引物设计心得
引物设计知识点总结大全
引物设计知识点总结大全引物设计是分子生物学和遗传学研究中的重要环节，它在PCR扩增、基因测序、基因突变检测等实验中起着至关重要的作用。
引物设计的好坏会直接影响实验结果的准确性和可靠性。
下面是引物设计的相关知识点总结：一、引物设计的基本原则1. 引物长度：引物长度通常在18-30个碱基对之间，过短的引物容易产生非特异性扩增，过长的引物则会降低扩增效率。
2. 碱基组成：引物的碱基组成应尽量避免多聚腺嘌呤或多聚胸腺嘧啶的情况，以免引起扩增效率降低或引物间的二聚体形成。
3. Tm值匹配：引物的熔解温度（Tm值）应尽量匹配，以确保二聚体形成和特异性扩增。
4. 特异性：引物的特异性是引物设计的关键，必须确保引物只会与待扩增的目标DNA序列特异结合，而不与其他非目标DNA序列结合。
5. 避免互补二聚体：引物之间的互补二聚体会导致扩增效率降低或产生非特异性扩增，因此需要避免引物之间的互补结构。
二、引物设计的工具和方法1. 序列分析工具：常用的序列分析工具包括NCBI的BLAST、Primer-BLAST、OligoAnalyzer等，通过这些工具可以评估引物的特异性和二聚体形成潜力。
2. 引物设计软件：引物设计软件可以根据目标序列自动生成合适的引物序列，在设计引物过程中考虑多个因素如Tm值、长度、特异性等。
常用的软件有Primer3、Primer Premier等。
3. 引物设计策略：根据实验需求选择合适的引物设计策略，常用的策略包括温度梯度扩增引物设计、Asymmetrical PCR引物设计、引物修饰等。
三、引物设计中的注意事项1. 引物位置选择：引物应该选择在目标序列中的稳定区域，避免选择在重复序列、变异位点和剪切酶位点等容易引起问题的区域。
2. 引物长度控制：引物长度的选择需要平衡扩增效率和特异性，过短的引物可能导致扩增效率降低，过长的引物则可能增加非特异性扩增的风险。
3. 引物设计的平衡性：在设计引物时，需要平衡Tm值的匹配、特异性和二聚体形成的可能性，以达到最佳的扩增效果。
pcr引物设计的基本理念 -回复
pcr引物设计的基本理念-回复PCR引物设计的基本理念PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA序列。
在PCR过程中，引物起着至关重要的作用，引物的设计质量直接影响PCR反应的效果。
因此，正确的PCR引物设计是成功进行PCR实验的基本前提。
本文将介绍PCR引物设计的基本理念，并分步回答如何设计合适的PCR 引物。
第一步：确认目标序列PCR实验通常是为了扩增某个特定的DNA序列，因此首先需要确定所需扩增的目标序列。
这个目标序列可以是基因片段、特定的DNA结构、启动子区域等。
在确认目标序列时，需要注意目标序列的长度和特异性，确保其能准确而特异地被引物扩增。
第二步：确定引物的长度引物通常由20到30个核苷酸组成，过短的引物可能不稳定，无法正确与模板DNA特异性结合，过长的引物则可能导致PCR产物过多的副产物。
因此，一般情况下引物长度约为18到24个核苷酸，适当选择引物长度有利于PCR的优化。
第三步：评估引物的理化性质引物的理化特性包括引物的GC含量、熔解温度（Tm）和自身引物结合能力。
高GC含量的引物更稳定，但也更难设计；Tm值表征了引物与模板DNA杂交的稳定性，通常理想的Tm值为50-65；自身引物结合能力的评估可以避免引物之间的非特异性结合。
多种软件可用于计算引物的理化性质，并为引物设计提供参考。
第四步：检查引物的特异性引物的特异性是PCR引物设计的关键点之一。
为了确保引物仅扩增目标序列，没有互补的序列存在于其他地方，可以使用引物设计软件进行特异性检查。
软件可以检查引物在基因组中的互补性和互补的副产物，以确保引物只扩增目标序列。
第五步：考虑引物间的配对引物在PCR反应中需要与目标序列的两端结合，因此两个引物（前向引物和反向引物）需要在目标序列上互补配对。
在设计引物时，需要确保两个引物的Tm值相近，以避免一个引物过早或过晚离开DNA链。
此外，还需要考虑引物之间的距离和可能的PCR产物长度，以确定引物的相对位置。
引物设计的几点重要原则
PCR引物设计的11条黄金法则1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5.引物3′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。
6.碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。
降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物设计知识点归纳总结
引物设计知识点归纳总结引物设计是分子生物学和基因工程领域中非常重要的一项技术。
合理设计的引物能够用于聚合酶链式反应（PCR）、DNA测序、基因克隆等实验操作，对实验结果的准确性和可靠性起到至关重要的作用。
本文将对引物设计的关键知识点进行归纳总结。
一、引物的基本原理在开始介绍引物设计的具体知识点之前，我们首先需要了解引物的基本原理。
引物是一串能够与目标DNA序列特异性结合的短链核酸分子。
在PCR等实验中，引物通过与DNA序列的互补配对，在酶的催化下引导合成新的DNA链。
因此，引物的设计需要考虑以下几个方面：1. 引物长度：一般来说，引物的长度在18-30个碱基对左右。
过短的引物可能导致非特异性引物结合，而过长的引物则会增加实验成本和复杂性。
2. 引物GC含量：引物的GC含量对引物的特异性和结合稳定性有一定影响。
通常来说，引物的GC含量在40% - 60%之间较为合适。
3. 引物特异性：引物设计的最重要原则是要确保引物与目标DNA序列能够特异性结合。
这就需要通过合理的选择引物序列，避免引物与非目标序列发生配对。
二、引物设计中的重要考虑因素在引物设计中，需要综合考虑多个因素，以确保引物在实验中的成功应用。
以下是引物设计中的一些重要考虑因素：1. 引物的互补性：引物应该具有高度的互补性，即引物序列与目标DNA序列的互补配对部分要尽可能多。
这有助于提高引物与模板DNA 的结合能力。
2. 引物的内部结构：引物在设计时，需避免存在自身内部结合部分，即引物序列中不应出现太多连续的互补序列，以防止引物在实验中形成二聚体或多聚体。
3. 引物的Tm值：引物的熔解温度（Tm值）是指引物与目标DNA序列之间的双链分离温度。
引物的Tm值需要根据所需实验条件和目标DNA序列的碱基组成来确定，以保证引物与目标DNA能够在适当的温度下进行特异性结合。
