小鼠肝细胞的分离培养
小鼠提原代肝细胞原理
小鼠提原代肝细胞原理
小鼠提原代肝细胞是一种实验室技术，用于研究和探索肝脏生物学和疾病机制。
其原理主要包括以下几个步骤：
1. 鼠标准备：选取适合的小鼠作为实验对象，例如常用的实验小鼠品种如C57BL/6等。
2. 消化和分离：通过注射合适的麻醉药物使小鼠进入无意识状态，然后进行腹腔解剖，取出肝脏组织。
将肝脏组织切碎并进行酶消化，将肝细胞从其他细胞分离出来。
3. 培养和传代：将分离得到的原代肝细胞放入适当的培养基中，并提供适宜的营养物质和环境条件，使其在培养皿中继续生长和增殖。
当细胞充分增殖并达到一定密度时，可以进行传代，即将细胞从原培养皿中分离并重新分配到新的培养皿中。
4. 鉴定和确认：对传代后的细胞进行鉴定和确认，例如通过形态学观察、细胞计数、细胞功能检测等方法，确保细胞的纯度和活性。
同时，可使用特异性标记物如肝细胞特异性蛋白等进行免疫染色，确认细胞的特异性。
通过小鼠提原代肝细胞，科研人员可以获得高质量的原代肝细胞样本，用于开展各种疾病模型、药物筛选和机制研究等实验。
该技术为肝脏疾病的治疗和预防提供了重要的实验基础。
小鼠肝细胞培养的方法优化及其应用
小鼠肝细胞培养的方法优化及其应用近年来，小鼠肝细胞在许多生物医学研究中扮演着至关重要的角色。
小鼠肝细胞培养是研究肝功能和疾病发生机制的重要手段，但它的成功与否则依赖于培养方法的质量和有效性。
因此，本文将探讨小鼠肝细胞培养的方法优化及其应用。
一、小鼠肝细胞培养的基本要素在小鼠肝细胞培养前，我们需要对一些基本要素有所了解。
首先是培养基的选择，培养基中的主要成分包括营养元素、生长因子、血清和抗生素等。
其次是小鼠肝细胞的来源，可以是肝组织、肝细胞分离后培养或者肝细胞株。
最后是培养环境的控制，包括温度、CO2浓度、湿度等因素。
基于以上要素，我们可以通过以下几个方面来优化小鼠肝细胞培养方法。
二、培养基的优化培养基中的营养元素和血清等因素的浓度会影响细胞的代谢和增殖。
经过不断的调整和改进，研究人员发现一些培养基组合能够更好地维持小鼠肝细胞的代谢需求和增殖能力。
例如，Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）添加适量的生长因子（如表皮生长因子、胰岛素样生长因子和基质金属蛋白酶）和血清可有效提高小鼠肝细胞培养的成功率和长期维持细胞的质量。
三、小鼠肝细胞来源的优化小鼠肝细胞的来源通常可以是肝组织、肝细胞分离后培养或者肝细胞株。
一般来说，从小鼠肝组织取得肝细胞可获得更好的细胞活性和代谢能力。
特别地，通过胆汁灌注分离法得到的小鼠肝细胞，更为有效和高质量。
四、培养环境的优化培养环境中的温度、湿度和CO2浓度等因素对小鼠肝细胞的生长和代谢都会产生影响。
一般情况下，20-25°C的室温、5%CO2浓度和相对湿度在50-70%之间是最为适宜的条件。
在细胞培养过程中，应尽可能避免一些较大的生理环境波动，以维持细胞充足的营养和稳定的代谢水平。
总之，小鼠肝细胞的培养方法优化能够提高小鼠肝细胞的长期保存能力和维持其正常生理和代谢状态。
在生物医学领域的广泛应用中，小鼠肝细胞培养将为寻找肝疾病的防治策略和治疗方案提供更多的科学依据。
原代肝星状细胞的分离
小鼠HSCs 的分离1) 实验前准备：37℃水浴锅内预热D-HanK’s溶液、HBSS溶液(含0.3 mg/mL 的IV 型胶原酶)及含0.3 mg/mL 的IV 型胶原酶和20 μg/mL 的DNA 酶的HBSS 溶液；2) 小鼠准备：取体重约25~30 g 的雌性Colgalt2-/-小鼠与Colgalt2+/+小鼠，禁食12 h，自由饮水；3) 麻醉与固定：腹腔注射8‰的戊巴比妥钠麻醉小鼠，麻醉后固定在超净台内，75%乙醇消毒腹部；4) 依次切开小鼠皮肤、腹膜后暴露腹腔，将小鼠胃肠移至腹部左侧，充分暴露门静脉和下腔静脉。
整个过程均按照手术无菌原则执行；5) 自门静脉远端刺入静脉输液针，另一端连接50 mL 注射器，注射预热的D-HanK’s 液。
确定插入成功后，剪开下腔静脉。
以7-10 mL/min 的速度灌注D-HanK’s 液，灌注约30 mL。
