免疫荧光组织化学技术
免疫组化与免疫荧光的区别2页
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免疫组化和免疫荧光的区别是免疫荧光属于免疫组化，是免疫组化中的一种技术方法。
免疫组化检查指应用免疫学抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色，确定组织或细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对的定量检查。
按标记物质的种类分类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。
按染色步骤分类，可分为直接法和间接法，间接法的灵敏度提高了许多。
综上，免疫荧光法是免疫组化检查的一种技术方法。
免疫组化与免疫荧光都是经过免疫原，两者原理相似，仅是显色剂不同。
免疫组化使用酶进行显色，而免疫荧光一般不使用酶进行显色。
另外，免疫组化通常在明视野进行观看，而免疫荧光则是在暗视野观看。
患者进行治疗首先需明确诊断疾病，若无精准诊断则无精准治疗。
免疫组化与免疫荧光的真正目的均为明确病理诊断，以便患者获得精准治疗。
免疫组化是应用免疫学的基本原理，也就是抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，来确定组织
细胞内的抗原，对其进行定位、定性和相对定量的研究。
进行免疫组化的时候，经常使用的显示剂包括荧光素、酶、金属离子或者是同位素。
免疫荧光就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素，标记在抗体或者抗原上，与其相应的抗原或抗体结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
概述免疫组织化学（简称免疫组化）技术中根据标志物的不同，可分为免疫荧光组织化学技术、酶免疫组织化学技术、免疫金（银）组织化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。
免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。
标本的处理标本的主要来源标本的来源主要有以下几种：1.活体组织各种实验动物和人体活检组织。
标本应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中，应减少对组织标本的损伤与挤压。
2.各种体液、穿刺液标本量少，可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。
3.培养细胞悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定，吹干后保存备用。
标本的固定与保存使细胞内蛋白质凝固，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织的改变。
蛋白质类：可用乙醇或甲醇固定；微生物：可用丙酮或三氯化碳固定；多糖类：用10%福尔马林（甲醛溶液）或以微火加热固定；去除黏液物质：透明质酸酶等；去除类脂质：有机溶剂（乙醚、丙酮等）。
冷冻切片可使抗原达到最大限度的保存。
石蜡切片是研究形态学的主要制片方法。
抗原的保存与修复使组织抗原决定簇重新暴露，是免疫组织化学技术中的重要步骤。
常用方法有：1.酶消化法无花果蛋白酶为轻度消化酶；胰蛋白酶为中度消化酶；胃蛋白酶为强消化酶。
2.盐酸水解法操作中应注意掌握盐酸浓度、水解温度及水解时间，以最大限度暴露抗原而又不破坏抗原性为目的。
3.微波法将石蜡切片置于缓冲液中，凭借微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白，暴露被掩盖的抗原决定簇。
免疫组织化学技术
免疫组织化学技术Immunohistochemistry, IHCImmunocytochemistry,ICCn基本原理利用免疫学中抗原与抗体特异性结合的特点以及组织化学的原理，在组织或细胞标本中加入特定的标记抗体，然后对标记物进行显示，从而对组织或细胞内的抗原物质进行定性、定位或定量研究。
免疫酶技术显示Caspase-3免疫荧光技术显示MOR产生免疫效应物质并与之结合抗原的两种特性：免疫原性：或致敏T 细胞）；抗原性：完全抗原：同时具备免疫原性和抗原性半抗原抗原决定簇或表位：决定抗原特异性的基本结构或一般均为多价。
共同抗原：两种不同的抗原分子所具有的相同或相似同或相似决定簇的不同抗原的反应称为交叉反应。
酸多无免疫原性，但与蛋白结合形成核蛋白则有免疫原性；多肽类激分子量且分子量越大，免疫原性越强）、结构的复杂性（免疫原性物质还分子构象和抗原决定簇的易接近性等。
2.宿主方面的因素：异种性（“非已”－－异种、同种异体、自体抗原－－抗原来源与宿主关系越远，免疫原性越强）、遗传因素（个体年龄、性别与健康状态。
抗原的剂量免疫应答）、进入机体的途径（皮内＞皮下＞肌肉＞腹腔＞静免疫次数佐剂原或同时与抗原混合注射动物，以增强抗原的免疫原性，即起辅佐抗典型的免疫球蛋白分子呈Y 重链（heavy chain, H ）和两条相轻链二硫键连接而成。
链的1/2氨基酸序列变化很可变区region, V ）；其他部分氨基恒定区（constant region, C）。
Fab 即抗原结合片段（fragment 轻链和部分重链（VH 和CH1）组成。
可结晶片段crystalline ），Fc 段含有两条重链C 能区，它无抗体活性。
Ig 在异种间免抗原性同时Fc 段还具有活化补体、亲细胞、大多数天然抗原物质以及各种组织成分等)往往簇，而每一决定簇都可刺激多克隆抗体是多个抗原决定淋巴细胞分泌的多种抗体的混合物制备单一表位特异性抗体的理想方法是获得针对单但浆细胞在体外的寿命较短，也难以培养。
免疫荧光技术原理
免疫荧光技术原理以免疫荧光技术原理为标题，本文将介绍免疫荧光技术的原理及其应用。
免疫荧光技术是一种常用于生物学研究和临床诊断的方法，通过利用特异性抗体与目标分子结合并标记荧光物质，实现对目标分子的检测和定位。
其原理基于抗原与抗体之间的特异性结合，借助荧光信号的激发和发射，可对目标分子进行高灵敏度和高特异性的检测。
免疫荧光技术的过程主要分为样品制备、抗体标记和荧光显微镜观察三个步骤。
在样品制备过程中，需要将待检测的生物分子固定在载玻片上，如细胞、组织切片或固相膜。
固定的目的是保持样品的形态结构和抗原的完整性，以便后续的抗体结合。
接下来，需要选择特异性的抗体来与目标分子结合。
抗体是一种由机体产生的蛋白质，具有高度特异性和亲和力，能够与抗原结合形成抗原-抗体复合物。
抗体可以通过多种途径获得，如动物免疫、单克隆抗体技术等。
在免疫荧光技术中，抗体需要标记荧光物质，常用的标记物有荧光染料、荧光蛋白等。
标记荧光物质的选择应根据实验需求和仪器的检测波长范围来确定。
使用荧光显微镜对标记的抗体-抗原复合物进行观察和分析。
荧光显微镜通过激发样品中的荧光物质，使其发出荧光信号，并通过特定的滤光片来选择性地收集和观察特定波长的荧光信号。
这样可以实现对目标分子的定位和定量分析。
荧光显微镜具有高灵敏度和高分辨率的优点，可在细胞和组织水平上观察和分析生物分子的表达和分布。
免疫荧光技术在生物学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
