细胞的传代培养
细胞的传代培养和细胞计数法
人癌细胞系传代培养
• 1. 观察：培养细胞生长活跃，占瓶底80%-90%，无污染； • 2.弃废液：倒掉瓶中培养液，尽量沥干液体； • 3. 漂洗：加1ml 0.25%胰蛋白酶消化液漂洗1次,弃去消 •
化液； 4. 消化：再加 1ml 消化液漂洗 1 次 , 倒掉大部分消化液 , 保留约0.3ml,室温放置3～5min； 5. 吹打：镜下看到细胞收缩变园 , 加 1 ～ 2ml 含血清培 养液, 用吸管按顺序轻轻吹打，避免出现泡沫； 6. 计数：取样,计数,调整细胞浓度； 7. 接种及培养：按104 细胞/ml接种,37℃、5%CO2 ，饱 和湿度条件下培养。
细胞活力测定－台盼蓝染色法
• 制备单个细胞悬液：105～106／ml • 染色：0.04%台盼蓝染色1 min (9滴细胞悬液 • •
＋1滴0.4%台盼蓝)， 3min 内计数 计数：用血细胞计数板镜下分别计数活细胞（染 料拒染）和死细胞（呈淡蓝色） 计算细胞活力： 活细胞率（％）＝［活细胞数／（活细胞数＋ 死细胞数）］×100
© ¨X 104£ Cell number£
M3SP2 M3SP2-pBp M3SP2-PTEN
2 3 4 5 6 Days in culture
7
8
DT = t × lg2 ÷ (lgNt－lgNo)
培养细胞的纯化方法
• • • • • • • •
机械刮除法：用细胞刮刮出不需要的细胞 差速粘附法：成纤维样细胞，上皮样细胞 选择性酶消化法：金属管套取需要的细胞 密度梯度离心法：细胞漂浮密度， Ficoll, Percoll 克隆化培养法：琼脂法，有限稀释法 免疫磁珠分离法：细胞表面标志，免疫磁珠 速度沉降法：细胞大小，离心淘洗技术 电泳分离法：细胞表面电荷
细胞传代培养和原代培养
细胞传代培养和原代培养一：原代细胞培养(一)原理：细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。
由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。
原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。
一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
(二)操作：1．取材：用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。
然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
用消过毒的剪刀剪开用和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。
置于无菌平皿中。
2．切割：用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。
移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
3．消化、接种培养：吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。
(三)结果:细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。
二：传代细胞培养(一)原理：体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。
培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
细胞的原代培养和传代培养
实验五细胞的原代培养和传代培养1. 实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程。
2. 实验指导细胞培养(cell culture)是从机体中将细胞取出后，在模拟生物体内生理条件下使其在体外生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命活动过程的方法。
进行细胞生物学、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
近年来，广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成为一种重要的生物学技术。
细胞培养一般可分为原代培养和传代培养。
所谓原代培养，是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。
原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。
一般动物和人的所有组织都可以用于培养，但幼体组织和细胞(如胚胎组织、幼仔的脏器等)更容易进行原代培养。
传代培养则是为了使体外培养的原代细胞或细胞株在体外持续生长、繁殖。
细胞持续生长繁殖就必须传代，并由此获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞。
培养的贴壁细胞形成单层汇合后，由于密度过大、生存空间不足而引起营养枯竭。
将培养的细胞分散，从容器中取出，以1：2或1：3以上的比例转移到另外的容器中继续进行培养，即为传代培养。
要使细胞在离体情况下生长繁殖，培养条件必须尽可能接近体内，除营养物质外，温度、PH值、生长因子等也至关重要。
此外，还应避免细菌及其他微生物的污染，重金属离子及有毒化学物质及放射线的影响。
贴壁细胞通过质膜表面的粘着蛋白贴附于培养瓶表面。
加入消化液可使粘着蛋白部分水解，从而使培养的细胞游离。
但消化时间不可过长，否则可能导致细胞解体死亡。
常用的消化液为胰蛋白酶和EDTA。
二者可分别使用，也可共同使用。
钙离子是二者的抑制剂，故实验中消化结束时，加入含有钙离子的全培养液，即可终止消化。
细胞的一代是指细胞从接种到分离再培养的一段时间，与细胞世代或倍增不同，在一代中细胞倍增3～6次。
细胞传代后一般经过三个阶段：游离期、指数生长期和停止期。
传代培养法
传代培养法是一种细胞培养技术，用于将原代细胞转化为可反复传代的细胞系。
这种方法的步骤如下：
1. 原代细胞适应阶段：原代细胞从组织中分离出来后，需要经过适应阶段以适应该培养环境。
在此期间，细胞逐渐适应贴壁生长，并逐渐分裂增殖。
2. 传代阶段：当原代细胞生长到一定阶段后，需要进行传代。
传代是将原代细胞接种到新的培养液中，以继续增殖生长。
传代过程中需要注意细胞的生长状态和密度，以避免过度生长或污染。
3. 维持培养：传代后的细胞系需要继续培养，以维持其生长和增殖。
