-5mol/(L.min)B．1.43χ10-5mol/(L.min)C．1.43χ10-4mol/(L.min) D．2.0χ10-4mol/(L.min)4．一简单酶催化反应的反应速率为6.0χ10-5m ol/(L.min)，当有抑制剂时的反应速率变为1.5χ10-5m ol/(L.min)，问其抑制程度有多大？（0.75 ）A．2.0 B．0.2 C．0.25 D．0.55.某酶催化的反应速率为1.5χ10-5mol/(L.min)，当此酶固定于无微孔的球形载体上进行同类反应时，反应速率变为1.2χ10-5mol/(L.min)，该固定化酶的扩散有效因子是多少？（A ）A0.8 B 1.0C0.75D0.56．固定于无微孔的球形载体上的酶促反应,假定其外扩散传质速率为1.0χ10-6m ol/(L.min),则在定态条件下的反应速率为（B）A．2.0χ10-5mol/(L.min)B．1.0χ10-6mol/(L.min)C．2.0χ10-6mol/(L.min)D．1.2χ10-6mol/(L.min)7．某微生物反应的动力学方程为，则KS为（B）A 1.2B 2C 1.8D 2.58. 在甘露醇中培养大肠杆菌,当甘露醇溶液以1.5L/min的流量进入体积为5L的CSTR中进行反应时,稀释率为（D ）.A．0.4min-1 B．1.4min-1 C．5min-1 D．0.3min-1填空题（每小题2分，共20分）1、假定CSTR中进行等温均相反应，反应器有效体积恒定不变，其基本设计方程为流入速率=流出速率+反应消耗速率+累积量，则对底物S的物料衡算表达式为dCsVr————=F（Cso-Cs）-VrTsdt2、酶或细胞的固定化方法有载体结合法、自聚焦法、包埋法。
高三生物固定化酶知识点
高三生物固定化酶知识点生物固定化酶是一种将酶固定在载体上的技术，被广泛应用于生物工程和工业生产中。
通过固定化酶，可以提高酶的稳定性、重复使用和操作性，以达到更高的产量和效率。
本文将从固定化酶的原理、方法和应用领域等方面进行探讨。
一、固定化酶的原理固定化酶的原理是将酶通过化学交联、吸附或共价键结合等方法与载体材料结合，形成酶固定化的复合物。
这种复合物在特定条件下可以实现酶的固定化，成为一种高效的酶催化系统。
固定化酶的原理主要基于两个方面：一是通过酶与载体的物理或化学结合，增强酶的稳定性，延长其半衰期；二是通过载体的特性改变酶的反应环境，提高酶的催化效率。
二、固定化酶的方法固定化酶的方法主要分为三类：物理吸附法、化学固定法和共价固定法。
物理吸附法是将酶与载体通过静电相互吸引力、疏水效应或表面张力等物理力作用结合在一起。
这种方法简单易行，但不稳定，酶容易从载体上脱落。
化学固定法是利用肽键或二硫键等化学键的形成，使酶与载体牢固地结合在一起。
这种方法稳定性较高，但需要进行特定的化学修饰和反应条件控制。
共价固定法是通过酶分子上的特定官能团与粘接剂反应，形成共价键结合。
这种方法稳定性最高，但操作较为繁琐。
三、固定化酶的应用领域固定化酶广泛应用于医药、食品、环境工程等领域。
在医药领域，固定化酶可以用于酶替代治疗，例如胰岛素固定化酶用于糖尿病治疗。
此外，固定化酶还可以用于制备药物中间体和药物合成等过程中，提高反应效率和纯度。
在食品领域，固定化酶可以用于食品加工和酿造过程中的酶催化反应。
例如，酶固定化技术可以用于啤酒生产中的淀粉糖化、果汁酶解和乳酸酶发酵等工艺。
固定化酶可以提高生产效率和产品质量。
在环境工程领域，固定化酶可以用于废水处理、大气污染物降解和土壤修复等方面。
通过固定化酶技术，可以降低酶的使用成本和环境污染，同时提高反应效率和降解效果。
结语生物固定化酶是一项重要的生物工程技术，通过固定化酶可以提高酶的稳定性、重复使用和操作性。
第三章 生物敏感元件的固定化
第三章 生物敏感元件的固定化
3.2 基本方法
（6）微胶囊法：脂质体
第三章 生物敏感元件的固定化
3.3 LB膜技术
LB膜基本敏感元件的固定化
3.5 固定化生物活性材料的性质
固定化酶的稳定性：1）2）3）
固定化酶的动力学常数
3.2 基本方法
（3）包埋：多样，失活小，影响因素多
将酶用物理的方法包埋在各种 载体（高聚物）内。分为： 网格型：将酶包埋在高分子凝胶 细微网格中。 微囊型：将酶包埋在高分子半透 膜中。
第三章 生物敏感元件的固定化
包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，
与其它固定化方法相比： 优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改 变酶的高级结构，酶活回收率高。 缺点：只适合作用于小分子底物的酶。
1)固相载体上的静电场影响带电荷的底物分布
2）底物扩散影响酶促反应的速度
第三章 生物敏感元件的固定化
3.2 基本方法
（4）共价键结合 ：
