脓毒症动物模型的选择与评价

CONTINUING MEDICAL EDUCATION Vol.22.No.128

专家讲堂脓毒症（Ｓｅｐｓｉｓ）作为急危重症领域的棘手难题，日益引起临床医师及科研工作者的关注。近十年来，现代生物科技的飞速发展极大地促进了人们对脓毒症发病机制的认识，并推动了脓毒症治疗措施的改进和更新。其中，脓毒症动物模型的应用对此起到了十分重要的作用。脓毒症动物模型的不断发展也反映了人们对脓毒症本质的认识正在逐渐深入，总结和分析现有动物模型，对于如何建立更贴近临床实际的脓毒症动物模型、合理设计实验以及准确解释动物实验数据都具有重要意义。１ 应用脓毒症动物模型的意义在过去的几年中，人们对感染后炎症反应分子机制的研究已取得显著进展，其中很大部分是利用体外观察的方法对细胞生理学研究的成果。应明确的是，尽管体外实验的手段先进而且方便，但要更好地了解脓毒症时体内炎症反应的发生、发展过程和其他病理生理变化，还需采用临床相关的脓毒症或脓毒性休克动物模型进行深入的探讨。一般认为，利用动物模型进行脓毒症研究具有以下优点。１．１　在进行具有高度创伤性的操作或进行器官离体实验时只能使用动物模型。特别是在研究脓毒症的病理生理变化时通常需要采集组织标本（如肝、肺、肾等），而这些标本很难从临床获得。只有利用动物模型才可能方便地采取脓毒症各个阶段的组织标本。１．２　临床脓毒症病因较复杂，难以判断其确切的发病时间。很多患者还伴有其他严重的非相关疾病。并且，临床的脓毒症患者通常接受多种支持治疗，这些治疗不可避免地会影响对脓毒症自然病程的观察。因此，直接探讨人类脓毒症的病理生理机制相当困难，而采用动物模型进行实验则可免受上述因素的干扰。１．３　由于临床脓毒症患者的遗传学背景非常复杂，加之患者年龄、性别、同时存在的其他疾病以及支持治疗等因素均可导致临床资料的高度变异性。而要控制这种变异只能靠加大样本量，这无疑将会耗费更多的时间并给临床脓毒症试验带来很大的经济压力。由于动物模型的生物学差异较人类要小，因此所需的样本量也明显少于临床观察。１．４　在探讨脓毒症的发病机制时经常要使用一些药物或试剂（如某种细胞因子的抗体或拮抗剂等），这些制剂可能具有毒性或未经过临床的安全性检验不能用于人体。因此，只有采用动物模型才能方便地利用这些制剂来了解脓毒症发病的分子机制。除此之外，应用脓毒症的动物实验模型还可对药物进行临床试验前的筛选。由此可见，在探索脓毒症发生、发展机制的过程中，选择适宜的脓毒症或脓毒性休克动物模型进行体内研究仍具有不可替代的地位。

２ 脓毒症动物模型的选择及其局限性大量的临床及实验研究资料表明，尽管在过去十几年中有关脓毒症发病机制的认识已取得较大进展，但对于脓毒症治疗和新药开发方面的研究却不容乐观。许多新的干预脓毒症制剂虽然在动物实验中表现出很好的应用前景，但其在临床ＩＩ期和ＩＩＩ期试验中均未取得显著的临床疗效，甚至反而加重疾病的程度。迄今为止，严重脓毒症或脓毒性休克的死亡率仍高达５０％左右。造成这一现象的重要原因之一即是在药物应用于临床前的动物实验观察中所

脓毒症动物模型的选择与评价姚咏明（解放军总医院野战外科研究所 解放军总医院第一附属医院全军烧伤研究所，北京，１０００３７）

ＹＡＯ　Ｙｏｎｇ－ｍｉｎｇ

作者简介姚咏明（１９６５－），男，湖北人，医学博士后，教授，博士生导师。主要从事创伤休克、脓毒症和多器官功能障碍综合征发病机制及防治的研究。现任解放军总医院野战外科研究所副所长、中国微生物学会微生物毒素分会副主任委员、中国中西医结合急救医学分会常委、中国灾害防御协会救援医学会常务理事等职。 继续医学教育 第２２卷第１期29

