细胞培养-第3章

细胞增殖和分化是细胞生命进化中获得的基本属性。 组成人体结构、功能和生长发育的基本单位的细胞，是 已发生了高度分化的成分。表现在人体细胞与细胞间呈 现着高度的相互依存性、和个体细胞相对失去独立性。 从受精卵形成开始，细胞的两个基本过程增殖和分化， 便协调地进行着。增殖使细胞数量增多，分化使机体结 构和功能多样化，最终演变形成完整的人体。每个细胞 的生命活动均听命于外源信号(来自其他细胞)，通过相关 基因的调控，使之发生增殖或分化的表达。当细胞被离 体培养后，信号来源切断，特定基因分化表达减弱或停 止。而进化中保守的细胞增殖活动却可维持，遂使体内 外细胞出现了差异。
原代神经细胞
1.细胞来源：新生24h内Wistar大鼠大脑皮质；2. 培养天数：9天；3. 放 大倍数：倒置显微镜×400；4. 培养基种类：DMEM＋1%N3＋10％马 血清
神经元
1.细胞种类：原代大鼠脑皮质神经元；2.培养天数：原代3d；3.放大倍数： X100；4.培养基种类：DMEM/F12+2%B27；5. 细胞状态与特征简述：细 胞体折光性强，核仁明显，突起较多，并且互相交织成网状。
第 1节
体外培养细胞的生物学特点
体外培养细胞源于体内，基本的生物学规
律和体内相同，但与体内又有差别。
体内、外细胞的增殖方式相同，均依赖于
有丝分裂，其差异的关键在于细胞的分化，细 胞分化是检测细胞差异的核心问题。
一、 培养细胞分化状态的变化
体内细胞在生长发育过程中，始终受到三方面的影响和调 节：体外环境的影响；体内神经-体液因素的调节；细胞与局 部微环境的相互作用。 （一）体内外细胞差异 体外培养细胞由于失去动态平衡的相对稳定的环境，易 发生各种改变，主要表现为： ● 失去原有的组织结构和细胞形态 ● 分化特征减弱或不显，原来各种各样的分化细胞，逐渐 失去各自的形态与功能“个性”，形态和功能趋于单一化， 出现类似“返祖”现象。 ● 发生转化，获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。
胞也可呈悬浮生长。
第3节 体外培养细胞的生长和增殖过程
传代(passage)：细胞增殖达到一定密度时，需要分离
成纤维细胞 1.细胞种类：单个成纤维细胞； 2.培养天数：原代后培养2天； 3.放大倍 数：10×10； 4.培养基种类：DMEM+10%FBS； 5.细胞状态与特征简述： 细长梭形。
新生SD大鼠肺成纤维细胞(原代)： 1.细胞种类：鼠肺成纤维细胞； 2.培养天数：48h；3.放大倍数：10×10； 4.培养基种类：RPMI1640+10%小牛血清；5.细胞状态与特征简述:细胞呈梭 形，有伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长。
贴附有两方面含义，一是细胞与细胞之间的接触，二是 细胞与细胞外基质的结合。体内细胞的粘附是全方位的， 具有复杂的立体特征，体外培养细胞贴附的支持物为一平 面。体外培养细胞形态常表现有单一化的倾向，因此在判 定细胞形态时，很难再按体内细胞标准确定，只能大致分 类：
1.成纤维细胞型
形态与体内成纤维细胞形态相似，胞体呈梭形，长 条形或不规则三角形，核呈卵圆形，胞质向外伸出2～3个 长短不同的突起。生长时多呈放射状、火焰状或旋涡状走 行。除真正的成纤维细胞外，凡起源于中胚层的细胞在体 外培养时，一般表现这种形式，如心肌、平滑肌、成骨细 胞、血管内皮等。此外在培养中的细胞凡形态与成纤维细 胞类似时，皆可称为成纤维细胞。
上皮细胞的拉网现象
1.细胞种类：HeLa细胞；2.培养天数：培养2天；3.放大倍数： ×200； 4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清； 5.细胞状态与 特征简述:细胞贴壁生长。
Hep-2细胞： 1.细胞种类：人喉癌上皮细胞；2.培养天数：2d，细胞倍增时间 -24h左右；3.放大倍数：倒置显微镜 100倍 ；4.培养基种类： RPMI1640+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述:细胞低密度时呈 梭状生长，高密度时呈上皮状。
第三章 体外培养物 的细胞生物学
体外培养物的生物学特征具有两重性，一方面 细胞来源于体内，其基本生物学特征仍与体内细胞 相似，乃所谓“万变不离其宗”。另一方面，生长 环境与体内相比又有很大差别，尤其是失去在体内 时有机整体的调节机制，许多生物学行为发生改变， 如形态结构和增殖规律等，此为“入乡随俗”。 体外培养细胞生物学，即有关细胞在体外培养 条件下的细胞生物学行为，具有其本身的特点和规 律。
NIH3T3细胞转染绿色荧光蛋白基因后
2.上皮型细胞：
起源于内胚层和外胚层的细胞，体外培养时基本都呈 现上皮型。如皮肤的表皮、消化道及呼吸道上皮细胞、血 管内皮细胞、肝、胰和肺泡上皮等组织，以及上皮源性的 鳞癌细胞等。并非所有内胚层和外胚层来源的细胞体外培 养时都呈上皮型细胞，如神经细胞起源于外胚层，但在培 养时不呈上皮型。
4. 恶性肿瘤细胞可在体外无限传代。
第2节 体外培养细胞的生长类型
根据培养细胞是否贴附在支持物上生长的特性， 分为两大类：
一、贴附型细胞
大多数培养细胞属之，只有贴附在支持物上才能生长的细