4. 引物的特异性：在引物设计中，需要进行引物序列的BLAST（基础局部比对搜索工具）检测，以确保引物序列与非目标序列不存在高度相似之处，避免产生假阳性结果。
引物设计知识点总结
引物设计知识点总结引物是在分子生物学和遗传学研究中广泛使用的一种技术。
它主要用于DNA或RNA的扩增、测序和检测等实验。
引物设计的质量和准确性对实验结果有着重要的影响。
本文将对引物设计的知识点进行总结和讨论。
一、引物设计的基本原则引物设计需要考虑以下几个基本原则：1. 引物长度：引物的长度一般在18-30个碱基对之间。
过短的引物可能导致扩增效率低下，过长的引物则可能增加非特异性扩增的风险。
2. 引物温度：引物的熔解温度（Tm）应在50-65摄氏度之间。
引物的Tm过高可能导致非特异性扩增，而过低则可能导致扩增效率下降。
3. 引物结构：引物的序列应避免高度互补部分，以减少二次结构的形成。
此外，引物的3'端应尽量避免含有GC丰富序列，以减少引物自身的二聚体形成。
二、引物序列的选择在引物设计中，需要根据具体的实验目的和DNA序列来选择引物的序列。
以下是常见的引物序列选择策略：1. 引物长度：引物的长度一般为18-30个碱基对。
对于较短的DNA序列或需要快速扩增的实验，可以选择较短的引物；对于复杂的基因或需要高度特异性扩增的实验，可以选择较长的引物。
2. 引物位置：引物应位于目标序列的末端，以提高特异性。
通常，引物应位于目标序列的保守区域，并避免位于变异或多态性较高的区域。
3. 引物序列：引物的序列应避免高度互补部分，以减少二次结构的形成。
此外，引物的GC含量应适中，避免过高或过低。
三、引物设计工具为了帮助科研人员进行引物设计，许多在线工具和软件被开发出来。
以下是一些常用的引物设计工具：1. Primer3：Primer3是一个广泛使用的引物设计工具，可以根据用户输入的序列和参数，自动设计引物。
2. NCBI Primer-BLAST：NCBI Primer-BLAST可以在设计引物的同时，对引物与目标序列的特异性进行评估。
3. OligoAnalyzer：OligoAnalyzer可以评估引物的物理属性，如熔解温度和GC含量，并检查引物是否存在二聚体结构。
PCR引物设计及软件使用技巧
PCR引物设计及软件使用技巧PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，在基因测序、基因突变检测、基因定量等领域具有广泛的应用。
而PCR引物的设计是PCR反应成功与否的关键因素之一。
本文将介绍PCR引物设计的原理和方法，并向读者介绍一些常用的PCR引物设计软件及其使用技巧。
一、PCR引物设计的原则和策略PCR引物设计的目标是选取一对特异性的引物，使其能在目标DNA序列的两侧结合并扩增出特定的DNA片段。
PCR引物的设计应遵循以下原则和策略：（一）特异性PCR引物应与目标DNA序列特异结合，防止与其他非目标DNA 序列结合产生非特异性扩增。
为了确保特异性，引物的设计中应防止高度保守的序列，尽量选择低度保守区域。
（二）长度和GC含量PCR引物的长度通常应在18-30个碱基对之间，过短会降低特异性，过长可能会导致扩增效率降低或产生非特异性扩增。
另外，引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低都会影响扩增效果。
（三）防止二聚体和内外引物二聚体PCR引物设计时应防止引物之间以及引物与内外引物之间形成二聚体。
二聚体会影响引物的特异性和扩增效率，甚至导致PCR反应失败。
因此，引物设计时可以利用一些在线工具进行二聚体分析。
（四）防止引物间的交叉杂交和截断引物引物间的交叉杂交会导致非特异性扩增，而截断引物会导致扩增结果缺失或产物截断，因此引物设计时应防止以上状况的发生。
（五）引物间距和末尾相对于PCR引物的设计目标，引物间距相对固定，一般为100-500bp之间。
此外，引物的末端设计也要思量，如添加限制性酶切位点、引入位点或尾部，以便利后续的克隆操作。
二、PCR引物设计的方法PCR引物设计可以接受多种方法，如序列比对、限制性酶切位点分析、引物簇设计等。
下面介绍一些常用的PCR引物设计方法。
（一）序列比对法序列比对法是一种简易易行的PCR引物设计方法。
通过将目标序列与参考序列进行比对，找出保守区域来设计引物。
引物设计及PCR技巧
一．PCR引物设计的原则引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补；其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。
必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。
根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。
在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp（20bp左右），但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。
引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。
上下游引物的GC含量不能相差太大。
G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC 最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
另外，上下游引物所对应模板位置序列的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。
引物设计实验报告
引物设计实验报告
PCR引物设计实验报告
在PCR引物设计实验中，以微生物植物为研究对象。
PCR引物设计的方法：先使用可视化软件查找目标基因；然后定位其起始编码位置；随机建立反向引物、直接引物、复合引物等特异性序列；最后启动PCR反应，以检测其作用效果。
首先，利用可视化软件，明确目标基因在基因组中的位置，使用基因组数据库搜索和确定其起始编码位置，选择合适的诱发器，建立反向引物和直接引物。
将编码前缀和后缀序列作为反向引物的开端，将编码后缀和前缀序列作为直接引物的终端；也可以利用复合引物，将反向引物和直接引物连接在一起，使其更加灵活及具有高灵敏度。
