植物遗传育种学实验指导

园林植物遗传育种学

实验指导

实验一植物细胞的有丝分裂

实验二植物细胞的减数分裂

实验三染色体组型分析

实验四基因分离

实验一植物细胞的有丝分裂

一、实验目的

观察树木、花卉细胞有丝分裂各时期染色体的变化和特征，掌握根尖压片技术。

二、实验原理

有丝分裂是植物细胞数目增加的主要方式，常见于根尖、茎尖分生区的细胞，细胞经有丝分裂正确地把染色体分配给子细胞，形成两个染色体数目、内容一致的子细胞。有丝分裂是一个连续过程，根据染色体的形态特征可人为地将分裂期分为前期、中期、后期、末期等四个时期。

三、实验材料

发芽的杉木种子根尖；洋葱的幼根。

四、实验用具及药品

显微镜、载玻片、盖玻片、解剖针、刀片、镊子、吸水纸、小烧杯、大培养皿、冰箱、恒温水浴锅、量筒、天平。

醋酸、铁矾、苏木精、8－羟基喹啉、秋水仙素、二甲苯、盐酸、叔丁醇、无水乙醇、95%乙醇。

五、实验步骤

1．取材

⑴杉木种子根尖将杉木种子在自来水中浸泡24h，然后置培养皿中，在25℃下发芽，5～7天后胚根长达10～15㎜时将发芽种子取出。

⑵洋葱根尖培养将洋葱的鳞茎放在盛清水的培养皿内，在室温（20～25℃）下培养使其发根，待根长约10～15㎜时将根取出备用。

2．预处理为了阻止纺缍体的活动，获得更多的中期分裂相，同时使染色体相对缩短，便于染色体分散和计数，可对根尖进行预处理。

可用于预处理的化学药物有生物碱、苷类、酚类及其他物质，常用药物的浓度及处理时间如下:

（1）秋水仙碱:浓度为0. 04%～0.2%，处理2～5 h;

（2）a-溴代萘:饱和水溶液处理0.5～4 h;

（3）对二氯苯:饱和水溶液处理2～4 h;

（4）8-羟基喹啉:浓度为0. 002M，处理2～4 h;

上述各处理在室温下进行，若低温处理则用蒸馏水在1～4℃下处理24 h。

3．固定经过预处理的材料冲洗干净后，用卡诺氏固定液固定12～24 h，目的是将细胞迅速杀死，使染色体保持固定的形态。经固定的材料若不立即使用，可换到70%酒精中置于4℃下保存。

卡诺氏固定液的配制：冰醋酸：纯酒精=1：3(体积比)。

4．水解固定好的材料换入蒸馏水中洗净，然后放入1N盐酸溶液中，在60℃下解离5～20min，以便胞间层的果胶类物质解体，使细胞易于分散，便于压片，同时还可使染色体获得一个较为透明的背景。材料经解离后用蒸馏水洗涤数次，将材料中的酸洗净，以便染色。

1N盐酸溶液的配制：取8.25ml浓盐酸(比重1：19)，加蒸馏水至1000ml摇匀即可。

5.染色(铁矾—苏木精法) 苏木精是从墨西哥的一种木本豆科植物洋苏木的心材中提取的一种天然染料，是一种核染色剂，其本身对组织和细胞的亲和力不强，不能直接染色，而必须依靠硫酸铁铵和硫酸铝铵等盐类作媒染剂才能对细胞染色。由于苏木精适用范围广，染色效果好，且颜色的保存性也较好，故在植物制片技术中被广泛采用。

媒染剂的配制：将铁矾(硫酸铁铵)配成2～4%的水溶液，该溶液较易氧化变质，最好是现配现用；置冰箱中可延缓其氧化，能保存2个月。

染色剂的配制：一般用0.5%的苏木精水溶液，配制时先将苏木精结晶体溶于少量的95%酒精中，完全溶解后再加入蒸馏水，不加瓶塞，而用纱布包扎瓶口，使瓶内外空气能流通。将其静置一处使其缓慢氧化，室温下半个月至一个月可“成熟”，过滤后使