观察肝脏变黄白，流出的D-HanK’s液中无肉眼可见血液后停止灌注；6) 开始灌注预热的含IV 型胶原蛋白酶的HBSS 溶液，速度为3-5 mL/min，灌注10 min 左右。
直至肝脏变软、变脆，肝脏表面呈现裂隙状，压之凹陷不易恢复时结束灌注；7) 摘除胆囊后，剪断门管区韧带和镰状韧带，取下肝脏，放入无菌平皿中。
生理盐水冲洗，剔除肝包膜、血管及纤维结缔组织；8) 剪碎肝组织及震荡消化：将肝组织剪成小碎块，加入已配制好的HBSS液20 mL(含0.3 mg/mL的IV 型胶原酶和1 μg/mL的DNAase I)，37 ℃条件下震荡消化25 min；9) 用200 钼的滤网过滤，1500 g 离心7 min，弃上清；10) 20 mL 冰的不含FBS 的DMEM 培养基将细胞重悬，500 g 离心5 min。
弃去沉淀，即去除肝细胞；11) 离心上清液，1500 g，7 min，吸取沉淀（即肝非实质细胞）；12) 加入2 倍体积的18%Nycodenz离心液，混匀后，小心加入冷的不含FBS的DMEM (约2 mL)；13) 离心：2600 g，22 min。
一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法与流程
一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法与流程小鼠肝脏是重要的免疫细胞来源地之一，其免疫细胞种类繁多，包括各类淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。
因此，高效获取小鼠肝脏中的全免疫细胞对于免疫学研究具有重要意义。
下面将介绍一种高效获取小鼠肝脏全免疫细胞的方法与流程。
一、试验动物的选取首先需要选择健康的小鼠作为实验动物。
通常可以选择8-12周龄、体重20-25g的小鼠进行实验。
此外，实验前需要确保小鼠处于良好的生理状态，无任何疾病或感染。
二、材料准备1.小鼠静脉采血脉管采血针及离心管2.无菌手术器械3.生理盐水4.乙醚5. 70%乙醇6.无菌培养皿和离心管三、操作步骤1.术前准备将实验所需材料进行无菌处理，保证操作环境无菌。
2.麻醉利用乙醚对小鼠进行麻醉，待小鼠完全麻醉后，进行下一步操作。
3.打开腹腔将小鼠放在无菌操作台上，采用无菌手术器械进行皮肤消毒和切开小鼠腹腔。
4.采集肝脏在麻醉状态下，将小鼠的肝脏从腹腔中取出放入无菌盛皿中。
5.分离肝脏细胞将取出的小鼠肝脏放入含有生理盐水的离心管中，用离心机进行离心，将肝脏中的细胞分离出来。
6.细胞培养取出离心管中的肝脏细胞，放入无菌培养皿中，加入适量的培养基，进行培养。
7.细胞鉴定通过显微镜检查培养后的细胞，进行鉴定和分析。
通过以上步骤，就可以高效获取小鼠肝脏中的全免疫细胞。
这种方法不仅简单易行，而且获取到的免疫细胞种类繁多，可用于免疫学研究中的各种实验。
在操作过程中，需要严格遵守无菌操作规范，确保实验结果的准确性和可靠性。
同时，也需要尽量减少对小鼠的伤害和痛苦，符合动物实验伦理要求。
希望这种方法能对相关研究工作提供帮助，推动免疫学领域的进步。
小鼠原代肝细胞培养及细胞增殖的分子机制研究
小鼠原代肝细胞培养及细胞增殖的分子机制研究细胞增殖是生物体生长和发育的重要过程，也是生物体不断更新、修复和再生的关键环节。
肝脏是一个细胞增殖活跃的器官，在肝脏组织受到损伤时，原代肝细胞从G0期重新进入G1期，进行增殖复制，以恢复受损组织。
因此，研究原代肝细胞的培养和细胞增殖分子机制，对于治疗肝脏疾病和肿瘤有重要的意义。
一、小鼠原代肝细胞培养方法小鼠原代肝细胞培养可采取悬浮培养法或贴壁培养法，其中贴壁培养法是最常用的方法之一。
贴壁培养法分为单层培养和三维培养两种方式。
单层培养法是将小鼠肝细胞分离和培养在含有培养基和血清等营养物质的培养皿上，细胞可以黏附于培养皿底部形成单层肝细胞。
这种培养方法常用于细胞增殖和分化实验中。
三维培养法则是将肝细胞培养在类似于肝实质的支架中，使之形成三维结构，这种培养方法可用于肝脏疾病和肝细胞转化研究。
