常压室温等离子体诱变（ARTP）及高通量筛选高产蛋白酶米曲霉的初探
ARTP诱变及高效筛选高产葡萄糖氧化酶菌株
ARTP诱变及高效筛选高产葡萄糖氧化酶菌株肖成建;陈楠;江慰;罗玮;王强;李汉广;余晓斌【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2016(035)005【摘要】以黑曲霉为出发菌株,采用常压室温等离子体(ARTP)注入技术对前培养后的出发菌株进行诱变,并结合改进后的邻联茴香胺高效平板显色圈进行初筛及摇瓶复筛.获得一株产葡萄糖氧化酶高产菌株,其产量由出发菌的45.6 U/mL提高到85.3 U/mL.通过对发酵关键条件碳酸钙和吐温-80添加量进行优化,结果显示酶活提高到125.6 U/mL,较原始菌株提高了175.4％.经6代传代培养,产葡萄糖氧化酶性能稳定.【总页数】6页(P525-530)【作者】肖成建;陈楠;江慰;罗玮;王强;李汉广;余晓斌【作者单位】江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;江南大学食品学院,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122;江南大学生物工程学院,江苏无锡214122【正文语种】中文【中图分类】Q814【相关文献】1.ARTP诱变选育葡萄糖氧化酶高产菌株及发酵条件优化 [J], 范新蕾;肖成建;顾秋亚;罗玮;余晓斌2.递推式ARTP-UV复合诱变筛选高产β-葡萄糖苷酶菌株 [J], 夏俊芳;王小灵;古丽娜孜;韩贵林;武运3.ARTP诱变结合抗性筛选选育西索米星高产菌株 [J], 郑明坤;黄家滨;李友明;李芹;王靓;张建华4.ARTP诱变选育γ-聚谷氨酸高产菌株快速筛选方法的建立 [J], 刘丹丹;臧毅鹏;王利;王梦梦;岳文瑾;余晨锐;陈俊柳;聂光军5.ARTP诱变选育γ-聚谷氨酸高产菌株快速筛选方法的建立 [J], 刘丹丹;臧毅鹏;王利;王梦梦;岳文瑾;余晨锐;陈俊柳;聂光军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
常压室温等离子体(artp)生物诱变育种的原理与应用
常压室温等离子体(artp)生物诱变育种的原理与应用常压室温等离子体(artp)生物诱变育种的原理与应用1. 原理常压室温等离子体(artp)是在常温、大气压下通过载气离子化形成的等离子体。
artp技术通过氧化性离子和自由基对DNA等生物分子进行了较均匀、高效的DNA损伤，从而诱发菌株基因突变。
其原理与传统的紫外线、X射线等诱变剂相似，但其辐射范围更大，诱变效率可达传统技术的数十倍。
2. 应用artp生物诱变育种技术广泛应用于农业、食品制造等领域中，以提高菌株的菌落数量和产量。
其主要应用场景包括：- 用于增强大肠杆菌、野生菌等微生物的生长性能。
- 用于提高益生菌的产量和生长时间。
- 用于改善食品质量，如通过诱变技术改善酒类的风味。
- 用于改善化妆品和医药领域，如改善乳酸菌对皮肤的整体效果和治疗感染。
3. 优势与传统的紫外线、X射线等诱变技术相比，artp技术的优势在于：- 显著提高了诱变效率，能够同时诱变多个基因。
- 更加高效、均匀地对DNA进行诱变，生成更具特异性的基因组变化。
- 不需要封闭环境，节约了部分成本和操作难度。
- 因为不需要靶向特定编码位点，其应用范围更广泛。
4. 不足虽然artp诱变技术的应用具有广泛的发展前景，但是也有其不足之处：- 对菌体形态和生长的影响需要进一步研究。
- 诱变所得的基因可能会因兼性缺陷或副作用等原因从菌株中丢失。
- 不适用于人体育种领域，因为其可能对健康产生潜在的安全问题。
综上所述，artp诱变技术在生物诱变育种中的应用发展前景广阔，同时也需要在基础研究和实践中加强应用和风险把控。
ARTP诱变选育高温蛋白酶高产菌株及其酶学性质研究的开题报告
ARTP诱变选育高温蛋白酶高产菌株及其酶学性质研究的开题报告【开题报告】题目：ARTP诱变选育高温蛋白酶高产菌株及其酶学性质研究一、研究背景和意义蛋白酶是生物体内一种广泛存在的酶类，能够水解蛋白质为多肽、氨基酸或其它小分子化合物，扮演着重要的生物学功能。
高温蛋白酶是一类能够在高温环境下保持活性的蛋白酶，具有较高的热稳定性和耐酸碱性。
高温蛋白酶被广泛应用于食品、制浆造纸、洗涤剂、制药和生化分析等领域。
因此，寻找高效高产高温蛋白酶的菌株，对于改善工业生产、加速生物技术的发展，有着巨大的经济和社会意义。
二、研究内容和方案本研究拟采用ARTP（气相辐射）诱变技术改良产高温蛋白酶菌株。
ARTP诱变是一种目前应用最广泛的微生物基因组突变技术，具有快速、高效率和较好的安全性等优点。