在此过程中，需要定期更换培养液，以避免代谢产物的积累和细菌污染。
4. 细胞冻存：为了保持细胞的活力和稳定性，需要进行细胞冻存。
细胞冻存是将细胞保存在低温下，以延长细胞的寿命并保持其遗传稳定性。
传代培养法是一种常用的细胞培养技术，可以用于原代细胞的扩大培养和细胞的遗传稳定性研究。
同时，传代培养法还可以用于制备疫苗、基因治疗和组织工程等领域。
实验五 细胞的传代培养
实验5 细胞的传代培养一、实验目的熟练掌握动物细胞的传代培养法。
二、实验原理哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。
当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。
传代培养可获得大量细胞供实验所需。
三、仪器、材料与试剂1仪器CO2培养箱，倒置显微镜，超净台2材料培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，细胞。
3试剂完全培养基（RPMLl640或DMEM），0.25%胰蛋白酶，D-Hanks液。
四、实验步骤1.入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。
2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。
将培养用液置37℃下预热。
3.超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净。
4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气。
5.点燃酒精灯,取出无菌试管，刻度吸管；安上橡皮头；插在无菌试管内。
6.打开细胞培养瓶，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。
7.倒掉培养细胞的旧培养基。
酌情可用2-3mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。
8.加入胰酶消化液，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。
注意勿使细胞提早脱落入消化液。
9.加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7-10mL/大瓶，3-5mL/小瓶）制成细胞悬液，分装到新培养瓶中。
盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。
10.对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。
可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。
五、注意事项1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。
所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。
每次最好只进行一种细胞的操作。
细胞培养—传代—冻存—western blot等实验相关步骤
围绕siRNAs的相关实验详细步骤及总结实验一：细胞传代培养材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、培养瓶、含10%FBS 的RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、PBS、trypsin等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（SKOV-3）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；含10%FBS的RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
2、取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中，细胞成梭形连接，贴壁良好），弃旧培养基，PBS 2ml 清洗2次（切勿用力吹打）。
3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入，然后放平培养瓶，使贴壁细胞与trypsin充分接触，置于CO2培养箱2min左右（时间不能太长，以免损伤细胞）。
4、往培养瓶中加入1640 1~2ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000 r/min，5min。
5、弃上清液，加入少量10%FBS的1640培养基使成细胞悬液。
6、分装，按1:2~3传代，每瓶4~5ml。
倒置显微镜下观察（细胞突起消失变圆形，细胞间隙等距），标记。
7、放入CO2培养箱中培养，第二天观察生长状况。
总结：1、在用离心机时，看清楚是RCF还是RPM；调节Temp.以及Time。
2、在用移液枪吸出trypsin充分消化后的细胞后，须知用少量培养液清洗一下培养瓶，并将清洗液移入离心管中。
3、每取用一个容器，拧开或者拧上盖子时，注意在酒精灯上旋转一圈。
另外，记住用酒精棉球经常擦拭台面。
4、在用移液枪或者吸管混匀细胞悬液过程中，动作轻柔，避免产生气泡等。
实验二：细胞冻存材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、冻存管、RPMI —1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、FBS、PBS、trypsin、DMSO等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（OVCAR-3）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；FBS、RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
细胞传代培养实验步骤
细胞传代培养是生物学研究中常用的实验技术，用于保持细胞系的稳定性和活力。
以下是细胞传代培养的一般步骤：
培养基准备：准备适当的培养基，包括生长因子、营养物质和抗生素（如果需要）。
确保培养基的配制符合细胞系的特殊需求。
细胞检查：使用显微镜检查细胞的形态、数量和健康状态。
确保细胞处于适当的生长状态，没有受到感染或其他异常。
细胞收获：从之前的培养瓶中将细胞收获下来。
这通常涉及用胰酶等酶类来解离细胞，使其从培养瓶表面脱离。