二、小鼠原代肝细胞增殖与细胞周期细胞增殖是一种高度有序的生物过程，受到一系列分子间相互作用的调节。
在小鼠原代肝细胞中，增殖过程主要分为细胞周期的四个时期：G1期、S期、G2期和M期。
其中，S期是DNA合成期，在这期间，DNA聚合酶启动并开始合成新的DNA链。
细胞周期主要受到细胞因子、信号转导途径和细胞周期蛋白等分子的调节。
其中CDK4和CDK6是G1期调节蛋白，它们与细胞周期蛋白D（CyclinD）结合，促进细胞从G1期进入S期。
细胞周期调节蛋白CDK1和CyclinB主要调节细胞从G2期进入M期。
同时，Tp53，Rb等一些肿瘤抑制蛋白也起到重要作用，它们在癌症等疾病中的失调造成了DNA损伤修复的延迟和细胞周期的异常。
三、小鼠原代肝细胞增殖的信号通路小鼠原代肝细胞增殖不仅受到细胞周期调节蛋白的调节，在信号通路的调节下也会发生变化。
目前已知的信号通路包括Wnt/β-catenin信号通路，TGF-β信号通路，VEGF信号通路等。
Wnt/β-catenin信号通路的激活可以促进小鼠原代肝细胞增殖，同时也与肝癌细胞的形成有关。
原代肝细胞培养方法
原代肝细胞培养方法原代肝细胞培养是一种重要的技术手段，它可以使我们更好地理解肝细胞的生物学特性和功能，同时也被广泛应用于药物筛选、毒性研究和肝脏疾病模型的建立。
本文将探讨原代肝细胞培养的方法。
原代肝细胞是从动物（如小鼠、大鼠、猪等）或人体新鲜肝组织中分离得到的肝细胞。
它们具有种独立性和细胞特异性功能，是进行体外研究的理想模型细胞。
原代肝细胞培养的主要步骤包括：肝组织的分离、肝细胞的分离和纯化、肝细胞的培养和维持。
首先，肝组织的分离是原代肝细胞培养的起始步骤。
一般来说，选择健康的动物或人体捐赠的新鲜肝组织，快速解剖分离，并将其置于含有冷蘸过消毒的生理盐水或缓冲液的离心管中。
然后，用小剪刀对肝组织进行切细，使其暴露于细胞分离液或酶溶液中。
常用的细胞分离液包括肝素-胰酶、胰酶、胶原酶、凝集酶及胰蛋白酶。
这些酶能够降解结缔组织，使肝细胞从肝组织中游离出来。
接下来，肝细胞的分离和纯化是确保原代肝细胞培养成功的关键一步。
一般而言，将细胞分离液转移至新离心管，并用对应的培养基对其停滞，使浮游的肝细胞顺应性地附着在组织培养器皿的底部。
在培养基的作用下，非肝细胞（如纤维细胞和非肝上皮细胞）会悬浮离开，而肝细胞则紧密附着在培养器皿上。
此时，我们可以通过控制等粘附时间、细胞数目、培养基的组分和浓度，使纯化程度达到最佳。
然后，肝细胞的培养和维持是原代肝细胞培养的持续关键步骤。
首先，选择合适的培养基是非常重要的。
常用的培养基包括DMEM、威利精简培养基和L-15培养基等。
这些培养基中会添加适量的营养物质（如葡萄糖、氨基酸和维生素）和生长因子（如胰岛素、胆固醇和转铁蛋白）。
其次，细胞密度的控制也非常重要。
通常，当细胞趋于稳定时，可以通过减少培养皿内细胞的数量来避免细胞互相竞争和过度分泌胺碱酸等蛋白质。
此外，保持培养环境的稳定也是原代肝细胞培养的重要环节。
温度、湿度、CO₂浓度和培养基的更新等因素都会对肝细胞的生长和功能有一定的影响。
小鼠肝细胞原代培养、灌注
小鼠肝细胞原代培养+灌注我把我整理和收集战友的一些资料供你分享：材料：小鼠器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器试剂：DMEM（含血清）、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
操作步骤：1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。
2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。
3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min。
4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。
6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。