本研究将以Bacillus subtilis为实验菌株，通过ARTP诱变得到高温蛋白酶高产菌株，并对其酶学性质进行初步研究，包括酶活力、比活力、热稳定性和耐酸碱性等指标的测定。
方案：1.菌株选择和酶学性质分析：选取Bacillus subtilis作为研究菌株，对其酶学性质进行分析，包括酶活力、比活力、热稳定性和耐酸碱性等指标的测定。
2.ARTP诱变: 将Bacillus subtilis菌株进行ARTP诱变处理，通过比较菌株在不同放射剂量下的幸存率和酶活力等指标，筛选出高产高温蛋白酶的菌株。
3.酶学性质验证:对ARTP诱变得到的高产高温蛋白酶菌株进行酶学性质分析，比较其与野生型菌株的差异，确认是否成功选育出高温蛋白酶高产菌株。
三、预期研究结果本研究拟通过ARTP诱变方法，筛选出高产高温蛋白酶的Bacillus subtilis菌株，并对其酶学性质进行深入分析。
预期能获得下列研究结果：1.确定Bacillus subtilis较为适合用于高温蛋白酶的生产；2.成功选育出高产高温蛋白酶的Bacillus subtilis菌株；3.明确高产菌株的酶学性质变化，如比活力、热稳定性和耐酸碱性等指标的提高，为进一步研究高温蛋白酶的生产提供技术支持和理论指导。
常压室温等离子体诱变选育木聚糖酶高产菌及其酶学性质研究
木聚糖酶是一种重要的半纤维素水解酶系，能将木聚糖降解为木寡糖和木糖[1]，已被用于生物燃料乙醇、食品、医药以及动物饲料等领域[2-3]。
PARAB P等[4]利用芽孢杆菌（sp.）产生的木聚糖酶酶解海藻，得到可发酵的还原糖；DHIMAN S S等[5]利用嗜热脂肪芽孢杆菌（）所产木聚糖酶处理柑橘果汁，通过降解其中果胶、淀粉和半纤维素等大分子多糖，获得了高度澄清的柑橘果汁；KHAMBHATY Y等[6]将木聚糖酶用于纸浆预处理，能有效提高纸浆的白度。
木聚糖酶来源广泛，有微生物、甲壳动物、植物、昆虫、种子等。
其中微生物主要包括真菌（如黑曲霉、烟曲霉、米曲霉、木霉、青霉等）、细菌（如地衣芽孢杆菌、黄热芽孢杆菌、嗜热双胞菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌等）和放线菌[7-9]。
一般认为微生物是生产商品木聚糖酶的最佳来源之一[10]。
郑丽丽等[11]从土壤中筛得一株黑曲霉，其所产木聚糖酶酶活为78.34U/mL；KUMAR V等[12]从废弃木材中筛得野生菌疏棉状嗜热霉菌，其所产木聚糖酶酶活为61.09U/mL；吴仁智等[13]从土壤中筛得野生日本曲霉菌，其所产木聚糖酶酶活为26.26U/mL。
由于野生菌所产木聚糖酶酶活较低，而对工业化生产而言，木聚糖酶酶活高不仅能提高生产效率、亦能有效节约能源[14]，因此可采用一些方法提高野生菌的产酶能力，诱变育种是其中一种有效方法。
常压室温等离子体（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）技术是近些年发展起来的一种新型微生物诱变育种方法，ARTP富含的活性粒子可以改变细胞壁和细胞膜的物理化学性质，并造成组织损伤和遗传物质损伤，微生物细胞被迫启动容错水平高的“SOS修复机制”、出现较多错误倾向修复，引起微生物的基因突变[15-16]。
ARTP诱变技术具有突变率高、成本低、环境友好等优点[17]，已成为诱变领域的研究热点。
常压室温等离子体诱变选育木聚糖酶高产菌及其酶学性质研究朱慧霞1,方桢1,鲁旭峰1,汪水玲1,马晓静1,姚日生1,2*(1.合肥工业大学食品与生物工程学院,安徽合肥230009;2.农产品生物化工教育部工程研究中心,安徽合肥230009)摘要：利用常压室温等离子体（ARTP）技术对黑曲霉（）FXY进行诱变处理，并对菌株的遗传稳定性及所产木聚糖酶的酶学性质进行了研究。
常压室温等离子诱变选育微生物的研究进展
农产品加工
No.6
2021年6月
Farm Products Processing
Jun.
文章编号：1671-9646（2021） 06a-0097-03
常压室温等离子诱变选育微生物的研究进展
徐礼生，于巧玲，张兴桃，蒋变玲，李婷婷
（宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州234000）
摘要：常压室温等离子体诱变技术在选育微生物领域应用广泛，与传统化学诱变和物理诱变相比，具有无污染、突
变速度快、易人工控制等优点。围绕细菌、真菌、酵母及微藻等方面研究常压室温等离子体诱变技术的应用，诱变
菌株具有遗传稳定、产量高等特点，实际工业应用中提高经济效益。通过对常压室温等离子体诱变技术进行系统分
[4] Christoph Ottenheim， Margarete Nawrath，Jinchuan Wu.
2021年第6期
徐礼生，等：常压室温等离子诱变选育微生物的研究进展
-99 -