在生物学研究中，可以通过免疫荧光技术来研究蛋白质的表达和定位、细胞信号转导、细胞凋亡等生物过程。
在医学诊断中，免疫荧光技术可用于检测和诊断多种疾病，如感染性疾病、肿瘤等。
此外，免疫荧光技术还可以用于药物筛选、免疫组织化学和免疫细胞化学等领域。
总结起来，免疫荧光技术通过利用特异性抗体与目标分子结合并标记荧光物质，实现对目标分子的检测和定位。
它在生物学研究和临床诊断中具有重要的作用，为科学研究和疾病诊断提供了可靠的工具。
免疫荧光(单标和双标)注意事项及具体方法
免疫荧光（单标和双标）注意事项及具体方法一、技术简介免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验流程免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1. 所需材料与试剂：a. 培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60%-70%的细胞。
b. 一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
c. 4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃预冷20 min)。
d. 封闭液。
e. 0.01mol／LPBS缓冲液。
2. 染色方法：a. 取出培养有细胞的盖玻片或glass-bottom培养皿，用0.01MPBS洗2-3遍。
b. 加入0.3%的Tritonx-100，37℃，30 rain。
c. 加入4%多聚甲醛试问固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。
d. 正常阻断血清1:20封闭试问20-30 min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
e. 去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃过夜。
抗体以0.01mo/LPBS稀释（理想的抗体浓度需经试验而定）。
f. 用0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5min，0.01 M PBS洗5 rain。
生化免疫荧光与干化学法
生化免疫荧光与干化学法免疫荧光细胞化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，经过近43年的发展，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞化学。
它与亲合化学技术如葡萄球菌A蛋白、生物素与卵白素、植物血凝素相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机和扫描电视等技术结合发展为定量免疫荧光细胞化学技术；荧光激活细胞分类器的应用使免疫荧光细胞化学技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。
细胞显微分光光度计与与图像分析仪的结合使免疫荧光组织化学的定量检测更加准确。
在免疫荧光细胞化学中应用单克隆抗体日益增多，将会不断提高特异性、敏感性和应用范围。
激光扫描等聚集显微镜的应用又开创了新的发展时代。
由于免疫荧光细胞化学的特异性，快速性和在细胞和分子水平定位的敏感性与准确性，在免疫学、微生物学、细胞和组织学、病理学、肿瘤学以及临床检验学等生物学和医学许多方面得到广泛应用，日益发挥重要的作用。
免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。
这两种方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常用。
用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。
免疫荧光细胞化学分直接法、间接法和补体法。
直接法1、检查抗原法这是最早的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成荧光特异性抗体，直接与细胞或组织中相应抗原结合，在荧光显微镜下即可见抗原存在部位呈现特异性荧光。
免疫组化、免疫荧光、流式细胞术的应用比较及常见问题分析-精选文档
免疫组化流程示意图
IHC二抗原理及选择
1. SABC法
原理：SABC法是利用链酶亲和素 (Streptavidin)与生物素(Biotin)特有的高度亲 和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过 氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP， 然后与链酶亲和素按一定比例混合，形成 SABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体 结合，再与SABC复合物联结形成抗原～抗 体～生物素化二抗～ SABC复合物。最后用 底物显色剂显色。 特点：该法具有灵敏度高以及低背景染色 等特点。
免疫组织化学结果分析
免疫组织化学常见问题分析
1.显色过深
一抗浓度过高或孵育时间过长，建议降低 一抗浓度或减少孵育时间。 孵育温度过高，建议室温或4℃孵育。
HRP标记二抗孵育时间过长，建议缩短时
2.非特异性显色
石蜡切片脱蜡不彻底，建议延长脱蜡时间。 操作过程中冲洗不充分，建议增加冲洗的 次数与冲洗时间。
IHC常用酶标二抗原理示意图
IHC显色方法原理及选择
1. DAB显色法
产品描述：二氨基联苯胺( 3，3’diaminobenzidine，DAB ) 是过氧化物酶 (Peroxidase) 的显色底物，在过氧化物酶的 催化下，DAB显色工作液会于反应部位产生 不溶于酒精的棕褐色沉淀。本试剂盒适用于 辣根过氧化物酶（HRP）系统的免疫组化显 色。 试剂盒组成： DAB显色原（20×）（试剂A） DAB底物缓冲液（1×）（试剂B）
间。
组织富含内源性的生物素与过氧化物酶， 建议使用相关试剂进行封闭。
发生抗原异位。 蛋白封闭不充分，建议增加蛋白封闭时间。
免疫组织化学染色技术
病毒载量评估
染色技术可以定量检测组织中病毒的数量，有助于评估病毒复制 活跃程度和治疗效果。
鉴别诊断
染色技术可以与其他感染性病变进行鉴别诊断，有助于确定病因 和治疗方案。
自身免疫性疾病诊断
自身抗体检测
通过染色技术可以检测组织中自身抗体的存在， 有助于诊断自身免疫性疾病。
炎症反应评估
染色技术可以反映组织炎症反应的程度和范围， 有助于判断病情进展和治疗效果。
鉴别诊断
染色技术可以与其他非自身免疫性疾病进行鉴别 诊断，有助于确定病因和治疗方案。
药物靶点筛选
药物作用机制研究
染色技术可以用于研究药物的作用机制和靶点，有助于发现新的治 疗方法和药物。
药物筛选
染色技术可以用于筛选具有潜在治疗作用的候选药物，有助于降低 药物研发成本和时间。
床常用指标。
病毒检测案例
总结词
免疫组织化学染色技术可用于病毒的快速检测和鉴定， 具有高灵敏度和特异性。
详细描述
在病毒检测中，该技术常用于检测病毒抗原或抗体，以 确定病毒的存在和感染程度。例如，在COVID-19诊断 中，通过免疫组织化学染色技术检测病毒抗原，有助于 快速确诊和防控疫情。
自身免疫性疾病诊断案例
未来展望