然后，在反应体系中加入引物，根据模板情况，进行PCR反应，控制取向、温度和时间等条件，在持续反应的情况下，令所需特定的基因产物依次反应，避免由于PCR扩增的杂质导致的信号混乱，从而获得高品质的特个别段DNA序列。
PCR引物设计实验的主要功能是定位基因和产物，确定反应的条件，从而得到关联分析所需的特定序列。
实验结果显示，通过PCR引物设计实验，可以在一定时间内提高合成速度，得到较为精确的基因产物，从而帮助研究者更好地开展分子检测。
引物设计知识点归纳总结
引物设计知识点归纳总结引物设计是生物学和生物技术领域中非常重要的一个环节。
在分子生物学研究、基因工程、医学诊断、疾病预防等方面，引物设计都起着至关重要的作用。
引物设计的好坏直接影响到PCR扩增、序列特异性分析、RNA干扰、原位杂交、基因克隆等实验的效果和结果。
因此，深入理解引物设计的相关知识点对于提高实验效率和结果的可靠性非常重要。
本文将介绍引物设计的相关知识点，并对其进行归纳总结。
1. 引物设计的基本原则引物是在分子生物学实验中用于对特定DNA或RNA序列进行扩增、检测或特异性结合的人工合成的寡核苷酸序列。
设计好的引物对于实验的成功至关重要，而引物设计的基本原则包括：(1) 引物长度：引物长度一般在18-25碱基对之间，过短的引物可能导致扩增效率低，而过长的引物可能导致特异性差。
(2) GC含量：引物的GC含量应该在40%-60%之间，过高或过低的GC含量会影响引物的结合性能和特异性。
(3) 引物序列选择：引物的序列选择要尽量避免重复序列、近似重复序列和具有高度变异性的区域。
(4) 引物特异性：引物的特异性是指引物能够与目标序列特异性结合，而不结合其他非特异序列，引物特异性的好坏直接影响到实验结果的准确性和可靠性。
2. 引物设计的常见问题及解决方法在引物设计过程中，常常会遇到一些常见问题，例如引物特异性不足、引物二聚体形成、引物偏向性扩增等问题。
针对这些问题，有一些解决方法可以参考：(1) 引物特异性不足：可以通过生物信息软件对引物进行预测和评估，合理选择引物序列，避免与非特异序列发生交叉杂交。
(2) 引物二聚体形成：引物二聚体是指引物之间相互结合形成二聚体，导致引物的扩增效率降低。
可以通过调整引物长度和序列，以及优化PCR扩增条件来避免引物二聚体的形成。
(3) 引物偏向性扩增：引物偏向性扩增是指引物对特定序列的扩增效率高于其他序列，可以通过优化PCR扩增条件，如调整引物浓度、反应体系等来解决。
引物设计教程范文
引物设计教程范文引物设计是指在科学研究或实验中使用的引物（primer）的设计过程。
引物是DNA或RNA分子链的短片段，用于PCR扩增、DNA测序、基因克隆等实验中的特定目的。
一个好的引物设计能够确保实验的成功和可靠性。
本文将介绍引物设计的基本原则和一些常用的引物设计工具。
引物设计的基本原则如下：1.引物长度：通常，引物的长度应在18-30个碱基对之间，引物过长容易造成非特异性扩增，引物过短则可能无法扩增特定片段。
2.引物序列特异性：引物应该与目标序列特异结合，以避免非特异性扩增和干扰。
3.引物的GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间。
高GC含量可以增加引物和目标序列的结合力，但过高的GC含量会增加引物的结合特异性。
4.引物的熔解温度（Tm）：引物的Tm是指其在扩增反应中解离的温度。
引物的Tm应在50-65摄氏度之间，以确保扩增反应的稳定性。
5.引物序列间的配对：PCR扩增一般使用一对引物，它们应该分别在目标序列的两侧配对。
引物之间的配对能够确保正确扩增目标片段。
除了基本原则外，科研人员还可以使用一些引物设计工具来辅助设计引物。
1. Primer3：Primer3是一个广泛使用的引物设计工具，它可以根据用户提供的目标序列和一些参数来自动设计引物。
用户可以指定引物的长度、GC含量、Tm等参数，并且可以根据需要设计多对引物。
2. NCBI Primer-BLAST：NCBI Primer-BLAST是由美国国家生物技术信息中心（NCBI）开发的一款在线引物设计工具。
它使用BLAST算法来确保引物的特异性，用户只需要提供目标序列即可。
使用这些工具进行引物设计时，用户通常需要提供目标序列的基本信息，如序列长度和DNA/RNA序列。
在设计引物时，可以根据实际需求进行不同参数的设定，以获得最佳的引物设计结果。
总之，引物设计是科学研究和实验中必要的一步，一个好的引物设计能够增加实验的可靠性和成功率。
遵循引物设计的基本原则和使用合适的引物设计工具，能够有效地设计出满足实验要求的引物。
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[分享] primer5和Oligo结合设计引物步骤及心得
Oligo, 引物, 心得, 结合, 设计
本帖引用网址：http://bbs.bbioo.com/thread-34152-1-1.html
一、引物设计step by step
1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位
置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2、用Primer Premier5搜索引物
①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列
在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗
口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，
进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在
Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产
物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300～500bp.
③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认
按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引
物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况： 3’不要出现连续的3个碱基