Microbial mutagenesis by atmospheric and room -tempera ture plasma (ARTP) : The lastest development [J] . Bioresour. Bioprocess， 2018 (12): 2-14. [5] 林晓琼，孙旸，陈光，等.常压室温等离子体快速诱变 筛选高产纤维素酶生产菌株[J].吉林农业大学学报， 2016，38 (5) : 543-547. [6] 陈双喜，张二超，张乐乐，等.Y-聚谷氨酸生产菌株的 常压室温等离子体诱变选育[J].中国医药工业杂志， 2015，46 (9) : 951-963. [7] 蔡莹瀛，夏苗苗，董会娜，等常压室温等离子体(ARTP) 诱变及高通量筛选维生素B12高产菌株[J].天津科技大 学学报， 2018 (33): 21-26. [8] 袁红梅，薛正莲，杨心萍.常压室温等离子体和紫外诱 变选育腺苷高产菌[J].发酵科技通讯，2019, 48(2):
常压室温等离子体生物诱变育种及其应用研究进展
常压室温等离子体生物诱变育种及其应用研究进展张雪;张晓菲;王立言;张翀;陈韵亿;常海波;李和平;邢新会【摘要】Radio-frequency atmospheric pressure glow discharge (RF APGD) plasmas have outstanding features of no need of expensive and complicated vacuum system, low gas temperatures, high concentrations of reactive species, good discharge uniformity, strong controllability and diverse interactions with various biomolecules, which have attracted more and more attentions for their applications in biotechnology. Our research group introduced the RF APGD plasma jet into the mutation breeding field. Based on the study on the physical characteristics of RF APGD plasmas and their interaction mechanisms with bio-macromolecules and whole cells, a novel mutation breeding system, named as atmospheric and room temperature plasma (ARTP) mutation breeding machine was invented. The ARTP mutation breeding system has the features of high safety for the operators and environment, easy operation, rapid mutation capability, high mutation rate and genetic stability of targeted mutants,as demonstratedby successful mutation for more than 40 different microbes including bacteria, fungi and algae. This paper reviews the recent research progressof ARTP mutation breeding technology, hopefully contributing to the development of the life evolution study and the industrial strain modification as a powerful mutation tool.%大气压射频辉光放电（RF APGD）等离子体具有大气压下操作不需要真空系统、气体温度低、活性粒子浓度高、放电均匀性好、可控性强等特点，能够与各类生物分子发生作用，在生物技术中的应用受到广泛的关注。
常压室温等离子体结合紫外诱变筛选红霉素高产菌株
常压室温等离子体结合紫外诱变筛选红霉素高产菌株沈小静;张萍;石彦鹏【摘要】利用常压室温等离子体射流诱变（ ARTP ）和紫外照射对红霉素产生菌进行复合诱变，得到4株产量明显提高的突变菌株，4株菌的平均发酵效价较出发菌株提高25．2％；其中一株（12＃菌株）经发酵摇瓶验证，红霉素发酵单位可达10029单位／mL，比出发菌株提高了28．6％，且遗传稳定性良好。