7、1000rpm，离心5分钟，弃上清液。
8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9、加入含血清的培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。
肝细胞生长不良涉及到细胞的取材、分离、纯化、培养条件，现分别介绍如下，首先介绍原代肝细胞的分离。
目前肝细胞的分离主要采用经典的改良的Salgon经门静脉插管两步灌流法分离肝细胞。
具体操作步骤如下：1: 供体肝脏的游离：选择Mercedes手术切口，即人字型切口，进入腹腔，暴露肝脏，分离肝脏镰状韧带、左、右三角韧带（为了便于手术，可以用生理盐水纱布将肝脏轻柔的向下牵引，并向两侧移动，显露膈下空间），解剖肝十二指肠韧带，确认胆总管，应尽可能靠近远心端结扎（从十二指肠后面进行）。
分离肝动脉，确认胃十二指肠动脉，并将其仔细结扎，但切勿影响肝动脉腔。
小鼠肝原代分离
准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。
分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM和IV 型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。
注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。
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第26卷第4期1998年12月
衡阳医学院学报
Jou rnal of H engyang M edical Co llege
V o l.26N o.4
1998小鼠肝细胞的分离培养①
陈敏时 陈 新 刘传爱②
(衡阳医学院流行病学教研室,衡阳市,421001)
摘 要 采用0.1%的胰蛋白酶消化乳小鼠肝组织块,用DM E M培养基进行肝细胞的培养,1周后可见细胞生长,30d左右细胞铺满培养瓶,培养的肝细胞能分泌白蛋白,培养第20天白蛋白分泌量达高峰。
关键词 胰蛋白酶; 肝细胞; 分离培养
哺乳动物肝细胞不易在体外生长,80年代以来国外采用两步胶原酶灌注法分离肝细胞[1],并以双层鼠尾胶原凝胶培养[2]或肝细胞-非实质细胞混合培养[3],成功地进行了肝细胞的原代培养。
但这些方法操作复杂,价格昂贵。
我们采用胰酶消化、组织块培养的方法进行肝细胞原代培养成功,现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 试剂
1.1.1 0.1%的胰酶 胰蛋白酶1g,加D2
H ank s液100m l溶解,4℃过夜,滤纸过滤除菌,调pH值至7.2冷冻保存,临用前用D2
H ank s液稀释。
1.1.2 基础培养液 DM E M培养基(低糖) 10g,N a2CO33.7g,三蒸水1000m l溶解,调pH值至7.2～7.4,玻沙滤器过滤除菌,临用前100m l加入小牛血清10m l,青霉素1万单位,链霉素10m g,氢化可的松、灭菌1M H EPES
0.4%牛胰岛素各0.25m l。
1.2 动物
3～6日龄昆明小鼠,由本校实验动物部提供。
1.3 肝细胞的分离和培养
处死小鼠,无菌分离肝脏,置D2H ank s液中,冲洗肝脏至灰白色,将肝脏剪成1mm×1mm×1mm的组织块,用D2H ank s液洗3次,去掉血细胞,37℃下用0.1%的胰蛋白酶消化10m in,倒掉消化液后用D2H ank s液洗2次,培养液洗2次,将肝组织块贴壁于组织培养瓶中,每个培养瓶放组织块30～35块,加少许培养液,将培养瓶倒转置于培养箱中,在37℃、5%CO2条件下培养,3h后补充4m l培养液,并翻转培养基继续培养。
第1周每3天换液1次,以后每2天换液1次。
1.4 白蛋白分泌的检测
换液时收集培养液,离心去除浮游单个细胞及碎片,以溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白含量。