专家讲堂选择的动物模型不当。当然，许多脓毒症或脓毒性休克动物模型尽管不适于药物的临床前研究，但它们在探索疾病的发病机制和机体的病理生理反应方面发挥了重要作用。因此，在脓毒症或脓毒性休克研究中如何选择适宜的动物模型具有十分重要的意义。在通常的动物实验中，一般尽可能地选用健康的相同性别的同系动物，且严格控制实验条件以确保实验结果的稳定性。由于人类的遗传背景极为复杂，加之脓毒症的原发病因多样且辅助治疗手段多有不同。因此，将动物实验的结果推广到人类具有一定的困难。有学者根据多年的经验提出，在研究脓毒症的治疗手段特别是新药开发的过程中应联合使用几种不同的脓毒症动物模型。如果某种药物在几种脓毒症动物模型中均安全、有效，那么该药物的临床应用前景将更为可信。由于种属间存在的固有差异，在脓毒症的实验中除了动物模型种类的选择外，对动物模型物种的选择也是一个值得注意的问题。多种因素影响着对实验动物种属的选择，从经济方面考虑，小动物（如大鼠、小鼠、豚鼠等）常适用于大批量动物实验或死亡率的观察；但有些实验只能采用大动物（如猪、羊等的慢性模型），主要用于了解脓毒症时动物的心血管及肺等器官的病理生理反应。动物实验有可能得出与临床观察相矛盾或意料之外的结果，这些都促进研究者回过头来对动物模型进行严格的分析再评价，从而逐渐明确二者之间的关系与差别。实际上，无论过去还是将来，我们都应该知道动物模型和临床实际之间是存在明显差别的。基因多态性和性别差异对临床患者的病情有较大的影响，但这一点可能在动物实验中却没有得到充分体现。例如，内毒素（ＬＰＳ）耐受的Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ小鼠在受到ＬＰＳ攻击时不能分泌肿瘤坏死因子－α（ＴＮＦ－α），因而可以耐受大剂量的ＬＰＳ攻击。但用有毒菌对其进行攻击时，其死亡率高于ＬＰＳ反应性的小鼠。大多数实验都采用年轻、健康且没有接受过打击的动物。而且，在进行数据分析时必须考虑人和实验动物的种属差异。在临床工作中，病人也不可能像实验动物一样在打击前后立即接受处理措施。因此，使用预处理的动物模型应慎重。基因敲除也可以看成是一种预处理手段，应用基因敲除，可以剔除或加强所研究的因素在实验中的影响，是一种有效的实验方法。在许多动物试验，尤其是使用小动物的研究中，往往缺乏复苏支持治疗，这可能对实验结果产生较大影响。例如，不能给予脓毒症动物充分的液体复苏支持，可能影响其生存率；另一个重要的辅助治疗是抗生素。如果利用感染模型观察某一抗脓毒症药物（不具有对抗细菌作用）的疗效，应该同时使用抗生素，因为临床病人在发生严重感染所致脓毒症或休克时往往应用抗生素。实际上，如果这些新药的疗效不及抗生素的话，就没有研发的价值。并且，抗生素也可通过影响ＬＰＳ的释放而影响脓毒症的发展。因此，针对脓毒症或脓毒性休克的动物实验必须设立抗生素对照组。在进行临床试验之前，必须进行充分的动物试验，应用不同的感染模型、不同种类动物进行观察，明确所研究的药物在什么情况下最有效，或者为什么无效甚至有害。另外，还要考虑到实验模型与人类疾病的相关性，例如感染方式、剂量、细菌的毒力等都需要考虑到。在休克模型中，使用控制性还是非控制性失血模型是考虑因素之一，此外还应考虑到对动物的打击方式是一致的还是不统一的，因为临床病人的致伤情况各不相同。最后，必须明确动物模型的发病过程与临床患者的病情发展是有差别的。在动物实验中，往往是在给予动物致命打击后数小时或几十小时就进行实验终点或存活情况观察；而在临床实际当中，病人的病情发展系一个渐进性、相对缓慢的过程，刺激因素持久存在，生理功能的失代偿、组织的损害及功能紊乱逐渐发展。因此，发展迅速而凶险的急性脓毒症动物模型与相对缓慢的临床相关性强的动物模型差别较大。不宜使用在６～１２小时内即出现大量死亡的急性动物模型来模拟临床脓毒症发展。在这种急性模型中，动物不可能有时间出现与临床脓毒症相似的全部特点，从而使实验结果的分析CONTINUING MEDICAL EDUCATION Vol.22.No.130