实验证明ARTP－UV复合诱变是一种简单高效的筛选方法。
%Atmospheric and room temperature plasma( ARTP )-UV composite mutagenesis were adopted to treat with erythromycin-producing strain,four high-efficient producing strains were obtained by screening,which was increased in fermentation potency by 25. 2% over the original strain. The mutant 12# with genetic stability was obtained. Its yield of erythromycin was 10029 U/mL, 28.6% higher than the original strain. ARTP-UV composite mutation was a simple and efficient method for screening.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】5页(P19-23)【关键词】红霉素;常压室温等离子体;紫外;复合诱变;遗传稳定性【作者】沈小静;张萍;石彦鹏【作者单位】宁夏泰瑞制药股份有限公司，银川750101;宁夏泰瑞制药股份有限公司，银川750101;宁夏泰瑞制药股份有限公司，银川750101【正文语种】中文【中图分类】S859.796红霉素（erythromycin，Er）是由红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea，也称糖多孢红霉菌）合成的次生代谢产物，为一类大环内酯类抗生素。
常压室温等离子体诱变选育春雷霉素高产菌株
常压室温等离子体诱变选育春雷霉素高产菌株作者：高嫚妮潘忠成杨玉旺杨宏勃陈豪翁婧李蒲民来源：《绿色科技》2019年第24期摘要：采用常压室温等离子体对春雷霉素生产菌株小金色链霉菌（ Streptomyces mlcroaureus） 203#进行诱变育种，采用不同时间等离子体照射诱变，再经过琼脂块筛选、摇瓶初筛和复筛，获得2株春雷霉素高产菌株，摇瓶效价分别为5012 μg/mL和4034 μg/mL，相比原始出发菌株203的效价提高了147%和98%。
关键词：小金色链霉菌;效价;诱变选育;春雷霉素;常压室温等离子体中图分类号：TQ455.5文献标识码：A文章编号：16 74-9944（ 2019） 24-0001-041 引言近年来，随着人们环保意识的加强，生物农药逐渐走人人们的视野。
其专一性强，活性高，安全环保，不易产生残留和抗药性，对我国农业避免药害、合理用药、减缓病害抗药性、提高防治效果、减少农药残留有着重要意义。
春雷霉素不仅能防治水稻稻瘟病[1]，对番茄叶霉病[2，3]、黄瓜细菌性角斑病[4，5]、白菜软腐病[6]等也具有抗菌作用。
春雷霉素作为高效、广谱、低毒、无公害的生物农药，被农业部列为无公害农产品生产推荐农药，展示了越来越光明的市场前景。
春雷霉素是属于氨基糖苷类抗生素，其产生菌为小金色链霉菌。
菌种的高产和发酵工艺的优化关系到一个发酵行业的灵魂，能获得一株高产、稳定、适应性好的菌株，将会大大缩短产业化的路程。
采用等离子体诱变和紫外照射诱变是目前常采用的有效诱变手段，以此来筛选抗生素高产菌株已广泛用于菌株选育程序中[7]。
多杀菌素产生菌经过紫外诱变，筛选高产菌株已有研究报道[8]。
汪晨等[9]以谷氨酸棒杆菌作为原始出发菌株，通过常压室温等离子体诱变技术，确定高产琥珀酸等离子体诱变的物理参数和最佳诱变条件，筛选得到具备良好的产琥珀酸与有机酸的能力的诱变菌。
蔡聪等[1O]为进一步提高凝结芽孢杆菌发酵木糖生产L一乳酸的产量和转化率，以实验室保存的一株能利用木糖产L一乳酸的野生型凝结芽孢杆菌菌株NLOI 为出发菌株，通过等离子体诱变育种技术和平板菌落初筛、摇瓶复筛，最终得到一株木糖耐受力强、L一乳酸产量高、遗传特性稳定的正向突变菌株NL- CC- 17。
surfactin高产菌株的等离子体诱变及其高通量筛选