用。采用下列方法之一可加速染色剂的“成熟”：(1)在100ml新配制的苏木精溶液中加入3～5ml过氧化氢；(2)用煮沸的蒸馏水配制；(3)将新配好的苏木精溶液倾入一个较大的培养皿中，并在2m处用300～500瓦的水银弧光灯照射，同时不断搅拌染色液，约45min即可“成熟”。

染色程序：材料从固定液经50%酒精转入水中→用吸水纸将洗净的材料吸干→在2～4%的铁矾水溶液中媒染2～4 h，如加温(30～40℃)媒染，则可缩短至0.5～1 h→换水洗涤4～5次，每次约5min，务必将残留的铁矾充分冼净→用0.5%苏木精水溶液染色2～4 h或更长时间，染色时如发现染色液混浊，则表示铁矾未洗净，需重新换入水中洗涤后再染色→自来水洗5～10 min→用45%的醋酸分色和软化至合适。

常用的染色法还有醋酸洋红染色法，孚尔根染色法等，其详细操作步骤请参阅有关参考书。

6．压片取一染色适宜的根尖置于洁净的载玻片上，用刀片切除根冠和分生区以上的部分，留下的分生区约1～2mm，加一滴45%的醋酸，用镊子将根尖压碎，加盖玻片，再用带橡皮头的铅笔敲击盖玻片(注意勿将盖玻片错动)，使材料均匀分散成一层薄膜，表示细胞已经分离开，盖上滤纸用拇指紧压盖玻片即可。

7．镜检仔细观察制片，了解有丝分裂各时期染色体的行为，将合格的压片制成永久制片。

六、作业

绘有丝分裂各时期的细胞形态图，并说明染色体的行为特征。

实验二植物细胞的减数分裂

一、实验目的

观察植物花粉形成过程中的减数分裂过程及各时期中染色体的变化特征，掌握花粉母细胞涂抹制片技术。

二、实验原理

高等植物在形成花粉的过程中，花药内的某些细胞分化成小孢子母细胞（2ｎ），每个小孢子母细胞进行两次连续的细胞分裂，最后产生四个小孢子，每个小孢子内细胞核的染色体数目已经减半，成为单倍体（n）。根据染色体的变化特征，可人为地把减数分裂分为前期Ⅰ、中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ、前期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ、末期Ⅱ等八个时期。在适当的时机采集植物的花蕾，经固定后进行染色、压片，在显微镜下观察小孢子母细胞形成花粉时的减数分裂过程。

三、实验用具及药品

显微镜、天平、载玻片、盖玻片、解剖针、刀片、镊子、滤纸、冰箱、小烧杯。

醋酸、95%乙醇、铁矾、无水乙醇、苏木精、水合三氯乙醛、丙酸。

四、实验步骤

1．采集材料采集材料时要掌握恰当的时机，要采到正处于减数分裂期的花粉母细胞。不同植物取材时期不同，同一植物在不同地区、不同年份的取材时期也不同，马尾松在南昌地区为3月上旬，杉木为2月上旬，具体哪一天因当年的气温而异，一天中以6～9时为宜。

2．固定采回来的材料用卡诺氏液固定24h左右，然后放入70%的酒精溶液中低温保存。

3．染色用醋酸－铁矾苏木精染色，其配制方法如下：

A液：2g苏木精溶于100ml150%的丙酸或冰醋酸

B液：0.5g铁矾溶于100ml150%的丙酸或冰醋酸

染色液：将A液和B液按1：1比例混合，并在每5 ml混合液中加2g水合氯醛，充分溶解、摇匀。

A液能较长久地保存，染色液一般只能保存一个月，而在两周内使用效果较好，以后会逐渐产生沉淀而失效。

4．压片压片时，用镊子直接从固定液或保存液中取出材料，置于滤纸上吸去多余的固定液，将花药转移到洁净的载玻片上，加一小滴染色液，用镊子或刀片切破花药，并轻轻挤压花药，使花粉母细胞从切口逸出，清除花药壁残渣，加盖玻片，稍停片刻，在盖片上加一滤纸吸去多余的染色液，压片。

5．镜检在显微镜下观察减数分裂各时期染色体的行为。