小鼠胚胎成纤维细胞,NIH3T3贴壁培养
小鼠成纤维细胞原代培养
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养一.实验目的1．掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术和操作过程。
2．熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况的方法。
3．了解细胞原代培养与传代培养的原理和方法。
二.实验原理自17世纪下半叶Robert Hooke提出“细胞”概念直至20世纪中叶，细胞培养（Cell culture）才逐渐发展起来。
现代生命科学以及相关领域的研究前提是细胞的维持和增殖，因此，细胞培养不仅是细胞生物学的密不可分的组成部分，而且已经成为生物化学、生物物理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学和神经科学、甚至临床医学的重要内容。
细胞培养也是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。
如今，细胞培养已经成为生命科学和医学研究最常用的基础技术之一。
细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
细胞培养的直接目的是维持或扩增细胞数量。
依据取材于动物组织或培养细胞，细胞培养分为原代培养和传代培养。
1．原代培养（primary culture）是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。
但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
原代培养是建立细胞系的第一步，其最基本的方法有两种：组织块培养法和消化培养法。
组织块培养法是指直接从机体取下组织和器官，通过组织块直接长出单层细胞，该培养法是最常用的原代培养方法，其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。
组织块培养法操作过程简便、易行，培养的细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。
消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂的情况下，直接移植在培养瓶壁上，加入培养基立即进行培养的方法。
人鼠细胞实验报告
实验日期：2023年11月10日实验地点：细胞生物学实验室实验者：[您的姓名]指导教师：[指导教师姓名]一、实验目的1. 学习掌握人鼠细胞共培养的基本原理和操作方法。
2. 观察人鼠细胞共培养过程中细胞的生长状态和形态变化。
3. 探讨人鼠细胞共培养在生物医学研究中的应用。
二、实验原理细胞共培养是指将不同种类的细胞在同一培养体系中共同培养，以研究细胞间的相互作用和信号传导。
人鼠细胞共培养作为一种重要的实验模型，可以模拟体内多种生理和病理过程，为研究细胞生物学、发育生物学、免疫学等领域提供有力支持。
三、实验材料1. 人胚胎成纤维细胞（HEK293T）和鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）。
2. DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素混合液。
3. 细胞培养瓶、培养皿、移液器、显微镜、图像采集系统等。
四、实验方法1. 将HEK293T和NIH3T3细胞分别用DMEM培养基培养至对数生长期。
2. 将HEK293T和NIH3T3细胞按1:1比例混合，接种于培养皿中，放入培养箱中培养。
3. 观察细胞生长状态，记录细胞形态变化。
4. 在不同时间点，收集细胞进行染色、计数等分析。
五、实验结果与分析1. 细胞生长状态观察：在共培养过程中，HEK293T和NIH3T3细胞均能正常生长，细胞形态规则，细胞间连接紧密。
2. 细胞形态变化：在共培养早期，细胞形态无明显变化；随着培养时间的延长，细胞形态逐渐变得不规则，细胞间连接减少。
3. 细胞计数：在共培养过程中，HEK293T和NIH3T3细胞的数量均呈上升趋势，但共培养组细胞数量增长速度略低于对照组。
4. 细胞染色分析：共培养组细胞在染色后，可见细胞核、细胞质等结构清晰，细胞形态与对照无明显差异。
六、讨论1. 人鼠细胞共培养是一种重要的实验模型，可以模拟体内多种生理和病理过程，为研究细胞生物学、发育生物学、免疫学等领域提供有力支持。
2. 本实验结果表明，HEK293T和NIH3T3细胞在共培养过程中能够正常生长，细胞形态无明显变化。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤(3)
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤(3)第3步――ITSFn培养基在最少量培养基中选择神经前体细胞1.在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基2.并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3.保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基――大约每隔一天。
观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。
当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。
步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
第4步－N3培养基＋bFGF通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。