surfactin高产菌株的等离子体诱变及其高通量筛选李光;唐小玲;韦璇;朱学亮;张勇;张乐乐;陈双喜【摘要】利用常压室温等离子体(atmospheric pressure and room temperature plasma,ARTP)方法对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis E7进行快速诱变,筛选表面活性素(surfactin)高产菌株.采用表观初筛,溶血圈初筛,孔板复筛,多功能酶标仪检测,摇瓶验证相结合的方法提高了筛选通量,加快了筛选进程,构建了高通量诱变筛选surfactin高产菌株的体系,并使用高效液相(high performance liquid chromatography,HPLC)检测方法对产物进行检测.优化处理时间为220 s,获得了遗传稳定的突变菌株Bacillus subtillus SF90-5,其产surfactin能力提高到约0.8 g/L,是原始菌株的5倍.ARTP诱变技术结合高通量筛选体系极大程度减少了工作量,提高了筛选通量,加快了筛选进度,并快速获得了目的菌株,为脂肽类表面活性剂进一步的工艺研究提供了基础.%In this study,ARTP(atmospheric pressure and room temperature plasma,ARTP) method was used to obtain rapid mutagenesis of Bacillus subtilis E7 in atmospheric pressure and room temperature,to screen strain with high yield of surfactin.Several methods such as appearance screening,determination of diameter of hemolytic circle,culture in Microflask,detection by multifunctional enzyme standard detector,and shake flask test were combined to improve screening throughput and speed up screening process.A high-throughput screening system for mutant strain with high yield of surfactin was preliminarily built.High performance liquid chromatography (HPLC) was used to detect target product.After mutagenesis for 220 s,Bacillus subtillus strain SF90-5 with good genetic stability was obtained.Its surfactin yield increased to 0.8g/L,which was 5 times of that of the original strain.Mutagenesis with ARTP resulted inreduced workload,effectively increased screening flux,and accelerated screening process.Desired target strain was obtained fleetly.This experiment provided a foundation for study of strain with high yield of surfactin.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2017(043)002【总页数】6页(P67-72)【关键词】surfactin;常压室温等离子体;枯草芽孢杆菌;高通量【作者】李光;唐小玲;韦璇;朱学亮;张勇;张乐乐;陈双喜【作者单位】河南大学生命科学学院,河南开封,475000;河南大学生命科学学院,河南开封,475000;沈阳师范大学生命科学学院,辽宁沈阳,110000;河南大学生命科学学院,河南开封,475000;无锡源清天木生物科技有限公司,江苏无锡,214000;无锡源清天木生物科技有限公司,江苏无锡,214000;河南大学生命科学学院,河南开封,475000【正文语种】中文脂肽类生物表面活性剂是一种由肽链和脂肪酸链组成的两性分子，其一端为多个氨基酸组成的亲水基肽链，另一端为亲油基脂肪烃链。
常压常温等离子体(ARTP)诱变选育顶头孢霉高产菌