胞称贴附型细胞或锚着依存性细胞(anchorage-dependent cells)。 这些细胞在体外环境中需要贴附于某固相表面才能生存和生长， 易失去它们在体内时原有的特征，细胞分化现象常变得不显著。 形态上常表现为单一化的现象，并常反映其胚层起源，呈现类 似“返祖现象”。来源于内、外胚层的细胞多呈上皮型，中胚 层的易呈成纤维型。供体越幼稚“返祖”越明显。
(二) 超微结构 1.透射电镜下，通常观察不到与在体细胞的 形态结构有明显差异，包括各种亚细胞结构。 2.扫描电镜：与在体细胞有较大差别，主要
在外形上。应用电镜可以观察到不同类型细胞的
特征性结构，明确细胞来源。
三、体外培养细胞的增殖能力
体外培养细胞的两大生命特征是分化增殖和
生长发育。
1. 培养细胞的增殖能力一般与该种细胞在 体内的增殖能力相仿。 2. 胚胎细胞>成年组织细胞。 3. 高度分化的细胞通常增殖能力较弱。
二. 体外培养细胞的形态学
与体内细胞基本相同，形态趋化单一化
(一) 大体形态 1.悬浮型 悬浮生长，不论细胞何种来源，胞体 均呈球形。 2.贴附型 贴附于支持物后，开始仍为圆形，很快 演变过渡成扁平形态。 通常经0.5～2h放射延展 细胞 (Radial Spread cell) 极性细胞(Polarized cell) (纺锤形、三角形或不规则多角形等多种形态)
4.多形型细胞：是形态上不规则的细胞，无明显 的规律且不稳定。细胞一般分胞体和胞突两部分， 胞突为长型，似丝状伪足，体外培养中最常见的多 形型细胞是神经元和神经胶质细胞。
注意：
培养细胞的形态分类，主要是根据在培养中的表 现和描述上的方便。
ห้องสมุดไป่ตู้
体外培养细胞的形态易受多种因素的影响而改变。
胚胎15天Wistar大鼠脊髓神经细胞 1.细胞种类：大鼠脊髓神经细胞； 2.培养天数：72h；3.放大倍 数：×200倍；4.培养基种类：高糖DMEM+10%胎牛血清；5.细 胞状态与特征简述：细胞呈梭形或圆形，有突起，贴壁生长。
HK-2细胞： 1.细胞种类：近端肾小管上皮细胞；2.培养天数：48h；3.放大 倍数：相差显微镜 X10 ； 4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛 血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈鹅卵石样贴壁生长，紧密 排列。
3.游走型细胞：细胞在支持物散在生长，一般不
连成片，细胞经常伸出伪足或突起，处于较活跃的 变形和游走状态，在培养器皿壁上的位置不固定， 因此外形不规则且不断变化。细胞内易出现色暗的 吞噬性颗粒，不稳定，有时难以与其他型细胞区别。
NIH3T3 1. 细胞种类：小鼠胚胎成纤维细胞；2. 培养天数：4d；3. 放大倍数： 10×10；倒置显微镜；4. 培养基种类：RPMI1640+10%小牛血清；5. 细胞 状态与特征简述：细胞呈长梭形，贴壁生长。
Fibroblast细胞：贴 壁2～3天的细胞 1.细胞种类：人肺部成纤维细胞；2.培养天数：1d -> 2d ->3d；3.放大倍数： 200倍；4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述: 细胞呈梭形，贴壁生长。
形态学特征：呈扁平不规则多角形，中央有 圆形核，细胞紧密相连成单层膜，细胞增殖数量 多时，生长时整块膜随之移动；处于上皮膜边缘 的细胞多与膜相连，很少脱落细胞群单独活动。 “铺路石样”：细胞紧密排列时，细胞呈多角形 或六角形； “拉网现象”(Netting)：在构成上皮细胞膜状生 长的细胞群中一些细胞常相互分离卷曲，致使上 皮细胞膜中形成网眼状空洞。可能与细胞分泌透 明质酸酶有关。
二、悬浮型细胞
细胞体外培养时不贴附在支持物上，而呈悬浮 状态生长，胞体始终为球形。如某些癌细胞和血液 细胞。 特点：①观察时不如贴附细胞方便。 ②细胞生存空间较大，可长时间生长，培 养效率高，适合大规模培养，便于做细胞代谢研究。 ③培养时操作容易 注意：贴附型细胞和悬浮型细胞不是一成不变 的，一定条件下悬浮型细胞可贴壁生长而贴壁型细
NIH3T3细胞 1.细胞种类：小鼠成纤维细胞； 2.培养天数：传代后48h； 3.放大倍数： 10×10 ； 4.培养基种类：DMEM+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述： 细胞贴壁生长，呈梭形，生长速度快，3d传一次代，美国国立卫生研究院 首先建系，故命此名。
NIH3T3细胞 1.细胞种类：Swiss小鼠胚胎成纤维细胞； 2.培养天数：传代后48h； 3. 放大倍数：10×10；4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清；5.细胞状态与 特征简述：细胞贴壁生长，呈梭形，生长速度快，3d传一次代，美国国立卫 生研究院(National Institute of Health)建立。
3. 光镜下特点
一般光镜下主要观察均质性和透明度。 健康的活细胞是均质透明的，结构极不明 显，可观察到核仁，细胞轮廓和内部结构不清。 相差显微镜可观察到细胞轮廓和内部结构。细 胞代谢不良或衰老时，细胞轮廓明显，反差加 大，胞质中出现颗 粒、脂滴和空泡等，反差很 大 的暗色小颗粒是变形的线粒体。 细胞形态结构与细胞在体外生存时间的长 短、种类等有直接关系。