第四章 沉淀法

结合使用。
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四、非离子型聚合物沉淀
用聚乙二醇(PEG)等非离子性聚合物能降
低蛋白质的溶解度，有选择性的沉淀蛋白质。
机理：与有机溶剂相似，能降低水活度，破坏蛋白质
的水化膜。
常用：分子量>4,000
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五、聚电解质沉淀
机理：架桥与静电

离子型多糖聚合物 酸性多糖，如：羧甲基纤维素、海藻酸钠 合成的离子聚合物：
常用的为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠。
5）某些金属离子：如Ca2+、Zn2+等可与某些成阴离子
状态的蛋白质形成复合物，并降低 溶剂用量。
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3、有机溶剂沉淀法的特点
优点：

分辨能力比盐析法高； 沉淀不用脱盐，过滤较为容易； 容易引起变性失活； 操作要求在低温下进行； 成本高
缺点：



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三、等电点沉淀法
3
蛋白质分子的溶解特性
4
防止蛋白质凝聚沉淀的屏障
⑴蛋白质周围的水化层； ⑵蛋白质两性电解质，分子间静电排斥
作用。
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沉淀法的分类
根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为： （1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法； （4）非离子型聚合物沉淀法； （5）聚电解质沉淀法； （6）复合盐沉淀法等 （7）亲和沉淀法 （8） 选择性沉淀法。
硫酸铵的加入有以下几种方法： 1）加入固体盐法 - 工业用
用于要求饱和度较高而不增大溶液体 积的情况；
2）加入饱和溶液法
用于要求饱和度不高而原来溶液体 积不大的情况，一般40-60%； 3）透析平衡法 多用于结晶。
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3、盐浓度对盐析效果的影响
㏒ S=β-KsI
Cohn经验式
S—蛋白质的溶解度，g/L; I－离子强度=1/2∑mizi2 mi—离子 i的摩尔浓度； Zi—所带电荷 β—常数，图中截距 Ks—盐析常数，图中直线斜率
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β和Ks的物理意义 β—代表截距 与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关；
Ks—盐析常数，代表图中直线的斜率；
与温度和pH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。
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用盐析法分离蛋白质的二种方法
Ks分段盐析法
--用于早期的粗提液； 固定pH, 温度，改变盐浓度 --用于进一步精制。 固定离子强度，改变pH及温度
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β分段盐析法
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分段盐析(fractional salting out)
总蛋白
上 清 液 蛋 白 浓 度 %
目标蛋白质
0
20
40
60
80 100
饱和度%
最适饱和度是30%，55%
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4、盐析法特点
1. 2. 3. 4.
成本低; 操作简单、安全; 不会引起蛋白质变性; 分离效果不理想。 --蛋白浓度为2-3%
但单独应用较少，多与其它方法结合使用。
非离子多聚体沉淀法：用于分离生物大分子。
生成盐复合物沉淀：用于多种化合物，特别是小分子
物质的沉淀。
选择性沉淀：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下
易变性的杂蛋白。
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九、沉淀法应用
• • • • 沉淀法大规模提纯血浆蛋白 胰岛素的提取 柠檬酸的提取 生活例子：咸鸭蛋
1、常用的有机溶剂沉析剂
选择依据：
水溶性要好 介电常数要小 致变性作用要小 毒性要小、挥发性适中 容易获取
常用：乙醇、甲醇和丙酮
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2、有机溶剂沉淀法的影响因素
1）温度
必须在低温下进行
2）pH值： pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。 3）样品浓度：一般初浓度为0.5～2％ 4）中性盐浓度： 一般中性盐浓度为0.01～0.05mol/L，
pH=pI
在低的离子强度下，调pH至等电点，降低 蛋白质间静电斥力，使分子间相互吸引，形成 沉淀的操作。
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等电点沉淀法
1.0
未沉淀蛋白质的分率
0.8 0.6 0.4 0.2 1 2 3 4 5 6 7 8 pH 对大豆蛋白质 溶解度的影响
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等电点沉淀法注意事项
适用于憎水性较强的蛋白质； 往往不能获得高的回收率，通常与其他沉淀方法
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5、盐析注意事项
选择适宜饱和度 采用分步盐析 为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理
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脱盐
1、透析
2、凝胶过滤
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二、有机溶剂沉淀法
在含有溶质的水溶液中加入一定量 亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度， 使其沉淀析出。
机理：
A
降低溶剂介电常数 B 破坏水化膜
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有机溶剂沉淀法机理
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胰岛素的提取
猪胰
提取 乙醇提取，加酸调pH 2.5，10-12℃，搅拌
提取液
碱化
滤液
酸化 酸调 pH 2.5
氨水调pH7.8-8.0
滤液 粗制品
锌沉淀 加ZnCl2
沉淀
脱脂
脱脂液
盐析
酸调pH2.7-2.8， 12-15℃放置过夜
酸调pH2.5， 加NaCl
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讨论题：
咸蛋煮熟了，蛋黄里会有油？
聚丙烯酸（pH 2.8 90%蛋白沉淀） 聚苯乙烯季胺盐（pH 10.4, 95% 蛋白沉淀）