随着蛋白质组学、基因组学等领域的快速发展，免疫组织 化学染色技术将继续发挥重要作用，并有望在临床诊断、 药物研发等领域取得更多突破。
02
免疫组织化学染色技术的基本步 骤
样本准备
样本类型
组织样本、细胞样本等，要求新鲜、无菌、无杂质。
样本处理
清洗、切割、固定等，确保样本的稳定性和染色效果。
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免疫荧光组织化学技术 一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 二、免疫荧光组织化学的原理„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ （一）直接方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 1． 检查抗原方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„
2． 检查抗体方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„
（二）间接方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„
1．检查抗体(夹心法)方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 2．检查抗体方法 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 3．检查抗原法 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ （三）补体法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 1．直接检查组织内免疫复合物方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 2．间接检查组织内抗原方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ （四）双重免疫荧光组织化学标记方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ （五）对照试验„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 1． 直接方法 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„
2． 间接方法 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„
3． 补体方法 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„
三、荧光抗体的制备„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„
（一）荧光素 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 1． 异硫氰酸荧光素 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„
2． 四甲基异硫氰酸罗达明 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„
3． 得克萨斯红(Texas red)„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„
4．其它荧光素„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„
（二）荧光素标记抗体的方法 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 1．FITC标记抗体的方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„
2．四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法„„„„„„„„„„„„„„„„„
3．藻红蛋白标记抗体方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 4．蓝色荧光素标记抗体方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ （三）荧光抗体的质量控制 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 1．染色特异性和敏感性的测定方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 2．F/P比值的测定方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 3．荧光抗体的保存„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„
四、免疫荧光组织化学染色方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ （一）荧光抗体染色方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 1．直接方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 2．间接方法(双层法) „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 3．间接方法 (夹心法) „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 4．补体方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 5．膜抗原荧光抗体染色方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 6．双重染色方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 7．荧光抗体再染色方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ （二）荧光抗原染色方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 五、荧光显微镜检查方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ （一）荧光和荧光显微镜„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ （二）荧光显微镜标本制作要求„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 1．载玻片„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 2．