L-NNA对碱烧伤后角膜NO含量和眼部炎症影响的实验研究

华中科技大学同济医学院硕士学位论文L-NNA对碱烧伤后角膜NO含量及眼部炎症影响的实验研究姓名：武犁申请学位级别：硕士专业：眼科学指导教师：邱良秀2002.4.1华中科技大掌同济匮掌院Ｌ—ＮＮＡ对碱烧伤后角膜ＮＯ含量及哩塑邀癣影响的实验研究华中科技大学同济医学院附属同济医院眼科研究生：武犁导师：邱良秀副教授摘要目的：探讨一氧化氮（ＮＯ）在角膜碱烧伤病理过程中的作用，以及氮６一硝基一左旋精氨酸（Ｌ—ＮＮＡ）对其影响，为寻找角膜碱烧伤的有效治疗方法提供理论依据。

方法：选用ＳＤ大鼠制作角膜碱烧伤模型，将实验动物随机分为３组：角膜未作碱烧伤处理组（对照组）；角膜碱烧伤组（碱伤组）：角膜碱烧伤后腹腔内注射Ｌ—ＮＮＡ组（治疗组）。

于ｌ、４、７、ｌＯ、１３天每组各取６只大鼠采用酶法和免疫组化染色分别检测角膜组织中Ｎ０含量以及ｉＮＯＳ的表达情况。

取角膜组织切片及房水涂片ＨＥ染色分别观察角膜组织及房水中炎症细胞渗出情况，定期于裂隙灯下观察角膜形态学改变。

ｌ结果：与对照组相比，碱烧伤后大鼠角膜组织中ＮＯ含量在不同时＼期均升高（Ｐ＜Ｏ．０５），并于第４、７天达最高峰（Ｐ＜Ｏ．０１）；角膜ｉＮＯＳ表达增强，主要表达于炎症细胞如中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞及少量巨噬细胞胞浆中。

腹腔内注射一定剂量Ｌ—ＮＮＡ治疗后，治疗组角膜组织中Ｎ０含量较同期碱伤组下降（Ｐ＜０．０５），与对照组无显著性差异；角膜ｉＮＯＳ表达与碱伤组相近；房水中炎症细胞渗出较碱伤组明显减少华中科技大掌周济匮．掌院硕士掌位论文（Ｐ（０．０５）；角膜形态学观察可见角膜炎症反应较碱伤组减轻。

）／结论：ＮＯ可能参与了碱烧伤后的组织损伤过程。

腹腔内注射Ｌ—ＮＮＡ治疗可以降低角膜组织中ＮＯ含量，减轻局部炎症反应，提示一氧化氮合酶（ＮＯＳ）抑制剂有成为角膜碱烧伤有效药物的可能性。

关键词：角膜碱瘫旃７一氧花氮氮。

一硝基一左旋藉蚤酸诱导型一氧化氮台酶Ｌ／／兰！兰兰查兰璺兰苎兰堡兰兰兰竺兰！ＬＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＬ—ＮＮＡｏｎＮＯｃｏｎｔｅｎｔｉｎｃｏｒｎｅａａｎｄｏｃｕｌａｒｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎａｆｔｅｒａｌｋａｌｉｂｕｒｎｓＰｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅ：ＷｕｌｉＴｕｔｏｒ：Ｐｒｏｆ．ＱｉｕＬｉａｎｇｘｉｕＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，Ｔｏｎ自ｉＨｏｓｐｉｔａｌＡｆｆｉｌｉａｔｅｄｔＯＴｏｎ自ｉＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡＢＳＴＲＡＣＴｏｂｊｅｅｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｏｌｅｏｆＮＯｉｎｔｈｅｐａｔｈｅｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｏｆｃｏｒｎｅａｂｕｍｓｂｙａｌｋａｌｉ，ｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｔｏｓｅａｒｃｈｆｏｒｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒｃｏｒｎｅａｂｕｍｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＳＤｒａｔｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｎｄｗｅｒｅｄｅｖｉｄｅｄｉｎｔｈｒｅｅｇｒｏｕｐｓａｔｒａｎｄｏｍ：ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｂｕｍｓｇｒｏｕｐ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐ．ＮＧ＿ｎｉｔｒｏ－Ｌ—ａｒｇｉｎｉｎｅ（Ｌ—ＮＮＡ）ｗａｓａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄｉｎｔｒａｐａｒｉｔｏｎｉａｌｌｙｐｅｒｄａｙ．Ａｔ１，４，７，１０，１３ｄａｙａｆｔｅｒａｌｋａｌｉｂｕｒｎｓ，ＥｎｚｙｍｅｅｓｓａｙａｎｄｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅＮＯｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｄｕｃｉｂｌｅＮＯＳ（ｉＮＯＳ）．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙｓｌｉｔ・ｌａｍｐａｔｉｎｔｅｒｖａｌｓ．ＲｅｓｕｌｔＮＯｃｏｎｔｅｎｔｉｎｃｏｒｎｅａｉｎｃｒｅａｓｅｄａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅａｆｔｅｒａｌｋａｌｉｂｕｍｓｉｎｃｏｎｔｒａｓｔｔｏｃｏｎｔｒｏｌｓａｎｄｐｅａｋａｔ４‘“ａｎｄ７”ｄａｙ（Ｐ＜０．Ｏ１）．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉＮＯＳｗａｓｅｎｈａｎｃｅｄ．ＮＯｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｂｕｍｓｇｒｏｕｐ（Ｐ＜Ｏ．０５）．Ｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｂｕｍｓｇｒｏｕｐｔｈｅｃｏｕｎｔｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｅｌｌｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎａｑｕｅｏｕｓｈｕｍｏｒ．华中科技大掌间济匮掌院硕士掌位论文Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｃｏｒｎｅａｆｏｕｎｄａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎｏｆｃｏｒｎｅａｌｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＮＯｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｉｎｔｈｅｔｉｓｓｕｅｄａｍａｇｅｐｒｏｃｅｓｓａｆｔｅｒａｌｋａｌｉｂｕｍｓａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｕｇｇｅｓｔｓＮＯｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｐｒｏｍｉｓｅｄｔｏｂｅａｐｏｔｅｎｔｉａｌｄｒｕｇｆｏｒｃｏｒｎｅａａｌｋａｌｉｂｕｍｓ．ａｌｋａｌｉ・－ｂｕｍｓＮＯＬ・－ＮＮＡｉＮＯＳＫｅｙｗｏｒｄｓｃｏｒｎｅａ４前言角膜碱烧伤是眼化学伤中比较常见的一种。