专家讲堂显得十分模棱两可。同时，其他如肝素的使用、麻醉等因素都会影响实验结果的分析，这些因素本身就可以抑制机体的免疫反应，影响心血管功能、器官的血流灌注等。３ 常用脓毒症动物模型评价３．１　腹膜炎模型目前应用较为广泛的腹膜炎模型为盲肠结扎穿孔（ＣＬＰ）模型和腹腔植入含活菌纤维蛋白凝块的模型。这两种模型操作简单、可重复性强，在大动物和小动物均适用。其主要优点是动物具有与人类脓毒症相似的高动力型心血管反应，即心输出量升高、全身血管阻力降低。同时，动物体内的细胞因子反应也类似于临床脓毒症患者，使之可用于脓毒症时机体炎症反应平衡和失控方面的研究。从总体来看，在进行了充分的液体复苏和适当辅助治疗（如抗生素治疗）时，这类模型与临床脓毒症有一定的相关性，可用于治疗脓毒症或脓毒性休克新药的临床前观察。其优点具体表现为：（１）对于ＣＬＰ模型而言，无须特意准备接种物（例如细菌的种类和数量）；（２）这两种动物模型都发生菌血症和渐进性脓毒症症状及体征，几天后可进一步出现心血管系统衰竭和死亡，其病理过程与临床情况贴近；（３）适用于大或小的动物；（４）动物的症状和表现慢慢发生并逐渐恶化，最后导致脓毒性休克，于数天内死亡。发病过程较长，有利于观察和进行各种干预；（５）模型复制后即可诱发动物体内产生大量细胞因子，血中细胞因子水平改变的时机及维持时间与临床脓毒症患者类似；（６）可引起与人类脓毒症或脓毒性休克相似的早期高动力型（高排低阻）及晚期低动力型（低排高阻）的血流动力学变化。当然，这两种模型也存在着不足之处。例如，在血凝块模型中，不能手术清除感染灶，这一点与临床情况不太吻合。然而，当进行液体复苏或抗生素等辅助治疗时，这两种模型与临床情况比较贴近。ＣＬＰ模型主要是使细菌从受损的内脏漏入腹腔引起腹腔内感染，其缺点主要是感染细菌的量难以控制。这可以通过应用大动物来解决，但同时又带来另一个问题，即大动物个体差异较大，往往干扰实验结果。而直接将含菌物接种到动物腹腔在一定程度上可以控制感染的严重程度。此外，如果动物太小，血量太少，有关血液检测指标的测定有一定困难。这两种模型较适用于检验某药物能否改善严重脓毒症或脓毒性休克预后的临床前期试验。３．２　血管内输注活菌模型此模型优点是一次性大量注入后可在短时间内出现血压下降等休克症状，但与临床情形还存在很大差别。尽管在脓毒症的研究中许多实验采用了一次性或短时间内（１～４小时）经静脉输注大量活菌［１０９～１０１０　菌落形成单位（ＣＦＵ）／ｋｇ］　的动物模型，而且采用细菌攻击制作模型具有操作方便、可重复性好等优点，但血管内输注模型与临床脓毒症有着明显的差异。首先，在临床脓毒症中，大多数患者体内的细菌并不是一次性大量侵入的，而是在一定时期内从感染灶持续不断地进入血循环。此外，在内毒素血症时，炎症反应对机体主要是损害效应。但临床病例中，大多数脓毒症患者常存在侵入性细菌感染，而要控制和清除这些细菌则需要机体炎症反应的帮助。因此，在探讨脓毒症的发病机制时，体内是否存在活菌将会对实验结果带来很大影响，甚至得出截然不同的结果。具体不足是：（１）一次性大剂量静脉注入细菌与临床情况不符，脓毒症患者细菌感染常常是由局部逐渐扩散入血的。类固醇、抗ＴＮＦ－α抗体等都在使用这些模型的灵长类动物上显示出疗效，但最后都没有通过严格对照的临床试验；（２）一次性大量细菌在短时间内进入血循环，很快造成心血管系统功能紊乱，因此不出现脓毒症患者特有的早期高排低阻型血流动力学特点，而是一开始即呈现低排高阻型血流动力学改变；（３）病情发展快，存活时间短，很多脓毒症症状表现不明显；（４）一次性静注大剂量活菌（＞１０９～１０１１　ＣＦＵ／ｋｇ）对机体的影响是中毒而不是感染，因为常用的大肠杆菌为０８６及０１１１菌株。此类菌株为血清敏感型，入血后很快就被血清灭活，失去在动物体内繁殖的能力。血中可出现与脓毒症患者相似的细胞因子反应，但为时短暂，且产生量大，与临床实际很不一致；（５）动