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六、 成盐类复合物沉淀
此类沉析剂有以下三种：
1、高价金属盐
2、苦味酸盐、单宁酸盐、鞣质等 3、无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐等
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1、金属离子沉淀蛋白质
n n
一般可分三类： ①能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈 结合的一些金属离子， 如：Mn2+、Fe2+ 、Ｃu2+、Zn2+; ②能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子， 如：Ca2+ 、Ba2+、Mg2+ 、Pb2+; ③能与巯基化合物强烈结合的一些金属离子， 如：Ｈg2+、Ag2+ 、Pb2+ 。
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八、选择性变性沉淀法
利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某
些物理或化学因素敏感性不同，有选择地使之
变性沉淀，以达到分离提纯的目的。
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各种沉淀方法应用范围
盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸产品
的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。
等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀。
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n
n
成盐类复合物沉淀
2．有机盐法
含氮有机酸能与有机分子的碱性功能团形成复合物
3．无机复合盐法：如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。
以上盐类复合物都具有很低的溶解度，极易沉淀析出。
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七、亲和沉淀
利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫 配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互 作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。
原料液 细胞分离(离心，过滤) 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲) 细胞破碎 碎片分离 路线一 路线二 清液－胞外产物
路线一A
粗分离(沉淀/超过滤/萃取)
纯化(层析、离子交换、吸附)
脱盐(凝胶过滤、超滤) 浓缩(超滤)
复性
精制(结晶、干燥)
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概 述
沉淀： 利用沉析剂使生化物质在溶液中的 溶解度降低而形成无定形固体沉淀 的过程。 目的：分离和浓缩
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一、盐析
在高浓度的中性盐存在下，蛋白质 概念：
（酶）等生物大分子物质在水溶液 中的溶解度降低，产生沉淀的过程。
盐析是可逆的，而变性是不可逆的
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盐析法机理
（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集
（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域 （3）中和电荷，减少静电斥力
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盐析机理示意图
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盐析过程
当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种 情况： （1）“盐溶”现象(salt-in)—低盐浓度下，增加蛋 白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大 。 （2）“盐析”现象(salt-out)—高盐浓度下，中和电 荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降 。
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1、盐析用盐的选择

盐析作用要强
盐析用盐需有较大的溶解度
盐析用盐必须是惰性的
来源丰富、经济
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盐析用盐的选择
阴离子的影响大于阳离子 阴离子盐析效果：
柠檬酸盐＞PO43- ＞SO42-＞CH3COO-＞ Cl-＞ NO3-＞SCN-
阳离子盐析效果：
NH4+ ＞ K+＞Na+ ＞高价阳离子
• 熟鸭蛋蛋黄中脂肪的含量高达31％，为什
么看不到一点油？可是在熟咸蛋的蛋黄中， 却经常可以看到黄色的油滴往外流？
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• 蛋黄中除了脂肪以外，还含有丰富的蛋白
质，蛋白质就是一种高明的乳化剂，它能
够把蛋黄中的脂肪分散成很小的油滴，这
样就骗过了我们的眼睛和舌头。
• 。
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思考题
1. 什么是沉淀法，具体包括哪些方法？ 2. 理解概念：硫酸铵饱和度，盐溶， 盐析 3. 盐析的机理是什么？ 4. 有机溶剂沉淀蛋白质的机理什么？
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盐析用盐的选择
盐析中常用的盐： 硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠
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盐析用盐的选择
硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂
（1） 价廉；
（2） 溶解度大，温度系数小； （3） 不易引起蛋白质变性。
缺点： n（1）水解变酸； n（2）高pH 释氨，腐蚀； n（3）残留产品有影响。
n
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2、盐析操作(加盐方式）