众所周知，由于碱既能溶于水，又溶于脂肪，它与组织蛋白结合后形成碱蛋白化合物，该化合物溶于水，不能阻挡残余碱渗入深部组织。

同时，碱又溶于脂肪使之皂化，故而碱易透过组织的脂肪成分而达深部，对组织形成持久破坏作用。

因此碱烧伤的后果非常严重，常最终致盲。

寻找有效的治疗手段一直是眼科工作者努力的目标。

有研究表明，角膜碱烧伤常伴有多形核白细胞的浸润，多形核白细胞在吞噬过程中产生大量超氧阴离子自由基，对组织产生损害以致发生角膜溃疡甚至穿孔。

由于研究的深入，现发现免疫机制在角膜碱烧伤病理过程中起重要作用。

一氧化氮（ＮｉｔｒｉｃＯｘｉｄｅ，ＮＯ）是新发现的小分子内源性的反应气体，既是不可缺少的神经递质和免疫活性物质，又具有细胞毒性作用。

Ｎｏ与超氧阴离子作用形成强的氧化物，对组织具有更强的氧化损伤作用。

目前，ＮＯ是循环、呼吸、消化、内分泌、神经、免疫生理等方面研究的热门课题之一。

然而有关ＮＯ与角膜碱烧伤的相关研究国内外报道尚少。

本课题建立大鼠角膜碱烧伤的动物模型，观察角膜Ｎ０含量和诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）表达变化，探讨Ｎｏ在眼部碱烧伤病理过程中的作用。

同时应用一氧化氮合酶（ＮＯＳ，ＮｉｔｒｉＣＯｘｉｄｅＳｙｎｔｈａｓｅ）的抑制剂氮Ｌ硝基一左旋精氨酸（Ｌ—ＮＮＡ），观察Ｌ－ＮＮＡ对碱烧伤后角膜ＮＯ含量，ｉＮＯＳ表达以及眼部炎症反应的影响，为寻找角膜碱烧伤有效治疗手段提供依据。

材料与方法一、主要仪器ｌ、ＹＺＳＥＩ型照相裂隙灯显微镜苏州医疗器械厂２、ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ５０型显微镜３、石蜡切片机４、多媒体医用彩色图像病理分析系统ＭｐｌＡＳ－５００型５、ＡＢ—Ｓ／Ａ基础型电子分析天平ＡＢ２０４／一Ｓ／Ａ瑞士产６、高速冷冻低温离心机Ｈｅｒａｅｕｓ德国产７、分光光度计ＵＶ一７２１上海第三分析仪器厂８、手术显微镜ＴＡＫＡＧＩＭＦＧＣＯＳＴＤＪａｐａｎ二、主要试剂１、ＮＧ—ｎｉｔｒｏ—Ｌ－ａｒｇｉｎｉｎｅ（Ｌ－ＮＮＡ）美国Ｃａｇｍａｎ公司产品２、ｉＮＯＳ抗体美国ＳＡＮＴＡＣＲＵＺ公司产品３、一氧化氮试剂盒（酶法）深圳晶美生物工程有限公司三、实验方法（一）角膜碱烧伤动物模型的制备与实验动物分组ｌ、实验动物：选用ＳＤ大鼠９０只，雌雄不拘，体重１５０～２００９，健康无眼疾（华中科技大学同济医学院试验动物中心提供）。