常压常温等离子体(ARTP)诱变选育顶头孢霉高产菌李英英;杭海峰;庄英萍;储炬【摘要】目的获得高产的工业微生物产生菌.方法采用ARTP诱变的方式来获得头孢菌素C的高产突变株.通过对突变菌株采用混合培养筛选与高通量生物检测相结合的高效筛选方法.结果最终选育获得高产菌株G6.与出发菌株W-6相比,G6在摇瓶中产头孢菌素C的能力提高了19.75％.结论 ARTP诱变方法是一种高效的头孢菌素C高产菌株选育方法.其正突变几率高,可有效提高菌株的头孢菌素C产量.%Objective To improve microbial strains for the high-production of industrial products.Methods In this paper,in order to obtain a cephalosporin C (CPC) high-yield stain,atmospheric and room temperature plasma (ARTP) was employed to generatethe mutants.In this study,all the mutants were given the equal screening chance by a mixture culture method combined with a high-throughput screening bioassay.Results The high-yield mixture strain G6 was successfully screened out and the CPC titer was nearly 19.75％,higher than that of the parental strain W-6 in the shake flask.Conclusion This work provides an appropriate strategy for obtaining high CPC-yield strains by using ARTP random mutation methods with an efficient screening assay.The ARTP random mutation method has a high positive mutation rate and the yield of cephalosporin C is significantly increased.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2017(042)011【总页数】6页(P945-950)【关键词】头孢菌素C;ARTP;菌株选育;发酵【作者】李英英;杭海峰;庄英萍;储炬【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237【正文语种】中文【中图分类】R978.1;Q939.97顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum)是一种重要的用于工业生产头孢菌素C(cephalosporin C, CPC)的丝状真菌，其发酵产物头孢菌素C属于β-内酰胺类抗生素，可以经化学法或头孢菌素C酰化酶一步酶法直接将头孢菌素转化为7-氨基头孢烷酸(7-ACA)[1]，是一系列半合成头孢菌素类抗生素的重要生产原料。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
常压室温等离子体诱变（ARTP）及高通量筛选高产蛋白酶米曲霉的初探舒冬梅;王德良;宋绪磊;尚柯【摘要】为提高酱油发酵菌种米曲霉的蛋白酶活力，采用实验室保藏菌种 H0米曲霉为诱变出发菌株，对H0菌株进行常压室温等离子体诱变（ARTP），诱变条件：功率120 W；气流量10 L／min；10个时间梯度处理。
结果表明：当诱变时间为140 s时，致死率接近90％，此时为最佳诱变时间。
利用大豆球蛋白作为选择培养基关键因子进行初筛和96孔板高通量复筛，选出3株高蛋白酶活力菌株H5，H12，H15，并且经过福林酚法验证。
最终筛选出米曲霉菌株H15具有高蛋白酶活力：酸性、中性、碱性蛋白酶活力分别为192．35，1816．31，3774．82 U／g，比出发菌株H0分别提高17．49％，19．08％，10．66％。
%To increase the proteinase activity of Aspergillus oryzae during the brewing of sauce,take Aspergillus oryzae strain H0 from laboratory as the starting strain,and then ARTP mutation of strain H0 is carried out.The process conditions are as follows:power is 120 W,air flow volume is 10 L/min,10 time gradient.The results show that the lethality is about 90% as the mutation time is 140 s,and it is the best time.Three strains such as H5,H12,H15 are selected by initial screening (take glycinin as the key factor in the selectivity culture medium )and high-throughput secondary screening (by 96 hole plate),and checked by Folin-phenol method.Eventually,Aspergillus oryzae strain H15 with high proteinase activity is selected;its acidic,neutral and alkaline proteinase activity is192.35,1816.31,3774.82 U/g respectively,which is increased by17.49%,19.08%,10.66%respectively compared with the starting strain H0 .【期刊名称】《中国调味品》【年(卷),期】2016(041)012【总页数】7页(P67-73)【关键词】常压室温等离子体诱变(ARTP);高通量筛选;蛋白酶活力【作者】舒冬梅;王德良;宋绪磊;尚柯【作者单位】新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052;中国食品发酵工业研究院，北京 100015;中国食品发酵工业研究院，北京 100015;新疆农业大学食品科学与药学学院，乌鲁木齐 830052【正文语种】中文【中图分类】TS201.25酱油的酿造是以微生物为动力，将原料中的蛋白质、糖类、脂类等经过复杂的生物化学反应，生成多糖、单糖、氨基酸、多肽、酯类、风味物质等的一系列过程。
目前酱油微生物中研究较多的微生物是米曲霉，主要是因为米曲霉产生的酶系丰富并且各种酶系综合作用对酱油风味的形成起重要作用，其中起关键作用的是蛋白酶，米曲霉分泌的蛋白酶使原料中的蛋白质降解生成氨基酸，提高酱油氨基酸含量[1]。
目前我国大多数酱油厂采用沪酿3.042以及经过诱变后选育的新菌株，但是其蛋白酶活力依然不够高，导致我国酱油原料蛋白利用率在80%左右，而日式酱油这个指标已经达到90%[2]。
米曲霉菌种的诱变方法包括物理、化学方法，前人对于米曲霉菌种诱变方法有多种[3-7]。
袁艳玲等人以米曲霉Y0为出发菌株，通过紫外线与DES复合诱变，0.4%干酪素培养基初步筛选，获得1株高产中性蛋白酶菌株H2-5，其中性酶活力为2158 U/g，经10代培养，菌株中性蛋白酶活力具有良好的遗传稳定性[8]。
另外，近几年ARTP(常压室温等离子体)诱变方法应用的兴起为微生物诱变选育提供了新的方法和思路。
由于ARTP诱变产生等离子体均匀，射流温度低，需氦气装置，操作简便，对细胞与生物大分子作用明显等优势[9,10]，此方法应用广泛，如化学净化剂、热敏感性医疗仪器消毒以及生物方面[11]。
研究已报道其应用于酵母、大肠杆菌、刺糖多孢菌、米曲霉等微生物诱变并取得良好效果[12-15]。
本试验在参考各种文献的基础上结合生产实践创新试验方法，利用新型ARTP诱变育种方法诱变米曲霉，采用透明圈法和96孔板法建立高通量筛选突变菌株的方法，并获得高产蛋白酶的米曲霉突变株，提高米曲霉分解蛋白的能力，从而提高酱油中氨基酸含量，提高酱油质量和国际竞争力。
1.1 菌株米曲霉(Aspergillus oryzae)H0菌株为本实验室保藏。
1.2 试剂与仪器大豆球蛋白百灵威公司；实验室制麦汁、茚三酮、果糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、碘酸钾、福林酚试剂(均为分析纯) Bitopped 公司。
恒温生化培养箱，水浴锅(控温精度±0.1 ℃) 北京天林恒泰科技有限公司；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司；ARTP-II型ARTP诱变育种机无锡源清天木生物科技有限公司；涡旋仪MVS-1 北京东方开物科学器材有限公司；立式电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂；UV-1700可见分光光度计岛津公司；PHS-3C pH计雷磁有限公司；恒温电子天平AL204 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
1.3 培养基的配制和灭菌菌种保藏培养基：马铃薯培养基。
大豆球蛋白筛选培养基[16]：大豆球蛋白1 g，磷酸二氢钠1.07 g，磷酸氢二钠1 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，121 ℃灭菌30 min。
0.1%干酪素培养基：干酪素1 g，磷酸二氢钠1.07 g，磷酸氢二钾0.36 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.002 g，蒸馏水1000 mL，121 ℃灭菌 30 min。
麸曲培养基：250 mL的三角瓶，装料量为麸皮15 g,水15 mL，自然pH，121 ℃灭菌30 min。
1.4 氨基氮测量试剂盒溶液显色剂：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)20 g，磷酸二氢钾(KH2PO4)12 g，超声溶解，加入茚三酮1.0 g和果糖0.6 g(精确至0.01 g)，混匀，用水溶解并定容至200 mL。
将溶液贮藏在棕色瓶中，放置4 ℃冰箱保存，1周内使用有效。
稀释溶液：称取碘酸钾(KIO3)2 g(精确至0.01 g)溶于620 mL水中，超声溶解，加入99.7%乙醇380 mL，混匀，于4 ℃贮存。
甘氨酸标准储备液(1.072 g/L)：称取甘氨酸0.1072 g，用水溶解并定容至100 mL，于0～5 ℃贮存。
甘氨酸标准使用液：吸取甘氨酸标准贮备液1 mL，用水稀释至100 mL。
该标准使用液含游离氨基氮2 mg/L，使用时现配制。
1.5 生长曲线绘制将米曲霉从试管斜面转接到PDA平板上，28 ℃培养72 h。
将活化好的米曲霉用接种环接3环到装有已灭菌12°麦汁的三角瓶中，自保藏斜面中挑取3环米曲霉孢子接入装有10 mL无菌麦汁培养基的试管中，摇匀，制成孢子悬液，于28 ℃培养箱中培养活化24 h。
将10 mL菌悬液倒入装有300 mL无菌麦汁培养基的三角瓶中，摇匀，制成孢子悬液，于28 ℃培养箱中摇床培养。
取14个2 mL的离心管，称重并分别记录离心管的重量，精确到0.0001 g。
吸取1 mL的12°麦汁和200 μL的1.5×105的活化菌液，置于28 ℃摇床培养。
于培养后的第0，4，8，12，16，20，24，28，32，36，40，48，52，56 h取出相应标号的离心管，置于4 ℃冰箱保存。
待全部离心管取出，统一8000 r/min，离心15 min。
60 ℃烘干3 h，称量重量，精确到0.0001 g。
孢子数稀释倍数。
1.6 ARTP诱变1.6.1 菌悬液制作将活化好的米曲霉菌种接种于PDA培养基上，培养温度28 ℃，培养18～24 h 是对数期，本试验采用对数期36 h时的米曲霉，将对数期的米曲霉用0.8%生理盐水调其浓度，在光学显微镜下计数，将菌浓度调至1×106 ～1×108 cfu/mL。
本试验最终米曲霉菌孢子浓度为2×106 cfu/mL。
将配制的2×106 cfu/mL孢子悬浮液取95 μL，取50%甘油5 μL，两者均匀混合，以保护米曲霉孢子。
1.6.2 ARTP照射剂量的确定采用氦气为工作气体，使载片与等离子体发生器射流出口间距约为2 mm，功率为120 W，气流量10 L/min，对10 μL孢子(106 cfu/mL)悬液进行诱变，处理时间设置为0，20，60，80，100，120，150，180，210，240 cfu/mL，稀释孢子悬液为2×104，2×103，2×102 cfu/mL，取100 μL各稀释倍数孢子悬浮液涂布选择培养皿，28 ℃培养3天计数，计算致死率(3个重复的平均值)。
致死率1.7 初筛方法挑选ARTP诱变140 s的平板上的菌落点种于大豆球蛋白初筛选培养基，28 ℃培养72 h观察记录透明圈和菌落大小，计算出K值。
挑取K值较大并且孢子数较多的菌落接种于马铃薯试管斜面培养基，于30 ℃培养72 h，试管内布满淡绿色米曲霉菌丝停止，然后于4 ℃冰箱保存备用。
1.8 高通量复筛菌种1.8.1 高通量复筛菌种的培养将初选的15个于菌株PDA平板上培养72 h，制备每个菌株的菌悬液，菌浓度为2.5×106 cfu/mL。
采用18 cm×18 mm的试管加入1～15号诱变菌株菌悬液1 mL和1 mL 0.1%干酪素培养基，以试管中加入2 mL为对照试验，每个处理重复3次。
于28 ℃恒温生化培养箱摇床培养36 h后，从每个试管中取出40 μL液体置于96孔板中，加入10 μL发色剂，100 ℃水浴准确加热16 min，在(20±0.1) ℃水浴中冷却20 min。