相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm
应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不
要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，
发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结
构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些
二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，
所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，
是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然
带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5.
⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后
在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面
有该引物的详细信息。
3、用Oligo验证评估引物
①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该
序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口
和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上
游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo
length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引
物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze菜单中各
种强大的引物分析功能了。
②Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，
其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5中引
物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G过高，
会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要
超过9。
③Analyze中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引
物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower ，
即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR反应异常的重要因素，因此
应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其
Delta G值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3个。Oligo此项
的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G值。
④Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，
同样，Delta G值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3个。
Analyze中第四项为Composition and Tm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的
组成比例和Tm值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的
GC％ 不要相差太大。Tm值共有3个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor
method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，
Tm 值可以控制在50～70度之间。
第五项为False Priming Sites，即错误引发位点，在Primer5中虽然也有False priming分析，
但不如oligo详细，并且oligo会给我正确引发效率和错误引发效率，一般的原则要使误引
发效率在100以下，当然有时候正确位点的引发效率很高的话，比如达到400～500，错误
引发效率超过100幅度若不大的话，也可以接受。
⑤Analyze中，有参考价值的最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR反
应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。
若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且Delta G值偏大的话，Oligo在最后的评
价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。
⑥引物评价完毕后，可以选择File－Print，打印为PDF文件保存，文件中将会包括所有Oligo
软件中已经打开的窗口所包括的信息，多达数页。因此，打印前最好关掉Tm窗口和Delta G
窗口，可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口（若存在可疑的异常的话）和PCR窗口。
4、引物确定后，对于上游和下游引物分别进行Blast分析，一般来说，多少都会找到一些
其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的blast结果进行对比分析，只要
没有交叉的其他基因的同源序列就可以。