1.PBS洗涤，加入1-2ml 胰酶2.37℃孵育5分钟3.用4mlEB培养基终止胰酶活性，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。
4.将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。
5.将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。
24孔板接种3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。
6.2天后更换培养基第5步－N3培养基通过撤除bFGF使神经前体细胞分化1.细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基2.根据需要换液（大约每隔一天）3.分化10～15天后固定细胞移除培养基PBS洗涤加入4%福尔马林室温放置30分钟PBS洗涤2次储存于PBS.长期储存使用含0.01％叠氮化纳的PBS移植细胞的准备细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板）。
正如在前文体外分化中所描述的在移植之前4天开始形成胚状体。
通常再需要一天时间以便将胚状体移植入一10cm的培养皿。
移植1.将胚状体转移至一15ml 圆锥形管中放置3～5分钟使胚状体沉降下来。
FGFR1 的结构、功能及与疾病的关系
英文缩写词表aFGF acid fibroblast growth factorbFGF basic fibroblast growth factorbp base pairBSA bovine serum albumincDNA complementary deoxyribonucleic acidDEPC diethyl pyrocarbonatedNTP deoxybonuleotide triphosphateEDTA ethylene diaminetetraacetic acidFGF fibroblast growth factorFGFR fibroblast growth factor receptorGST glutathione S-transferaseh, min, sec hour, minitue, second.IPTG isopropyl β–D-thiogalacto-pyranosideKana kanamycinKD killo DaltamRNA messenger ribonucleic acidMTT 3-(4,5-dimethyl-thiazoyl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide PBS phosphate buffered salinePMSF phenylethyl- sulfonyl flurideRNase ribonucleaseRT-PCR reverse transcription- polymerase chain reactionSDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis SUMO small ubiquitin- related modifierTris trisaminomethaneYEPD Yeast Extract Peptone Dextrose mediumYNB yeast nitrogen base前言一、FGFR1的结构、功能及与疾病的关系成纤维细胞生长因子受体（Fibroblast growth factor receptor, FGFRs）是一个多基因家族，属于免疫球蛋白基因家族成员。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）是一类在小鼠早期胚胎内分化产生的多能干细胞。
培养和研究ESC可以为了解细胞发育和分化提供重要的实验材料。
下面将为您介绍小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤。
一、准备实验所需材料和器械：1.小鼠胚胎干细胞系（ES细胞系）。
2.ESC培养基：一般使用含有LIF（鼠胚性干细胞生长因子）的培养基，如DMEM/F12或DMEM培养基，添加血清、LIF等。
3.ESC传代培养基：与ESC培养基相同，但不含LIF。
4.ESC学习培养基：免LIF和血清的无血清培养基，可以用于学习ES细胞的分化能力。
5. ESC传递板（T25细胞培养板、10 cm细胞培养板等）。
6.培养皿：培养皿的选择可以根据不同的实验目的选用，如离体实验可以选择培养皿或培养碟等。
7.显微镜：用于观察和鉴定细胞形态。
8.细胞培养箱：用于多肽瓶、培养皿等细胞培养。
9.无菌注射器、移液器、离心管等常见实验器材，以及媒液和试剂。
二、实验步骤：1.将小鼠胚胎干细胞系解冻至细胞存储液解冻的方法，迅速转移到预先加热培养皿中。
添加完整的ESC培养基，将细胞孵育在37℃、5%CO2的培养箱中。
2.每两天更换一次ESC培养基，观察细胞的形态和生长情况。
当细胞接近80%的密度时，可以进行传代。
3.小鼠胚胎干细胞的传代通常采用机械法和酶解法两种方法。
机械法是直接使用离心管头吸吸细胞，然后用超声波吹散细胞，最后转入新的培养皿中。
酶解法则是先用胰酶等酶溶解细胞，形成单细胞悬液，然后接种入新的培养皿中。
4.传代完成后，继续在37℃、5%CO2的培养箱中培养细胞，并定期更换培养基。
5.ESC的分化实验通常采用去除LIF和血清的无血清培养基。
将小鼠胚胎干细胞移到含有学习培养基的培养皿中，观察和记录细胞的分化情况。
6.对于特定的实验要求，如体外器官培养、离体实验等，可以将小鼠胚胎干细胞移至特定的培养皿或装置中，进行相关实验。
实验室常用细胞株简介
纤维肉瘤
上皮细胞、贴壁
DMEM, 10% FBS
I-10
CCL-83
小鼠