细胞计数：使用血球计数板或自动细胞计数仪等工具，计算细胞的数量。
这有助于确定传代时应该用多少细胞。
传代操作：将收获的细胞按照既定的比例重新分配到新的培养瓶中。
传代的目的是dilution 细胞，以确保它们能够继续健康地生长。
培养新的细胞群：将传代后的细胞放入培养箱中，提供适当的环境条件（温度、湿度、CO2浓度等），促使细胞继续生长。
观察细胞生长：在培养过程中，通过定期使用显微镜观察细胞的形态和生长状态。
确保它们没有发生异常变化。
培养基更替：根据需要，定期更换培养基，以提供新的营养物质和保持适当的环境条件。
细胞冻存（可选）：如果需要，可以将一部分细胞冻存起来，以备将来的实验使用。
冻存细胞是为了防止细胞系的丧失或污染。
以上步骤是一般细胞传代培养的基本流程，具体操作可能会根据不同的细胞系、实验目的和实验室条件而有所调整。
在进行实验前，请确保你了解所使用细胞系的特性和培养条件。
细胞传代的过程及注意事项
细胞传代的过程及注意事项
细胞传代是细胞培养中最常见的操作，它是将已经在体外培养的细胞
放置到新的培养基中，继续生长繁殖的一种方法。
传代的过程一般包括准
备培养基、细胞膜解析、细胞数量细胞的复制、再次放置细胞、监测细胞
增殖等步骤。
1、培养基的准备：通常，将培养基煮沸后冷却至室温，加入必要的
抗生素和其他物质后进行搅拌均匀。
2、细胞膜解析：将要传代的细胞用叉子放入悬浮于培养液中，再加
入过氧化氢酶以解析细胞膜，具体方法是将培养基中的细胞分散成一个单层，逐步加入过氧化氢酶直到达到细胞解析的程度。
3、细胞数量细胞的复制：将细胞数量复制到前面所预定的细胞比例，使细胞保持初始比例，为传代提供有利条件。
4、再次放置细胞：将复制完成的细胞液再次放置在新的培养基中，
细胞培养室中的空气湿度和温度都必须维持在合适的范围，使细胞繁殖进
行得顺畅。
5、监测细胞增殖：在每次传代后，一定要记录下新培养基中细胞的
数量、形态和其他特征，以便确定新培养基的质量。
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产物的影响而发生密度抑制
（三）停滞期： 即细胞数量达到饱和密度后，细胞 与营养液的交换面积减少，代谢产物积 累，pH下降细胞停止增殖，进入停滞期。 在此时应及时进行传代，否则因细胞 中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再 传1-2代后，细胞才能恢复。
细胞的传代培养操作
1、悬浮细胞
可采用加入等量新鲜培养基后直接吹
（二）指数生长期：
细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞 分裂指数（Mitotic index，MI）表示， 即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。
体 外 培 养 细 胞 分 裂 指 数 介 于 0.10.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、 温度等影响。
指数生长期是细胞活力最好的时期，可对 细胞进行各种实验 指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断 增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触 汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则 无接触抑制现象。 癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢
刚加入
合适
过头
4、加入1～2滴管含有血清的培养液，反
复吹打细胞，使其成细胞悬液。
5、以1：2或1：3进行分装，补充新鲜培
养基，并在培养瓶上做好标记，注明代号、
日期，轻轻摇匀，37 ℃CO2培养箱培养。
6、观察：细胞培养24h后，即可观察培养
液的颜色及细胞的生长情况。
注意事项
1．传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间 的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。 每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使
所谓细胞“一代”，即从细胞接种到分离再培养 的一段时间。如某一细胞系为50代即该细胞已传 代50次。
贴壁细胞的生长规律
贴壁过程
培养细胞一代生长过程
（一）潜伏期（Latent phase）： 细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段 时间。 二倍体细胞该期时间长（24-96h） 连续细胞系时间短（10-30min）
用一套器材。培养用液应严格分开。
2．传代时间的掌握：每天观察细胞形态，掌握
好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，
折光性好，生长致密时即可传代。 3、消化时间的掌握
思考题
1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出 哪些是关键步骤?
2.细胞胞传代培养的目的是什么? 3.贴壁细胞和悬浮细胞传代方法上有什么不 同? 4.如何估计是否传代和传代的方式?
细胞的传代培养
本次课内容
复习细胞原代培养基本知识 细胞生长的规律 重点：细胞传代培养的操作过程 操作：HepG-2细胞的传代
原代培养
什么是原法的主要过程
细胞传代培养
概念：培养的细胞由于细胞增殖，数量增加，细 胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培养，将培 养的细胞分散，以1:2或l:3以上的比率转移到另 外的容器中进行培养，即为传代培养，也叫做继 代培养 一般细胞可传代10-50代。
打分散进行传代，或用离心法后，加入新
培养基后再吹打分散进行传代 2、贴壁细胞（重点）
贴壁细胞传代培养过程
1、实验准备：细胞培养用的器材灭菌、超净工作 台准备、实际预温、操作人员准备。
2、倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的D-Hanks 液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的 碎片。 3、加入2滴管0.25％胰蛋白酶消化液，消化2～ 3min，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起 出现空隙时，倒去酶液。