借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的 功能基团进行偶联。 偶联成功与否取决于： 载体：功能基团：芳香氨基，羧基，羧甲基等。 酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯基，羟基，酚基，咪 唑基。
第三章 生物敏感元件的固定化
优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落， 可连续使用。 缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构 象而影响酶的催化活性。
3.2 基本方法
第三章 生物敏感元件的固定化
3.2 基本方法
（1）夹心法：简单，固定量大
第三章 生物敏感元件的固定化
3.2 基本方法
（2）吸附：依据带电的酶或细胞和载体之间的
静电作用，使酶吸附于惰性固体的表面或离
子交换剂上。
固定化酶ppt课件
60
酶固定化方法选择依据：
（1） 酶的性质 （2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择
61
四、辅酶固定化
原因
有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化 反应
有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生 有机辅因子价格昂贵
——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生
•可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游 离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键
•常用载体：天然高分子、人工合成的高聚 物、无机载体
29
共价键结合法制备固定化酶的“通式”
1. 载体上引进活泼基团 2. 活化该活泼基团 3. 此活泼基团再与酶分子上某一基团形
成共价键
30
25
优点： 固定化时酶分子的构象很少
或基本不发生变化。
缺点： 结合力弱，易解吸附。
载体： 纤维素、琼脂糖、活性炭、
沸石及硅胶等。
26
II 离子结合法
酶分子与含有离子交换基团的固相载 体相结合
第一个离子结合法固定化酶： DEAE — Cellulose 固定化过氧化氢酶
第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
=6*106IU
2.酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的 酶活力单位
17
固定化酶的指标：
1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的
酶活力单位。 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、
酶板）。
2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需 要的时间（t1/2）
固定化酶PPT参考幻灯片
LOGO
新型酶固定化方法
原则：实现在较为温和的条件下进行酶的固定化，
尽量减少或避免酶活力的损失。
辐射
Mohy等以137Cs为辐 射源 ，通过γ-射线引 发将甲基丙烯酸甲酯接 枝共聚于尼龙 膜袭面 ， 经进一步活化， 用 于青霉素酰化酶的固定
光偶联
以光敏性单体聚合物包 埋固定化酶或带光敏 性基团的载体共价固定 化酶， 由于条件温和 ， 可获得酶 活力较高 的固定化酶。
▪ 其主要反应为：
▪ 即在H R P的作用下，氧化剂 (H202)将酚氧化，产生了活性高的苯 氧自由基等中间物，它们从酶的活性中心扩散到溶液各处，与酚 分子或苯氧自由基本身发生反应，生成了一系列的聚合物。这些 聚合物具有高相对分子质量和低水溶性的特性，因而易从溶液中 分离。
16
LOGO
例：磁性固定化酶处理含酚废水的研究
LOGO
固定化酶及其应用研究
1
LOGO
目录
1
固定化酶简介
2
固定化酶的制备
3
固定化酶的应用
4
展望
2
LOGO
固定化酶的意义
天然酶的优缺点
酶的化学本质是 蛋白质。 其催化 作用具有高选择 性 、 高催化活 性、 反应 条件 温和、 环保无污 染等特点。
游离状态的酶对 热 、强酸、强碱 、高离子强度 、 有机溶剂等稳定 性较差， 易失活 ， 并且反应后混 入催化产物等 物 质， 纯化困难， 不能重复使用。
3
生物传感器和环境保 护中： 固定化葡萄糖氧化酶 传感器、青霉素电极 等。 将辣根过氧化酶大量 吸附在磁石上，可以 对水中的氯酚选择性 吸附。
15
LOGO
例：磁性固定化酶处理含酚废水的研究