2 结 果
2.1 细胞形态及生长动态
培养1周后组织块周围有少数细胞长出, 10天后细胞生长速度较快,大部分组织块周围
①省教委资助课题
② 病毒基因工程研究室
的细胞呈放射状向四周扩散,多数细胞呈圆形,有些细胞有伪足,细胞界限清楚,25～30d细胞铺满瓶底,见图1、2。
少数培养瓶组织块周围细胞以出芽的方式向外推进,细胞呈多边形,经一段时间培养后,细胞群中一些细胞相互分离卷曲,在细胞群中出现网眼状空洞。
图1 培养至第10天时的肝细胞(10×10
)
图2 培养至第20天时的肝细胞(20×10)
2.2 白蛋白分泌情况
从培养的第10天开始,培养物上清液中的白蛋白含量明显高于只有培养基而无肝细胞的空白对照瓶的白蛋白含量,在培养的第20天时培养物上清液中的白蛋白含量达高峰,以后白蛋白含量稍有下降,见表1。
表1 不同培养时期培养物上清液中白蛋白含量 g L 样本量第6天第10天第16天第20天第24天第28天空白对照50.64±0.050.64±0.050.68±0.040.68±0.040.66±0.030.66±0.03培养物100.71±0.121.02±0.181.10±0.141.312±0.161.30±0.121.16±0.14 t值1.586.218.7211.9215.9010.81
p值>0.05<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01
3 讨 论
虽然两步胶原酶灌注法分离肝细胞所获细胞成活率高[2,5],单位肝组织所获细胞多,价格昂贵,操作步骤多,易于污染;肝细胞与非实质细胞共培养虽能使肝细胞的形态与功能维持较长时间[3],但因一单层细胞中生长有两种不同类型的细胞,不利于实验时观察毒物、药物等对肝细胞形态的影响;近期发展的双层凝胶技术,延长了肝细胞生存与分泌白蛋白的时间[2],但操作过程较为复杂。
胰酶消化、组织块培养操作简单,价格低廉,对于大部分实验来说,完全可以获得足够多的细胞以满足实验的要求。
操作过程中,在胰酶消化前要用D2H ank s 液将血细胞清洗干净。
培养后期细胞互相分离,出现网眼状空洞,可能与产生透明脂酸酶有关[4]。
此次培养的细胞能分泌白蛋白,具有类似体内肝细胞的代谢功能[6],可用于肝细胞生理、药理学的研究。
参考文献
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6 王英杰.大鼠肝细胞的微载体粘附培养.中华实验外科杂志,1997;14(1):61
(收稿时间:1998209210)
Isola tion and Culture of Parenchy ma l Cell from M ouse L iver
Chen M ingsh i,Chen X ing,L iu chuanai
(D ep a rt m en t of Ep id e m iology,H engy ang M ed ica l Colleg e,H engy ang,421001)
L iver tissues from K M mou se iso lated by0.1%tryp tic digesti on w ere cu ltu red in DM E M m edial.Cells w ere founded around the tisues after1w eek of cu ltu re.Cells covered all of cu ltu re p late after30days of cu ltu re.T he liver cells cou ld secret album in under these cu ltu re conditi on s.T he p roducti on of album in arrived at the h ighest level on20th day of cu ltu re
Key W ords tryp tic; hepatocytes; iso lati on cu ltu re。