盖玻片„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 3．标本„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 4．封裱剂„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 5．镜油„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ （三）使用荧光显微镜注意事项„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ （四）荧光图像的记录方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 六、非特异性染色的消除方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ （一）非特异性染色的主要因素„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ （二）消除非特异性染色的方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 1．葡聚糖凝胶G-50柱层析法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 2．DEAE纤维素柱层析法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 3．荧光抗体稀释法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 4．纯化抗原方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 5．纯化抗体方法——免疫吸收方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 6．伊文氏蓝(Evans blue)衬染色方法„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 七、现状与展望„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„
免疫荧光组织化学技术 一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述 免疫荧光组织化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由Coons和他的同事(1941)建立，免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞(或组织)化学。它与葡萄球菌A蛋白(SPA)、生物素与卵白素、植物血凝素(ConA等)相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机，扫描电视和双光子显微镜等技术结合发展为定量免疫荧光组织化学技术；荧光激活细胞分类器Fluorescin activated cell sorter (FACS)的应用，激光共聚焦显微镜的问世，使免疫荧光细胞技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。细胞显微分光光度计与图像分析仪的结合使免疫荧光组织化学的定量检测更加准确。80年代到90年代相继又有新的荧光素出现如R-藻红朊，B-藻红朊，C-藻青蛋白，cy2, cy3, cy5, cy7均在流式细胞仪和激光共聚焦显微镜中广泛应用。 由于免疫荧光组织化学的特异性，快速性和在细胞水平定位的准确性，已在免疫学、微生物学、病理学、肿瘤学以及临床检验等许多方面得到广泛应用，日益发挥重要的作用。
二、免疫荧光组织化学的原理 免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，荧光素受激发光的照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术测定含量（图3-2-1）。
图3-2-1紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法。用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。免疫荧光组织化学分直接法、间接法和补体法。 （一）直接方法 1． 检查抗原方法 这是最简便、快速的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体，直接用于细胞或组织抗原的检查。此法特异性强，常用于肾穿刺，皮肤活检和病原体检查，其缺点是一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。（图3-2-2） 图3-2-2 直接法 2． 检查抗体方法 将抗原标记上荧光素，用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应，而将抗体在原位检测出来。 （二）间接方法 1．检查抗体(夹心法)方法 此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应，再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合，抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间，故称夹心法。 2．检查抗体方法 用已知抗原细胞或组织切片，加上待检血清，如果血清含有切片中某种抗原的抗体，抗体结合在抗原上，再用间接荧光抗体(抗种属特异性IgG荧光抗体)与结合在抗原上的抗体反应，在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异性荧光。此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段。 3．检查抗原法 此法是直接法的重要改进，先用特异性抗体与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体与结合在抗原上的抗体结合，形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物。同直接法相比荧光亮度可增强3或4倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于同一种属产生的多种第一抗体的标记显示，这是现在最广泛应用的技术。 （三）补体法 1．直接检查组织内免疫复合物方法 用抗补体C3荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，而形成抗原-抗体-补体—抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物上补体存在处，此法常用于肾穿刺组织活检诊断等。 2．间接检查组织内抗原方法 常将新鲜补体与第一抗体混合同时加在抗原标本切片上，经37℃孵育后，如发生抗原抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原-