２、动物分组：９０只ｓＤ大鼠随机分成３组，各３０只，分别为角膜未作碱烧伤处理组（对照组）；角膜碱烧伤组（碱伤组）：角膜碱烧伤后腹腔内注射Ｌ－ＮＮＡ组（治疗组）。

３、角膜碱烧伤动物模型制备方法：将ＳＤ大鼠给予３％水合氯醛（ｉｍｌ／１００９体重）腹腔内注射麻醉，全麻后０．５％地卡因点眼，充分开睑，灭菌小棉签吸去结膜囊内液体。

用直径３ｍｍ的圆形滤纸片浸入ｌＮ华中科技大学周济匪掌院ＮａｏＨ溶液中约ｌＯ秒饱和后取出，轻触干滤纸以吸去过多的碱液，然后将滤纸片贴敷于大鼠右眼角膜中央，１分钟后取下，立即用无菌生理盐水冲洗结膜囊２分钟。

同样操作处理左眼。

４、治疗组给药方法：角膜碱烧伤后立即给予腹腔内注射Ｌ－ＮＮＡ１０ｍｇ／１００９，每日１次，直至动物被处死。

（二）标本获取与处理对照组，碱伤组，治疗组于造模后第１，４，７，１０，１３天分别随机抽取６只动物，在裂隙灯下观察角膜情况后，颈椎脱臼法处死动物并取出眼球，其中６只眼球用于角膜ＮＯ含量检测和房水炎症细胞计数，６只眼球用于免疫组化检查和组织切片ＨＥ染色。

ｌ、角膜混浊水肿程度的检查参照Ｍａｔｓｕｔｏ分类法“１，将角膜混浊水肿分轻、中、重度三级；轻度：角膜轻度混浊、增厚，虹膜纹理清晰可见。

中度：角膜明显混浊、增厚，但隐约可见虹膜纹理。

重度：角膜完全混浊，呈乳白色，无法窥见眼内结构。

碱伤组与治疗组大鼠定期裂隙灯下观察并记录大鼠角膜混浊水肿程度，并作裂隙灯显微镜照相。

２、酶法测定角膜组织中ＮＯ含量①大鼠颈椎脱臼法处死，迅速取出眼球，在冰环境中于手术显微镜下完整取出角膜。

②以分析天平称重，加入新鲜三蒸水置匀浆器内于冰水环境中制成１０％匀浆。

③将匀浆倒入试管中，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。

④取出上清液０．Ｉｍｌ，加入测定管。

另取两管分别加入０．ｉｍｌＩ（ＮＯ。

和三蒸水，为标准管和空白管。

⑤三管内各加入试剂１Ｏ．Ｉｍｌ，试剂２０．ｉｍｌ，轻轻混匀，３７。

Ｃ水浴ｌ小时。

⑥各管分别加入０．５ｍｌ试剂３、试剂４，混匀，室温放置ｌＯ分钟。

⑦用分光光度计于５３０ｎｍ波长处，以空白管调零，测定各管的ＯＤ值。

⑧按下试计算Ｎ０的含量一氧化氮（ｕｍｏｌ／Ｌ）＝测定管ＯＤ／标准管０ＤＸ１００ｕｍｏｌ／Ｌ３、免疫组化检测角膜组织中ｉＮＯＳ表达［１］同上方法取出眼球，浸入１０％甲醛溶液中固定过夜。

［２］石蜡包埋制成蜡块。

［３］石蜡切片，脱蜡至水。

［４］ＰＢＳ清洗３ｍｉｎＸ３。

［５］３％过氧化氢溶液，３７。

Ｃ，孵育５－１０ｍｉｎ，以消除内源性过氧化物酶的活性。

［６］双蒸水充分洗涤。

［７］胃蛋白酶消化３７℃，３０ｍｉｎ。

［８］ＰＢＳ清洗３ｍｉｎ×３。

［９］每张切片滴加非免疫动物血清３７。

Ｃ孵育２０ｍｉｎ。

［１０］每张切片滴加一抗（１：ｉ００），３７。

Ｃ，１小时。

［１１］ＰＢＳ冲洗，３ｍｉｎｘ３。

［１２］每张切片滴加生物素一过氧化物酶标记的二抗，３７℃孵育１０一１５分钟。

［ｉ３］ＰＢＳ冲洗，３ｍｉｎ×３次。

［１４］每张切片滴加辣根酶标记链霉卵白素液，３７。

Ｃ孵育１０－１５分钟。

［１５］ＰＢＳ冲洗，３ｍｉｎ×３次。