睾丸癌
上皮细胞、贴壁 F-10, 15% HS 和 2.5% FBS
IEC-6
CRL-1592 大鼠
正常小肠
上皮样、贴壁
DMEM, 5% FBS,胰岛素 0.1μ g/m l
IM-9
CCL-159
人
骨髓瘤病人骨髓 成淋巴细胞、悬浮 RPMI-1640, 10% FBS
病
Saos-2
HTB-85
人
骨肉瘤
上皮细胞、贴壁
McCoy'5A, 15% FBS
SMMC7721
无
人
肝癌
贴壁、上皮样
RPMI-1640,15%FBS
SP2/0
ACC146 小鼠
杂交瘤
悬浮
IMDM,7.5%FBS
SW480 CCL-228
人
结肠癌
贴壁、上皮样
10%FBS,L15
SW620 CCL-227
KG-1
CCL-246
人 红白血病病人骨髓 骨髓白细胞、悬浮
IMDM, 20% FBS
KG-1a CCL-246.1 人 红白血病病人骨髓 骨髓白细胞、悬浮
IMDM, 20% FBS
L2
CCL-149 大鼠
肺
上皮细胞、贴壁
F-12K, 10%FBS
L6
CRL-1458 大鼠 骨骼肌成肌细胞
贴壁
DMEM, 10% FBS
DMEM,10%FBS
Vero-E6 CRL-1586 非洲绿猴
肾
贴壁、上皮样
MEM/EBSS,10%FBS
小鼠胚胎神经干细胞的分离及贴壁培养方法
小鼠胚胎神经干细胞的分离及贴壁培养方法杨骐昌;宋晓峰;韩平【摘要】Objective To develop a modified method of adherent culturing NSCs to replace the traditional suspension culturing method.Methods Neural stem cells(NSCs)were isolated from brain of fetal mouse at 15.5-day fetal age.In culture bottle which had been pre-coated with poly-L-ornithine hydrochloride/fibronectin(PO/FN),the cells were adherently cultured and passaged.The cell morphology was observed under inverted microscope.NSCs and their differentiated cells were identified by immunofluorescence.Results NSCs obtained in this study were successfully adherently cultured and expressed specific markers.Conclusion NSCs are successfully adherently cultured in this study.As compared with the traditional suspension culturing method,adherent culturing is simpler and has lower wastage of passage.It is easy to observe cell morphology and differentiation by this method.It is also helpful to culturing and storage of NSCs.%目的探索一种改进的贴壁培养神经干细胞的方法.方法从胚胎期为15.5d 的胎鼠大脑皮层中提取神经干细胞,在PO/FN(Poly-L-ornithine hydrochloride/Fibronectin)包被处理后的培养瓶中进行贴壁培养并传代,在倒置显微镜下观察神经干细胞的细胞形态,并通过免疫荧光法鉴定神经干细胞及其子代细胞进行分化操作之后的情况.结果原代神经干细胞细胞形态清晰,免疫荧光标记物明显.结论相对于传统神经球悬浮培养法该法处理简便,传代损耗低,容易观察到细胞形态和分化阶段,更有助于神经干细胞的培养和存储.【期刊名称】《华中科技大学学报（医学版）》【年(卷),期】2017(046)003【总页数】6页(P312-316,340)【关键词】神经干细胞;贴壁培养;包被处理;免疫荧光;悬浮培养【作者】杨骐昌;宋晓峰;韩平【作者单位】南京航空航天大学生物医学工程系,南京211100;南京航空航天大学生物医学工程系,南京211100;南京医科大学第一附属医院产科,南京210005【正文语种】中文【中图分类】R329神经系统是人体内起主导作用的功能调节系统，在神经系统的发育期间，神经干细胞(neural stem cells，NSCs)会向其他脑部区域迁移，并分化为特异性细胞[1]，提供了大量脑组织所需的细胞，其增殖与分化对神经发育起到至关重要的作用[2]。
新生小鼠皮肤成纤维细胞的分离培养与鉴定
鼠皮 肤分 离 培养 成 纤维 细胞 ， 建立 肿瘤 体 外模 拟 微环 境 提供 实 验材 料 和研 究基 础 。 为
【 键 词１ 生 小 鼠 ； 纤维 细胞 ； 外 培 养 ； 形蛋 白 关 新 成 体 波
【 中图分 类 号１ ３ ２ １ ９． Ｒ 【 文献 标 识码 】Ａ 【 章编 号】 １ ３ ７ １ ２ １ ）０（ 一 ０ — ４
１Ｄ ｐ ｒ ｎ ｆＲｅｐｒｔｒ ｄｃｎ ，ｔｅ ＦｒｔＡ ｆｉｔｄ Ｈｏｐｔｌｏ ｉｍｅ ｎｖ ｒｉ ，Ｆ ｊ ｎ Ｐｏ ｉｃ，Ｘｉｍ ｎ ． ｅ ａｔ ｔ ｏ ｓｉ ｏｙ Ｍｅｉｉｅ ｈ ｉ ｆｌ ｅ ｓ ｉ ｆＸ ａ ｎ Ｕ ｉｅ ｔ ｕｉ ｒｖｎ ｅ ｍｅ ａ ｓ ｉａ ａ ｓ ｙ ａ ａ ｅ ３ １ ０ ， ｈｎ ； ． ｐ ｒ ｎ ｆＩ ｍｕ ｏｏｙ Ｂ ｓ ｄｃ ｅＳ ｉ ｃ ｎｔｅＭｅ ｉａ Ｃ ｌ ｇ ｆ ｉｍｅ ｎｖｒｉ ， ｕｉ ６ ０ ３ Ｃ ｉａ ２Ｄｅ ａｔ ｔ ｍｅ ｏ ｍ ｎ ｌｇ， ａｉ Ｍｅ ｉｉ ｃ ｎ ｅｉ ｄｃｌ ｏ ｅ ