HPLC法测定葡萄汁(酒)中的白藜芦醇和白藜芦醇苷

ＨＰＬＣ法测定葡萄汁　Ａｃｔａ　Ｎｕｔｒｉｍｅｎｔａ　Ｓｉｎｉｃａ．Ｆｅｂ．．２０１０．Ｖｌ０ｌ＿３２　Ｎｏ．１　（酒）中的白藜芦醇和　白藜芦醇苷　

Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ　Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ　ｉｎ　Ｇｒａｐｅ　Ｊｕｉｃｅ（ｗｉｎｅ）ｂｙ　ＨＰＬＣ　

周丽，董永海，胡传来，储成顶，金忠秀　（安徽医科大学公共卫生学院，合肥２３００３２）　ＺＨＯＵ　Ｌｉ，ＤＯＮＧ　Ｙｏｎｇ—ｈａｉ，ＨＵ　Ｃｈｕａｎ－ｌａｉ，ＣＨＵ　Ｃｈｅｎｇ—ｄｉｎｇ，ＪＩＮ　Ｚｈｏｎｇ—ｘｉｕ　（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆＰｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ，Ａｎｈｕｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ　２３００３２，Ｃｈｉｎａ）　

白藜芦醇（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ，Ｒｅｓ）主要存在于葡　萄、虎杖、藜芦等植物中，为多酚化合物，３，４’，５一　三羟基二苯乙烯，分子式Ｃ　Ｈｔｚ０。，分子量２２８．２５，　顺、反式两种异构体均能与葡萄糖结合，形成顺　式（ＣｉＳ）或反式（ｔｒａｎｓ）白藜芦醇苷。现已证实Ｒｅｓ　具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗心血管疾病、抗　血小板聚集、调节免疫、保护肝脏及雌激素样等　作用ｎ　。目前Ｒｅｓ的含量分析，主要针对葡萄酒　和酿酒葡萄［５　７　３国内还未见食用葡萄中Ｒｅｓ含量　的报道。本研究旨在建立一种简便、高效液相色　谱～紫外检测法，通过紫外照射将Ｒｅｓ及其苷的反　式异构体转化成顺式，采用耐酸性色谱柱，有效　分离葡萄汁（酒）中Ｒｅｓ的四种存在形式，进而定　量分析市场上常见的４种葡萄、１种葡萄汁和２种红　葡萄酒中各种Ｒｅｓ，为指导人们食用和研究其功效　提供依据。　１对象与方法　１．１仪器与试剂　Ｗａｔｅｒｓ　６００高效液相色谱，Ｗａｔｅｒｓ　２４８７检测　器（双波长检测器），Ｅｍｐｏｗｅｒ色谱工作站。甲醇　为色谱醇，甲酸为分析纯，甲醇和３％甲酸水溶液　分别经０．４５　ｇｍ尼龙膜和混合纤维素膜过滤。反　式Ｒｅｓ及其苷对照品购于天津市尖峰天然产物研　究公司，含量均大于９８％。液相色谱用水为双蒸水，　１．２标准溶液配制　精确称取反式Ｒｅｓ及其苷各１０．０　ｍｇ，用无水　乙醇溶解，配制Ｏ．１０　ｇ／Ｌ反式Ｒｅｓ及其苷的标准贮　备液。各吸取３０　ｍｌ，依文献　分别于２５４　ｎｍ紫外　灯下照射３　ｍｉｎ，各精确移取２５ｍｉ于同一５０　ｍ１容　量瓶中，得Ｒｅｓ及其苷顺、反异构体的混合标准应　用液。以残留的反式Ｒｅｓ及其苷计算转化率，分别　为５．６％和１５．６％。Ｒｅｓ的顺、反式及其苷的顺、反　式浓度依次为２．８、４７．２、７．８、４２．２￣ｔｇ／ｍｌ。　

．１．３色谱条件　色谱柱：采用ＺＯＲＢＡＸ　Ｅｃｌｉｐｓｅ　ＸＤＢ—Ｃ１８　（１５０ｒａｍ×４．６　ｌｌｌｍ，５　ｇｍ）；流动相：Ａ为３％甲酸水　溶液，Ｂ为甲醇；流速１．０　ｍｌ／ｍｉｎ；柱温３５℃；梯　度程序为０—０．５　ｍｉｎ，Ｂ　０—５％；０．５—１５　ｍｉｎ，　Ｂ　５％一３５％；１５—２０　ｍｉｎ，Ｂ　３５％一６５％，保持３　ｍｉｎ；　２３￣２４　ｍｉｎ，Ｂ　６５％一１００％，保持３　ｍｉｎ：２７—２８　ｍｉｎ，　Ｂ　１ｏ０％一０；再平衡５　ｍｉｎ。检测波长：顺式Ｒｅｓ　及其苷入为２８８　ｎｍ，反式Ｒｅｓ及其苷入为３０６　ｎｍ。　１．４样品制备　５００　ｇ葡萄清洗后，沥干水分，去梗、籽后经　果汁机粉碎。精确移取２０　ｍｌ葡萄汁，加入无水乙　醇８０　ｍｌ，３０￣Ｃ￣４０￣Ｃ超声萃取４０　ｍｉｎ，减压浓缩　至一定体积浓缩液（或葡萄酒２０　ｍ１），加入１０　ｍ１　无水硫酸钠饱和溶液，９０　ｍｌ乙酸乙酯分３次萃取，　收集上层液体，减压浓缩至干。浓缩物用３　ｍｌ　８０％　乙醇溶解后，过０．４５　ｍ滤膜，待分析。　

２结果　２．１系统适用性（图１）　收稿日期　２００９—０４—０８　基金项目　安徽医科大学校基金（Ｎｏ．２００５ＫＪ１６）；　作者简介周丽（１９７７一），女，硕士，讲师，　Ｅ－ｍａｉ１：ｚｈｏｕｌｉ０１２９＠１２６．ｃｏｍ　中图分类号Ｒ１５１．２　文献标识码Ｂ　文章编号０５１２～７９５５（２０１０）Ｏｌ一００２６—０３　营养学报２０１０年第３２卷第１期　Ａ：Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｂ：Ｍａｒｋｅｔ　ｇｒａｐｅｊｕｉｃｅ，１．ｔｒａｎｓ。ｐｉｃｅｉｄ，　２．ｔｒａｎｓ－ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ，３．ｃｉｓ－ｐｉｃｅｉｄ，４．ｃｉＳ—ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏ］　Ｆｉｇ．１　ＨＰＬＣ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｓｔａｎｄａｒｄｓ　ａｎｄ　ｓａｍｐｌｅｓ　

在选定色谱条件下顺、反式Ｒｅｓ苷保留时间分　别为１４．４６４与１９．３７６　ｍｉｎ；顺、反式Ｒｅｓ为１８．７０２　与２１．５４５　ｍｉｎ。Ｒｅｓ苷及Ｒｅｓ的色谱峰与相邻杂峰　的分离度大于１．５，理论塔板数按反式Ｒｅｓ色谱峰　８７　计算大于１０　０００（图１）。该法各标样的保留时间有　较好的重现性，通过保留时间（±５％）及用标样　增高法来识别检出峰，由色谱图（图１Ｂ）可见样品　经前处理后，基质对待测组分的检出干扰较少。　２．２线性范围与最小检出量　在设定的色谱条件下，分别取２０　ｌ系列混　合标准溶液分析。以顺、反式Ｒｅｓ苷￣［ＩＲｅｓ的浓度　为横坐标，以峰面积为纵坐标，回归方程分别为：　ｙ顺式白饕芦醇苷＝４４２７６ｘ一１　１０２．６，　ｒ＝０．９９９４；　ｙ反式自藜芦醇苷＝７０８３８ｘ一４９６８．４，　ｒ＝Ｏ．９９９７；　ｙ顺式白藜芦醇：９５０３９ｘ—ｌ９００．１，　ｒ＝Ｏ．９９９２；　ｙ反式自藜芦醇－１５１２６７ｘ一１３４５．６，ｒ＝０．９９９９。　线性范围分别为０．２３～７．８、０．４１～４２．２、０．３１～　２．８、０．３１～４７．２　ｍｇ／Ｌ。顺反式Ｒｅｓ苷及顺反式Ｒｅｓ　的检测限分别为０．２３、０．４１、０．３ｌ、０．３１　ｎｇ。　２．３精密度（表１）　精密吸取顺、反式Ｒｅｓ苷和顺、反式Ｒｅｓ对　照品混和液２０　ＬＬｌ，重复进样５次，测其峰面积，　计算相对标准差（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎ，　ＳＲＤ）分别为２．３０％、１．１２％、１．９６％、３．１２％。　Ｔａｂｌｅ　１　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｒｅｓｕｌｔｓ　

２．４回收率（表２）　Ｔａｂｌｅ２　Ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ　ｏｆ　Ｉ￣ｉｃｅｉｄ　ａｎｄ　ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ　精确吸取葡萄汁２０　ｍｌ，精密加入混合对照品　溶液１　ｍ１，以下同样品制备，进样２０　１。　２．５样品检测及其稳定性（表３）　取葡萄汁（酒），按１．４５１Ｊ备样品，进样２０　ｕｌ，　结果见表３。样品溶液避光放置于４℃，取２０　１，　分别在２，４，８，ｌ６，２４　ｈ进样分析，记录ＨＰＬＣ　图谱中反式Ｒｅｓ的峰面积，计算ＲＳＤ＝３．２５％。　表３显示葡萄汁的Ｒｅｓ大多为反式糖苷，葡萄　带皮发酵后所得红葡萄酒在贮藏过程中，反式Ｒｅｓ　含量显著增高。在五种葡萄汁中，市售葡萄汁反　式Ｒｅｓ苷含量最突出，可能是由于该葡萄汁配料中　有含相当数量Ｒｅｓ苷的葡萄皮匀浆所致。　

Ｔａｂｌｅ　３　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｐｉｃｅｉｄ　ａｎｄ　ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ　ｉｎ　ｇｒａｐｅ（ｊｕｉｃｅ）ａｎｄ　ｗｉｎｅ（　±Ｓ，ｎ＝３）　

（下转９０页）　■■　Ａ：Ｃｏｎｔｒｏｌ；Ｂ：Ｍｏｄｅ１；Ｃ：Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ；Ｄ：０．５％ＡＰＳＰ；Ｅ：１．Ｏ％　ＡＰＳＰ：Ｆ：２．Ｏ％ＡＰＳＰ　Ｆｉｇ．３　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｔｉｓｓｕｅ　ｉｎ　ｒａｔｓ　（ＰＡＳ，２００ｘ）　

３讨论　糖尿病属代谢障碍性疾病，糖代谢异常与脂　代谢异常互为因果　’　。本研究中，用ＳＴＺ尾静脉　建立糖尿病模型，发现其血糖升高、体重下降、　血脂异常、肝功下降同时存在。病理切片亦表明，　肝脏脂肪变性明显，肝糖原很少且不均匀。灌胃　７ｗ，三个ＡＰＳＰ￣ｔＪ量组有明显的降糖作用，以１．Ｏ％　剂量组最好，与Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ组相当。ＡＰＳＰ虽不能显　著提高血清ＨＤＬ—Ｃ，但能显著降低ＴＣ、ＴＧ￣ＨＬＤＬ—Ｃ，　表明也有较强的降脂作用。ＡＰＳＰ治疗组血清ＧＯＴ　和ＧＰＴ活性较模型组显著降低　川，肝脏未见明显　脂肪变性，肝糖原明显增加，表明ＡＰＳＰ对肝功能　和肝细胞膜结构有一定的保护作用；Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ　组虽有很好的降血糖效果，但对肝脏和血脂有不　利的影响。综上，ＡＰＳＰ可改善糖尿病大鼠血糖、　血脂异常，促进糖代谢和脂代谢的良性循环，可　能与其保护肝脏的功能有关，其机制尚不清楚，　

Ａｃｔａ　Ｎｕｔｒｉｍｅｎｍ　Ｓｉｎｉｃａ．Ｆｅｂ．．２０１０．、ｂ１．３２　Ｎｏ．１　需进一步研究。　关键词：　紫甘薯花色苷；糖尿病：血糖：血脂　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ，ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｐｕｒｐｌｅ　ｓｗｅｅｔ　ｐｏｔａｔｏ；　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｍｅｌｌｉｔｕｓ；ｂｌｏｏｄ　ｇｌｕｃｏｓｅ；ｂｌｏｏｄ　ｌｉｐｉｄ　

［参考文献］　津久井亚纪夫、铃木敦子，小卷克己，他．　，｝‘　７．：　７：　色素０组成比Ｅ安定性［Ｊ］．日本食品科学工学会　

，１９９９，４６：１４８—１５４．　ＺＨＵ　Ｈｏｎｇ—ｍｅｉ（朱洪梅），ＺＨＡＯ　Ｍｅｎｇ（赵猛）．Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ　ａｎｄ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｉｐｏｍｏｅａ　ｂａｔａｔａｓ　Ｌ．　（ｐｕｒｐｌｅ　ｓｗｅｅｔ　ｐｏｔａｔｏ）［Ｊ］．林产化学与工业，２００９，２９：３９－－４５．　孙晓侠．紫甘薯花色苷结构鉴定及抗氧化、降血糖功能的研　究［Ｄ］．硕士学位论文，天津：天津科技大学，２００６．５０—５１．　邓华聪，孙江．糖尿病血脂异常的发生机制［Ｊ］．辽宁实用糖　尿病杂志．２００１，９：５．　方京微，向红丁．脂代谢变化与糖尿病阶梯状演变的相关研　究［Ｊ３．２００８，１０：８３０—８３２　Ｎａｉｋ　ＳＲ，Ｓｈｅｔｈ　ＵＫ．Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｗｏ　ｎｅｗ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｎ—ａｒａｌｋｙｌ—Ｏ—ｅｔｈ０ｘｙｂｅｎｚａｍｉｄｅｓ：Ｐａｒｔ　ＩＩ—Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅｉｒ　ａｎｔｉ—ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］．Ｉｎｄｉａｎ　ｌ，Ｅｘｐ　Ｂｉｏｌ，１９７８，１６：１１７５—１１７９．　付春来，魏宏建．解读临床肝功能检验结果［Ｊ］．临床医学，　２００５．２５：７９—８１．　

术　米　：ｌ：　：ｌ：　：ｌ：　木　术　（上接８７页）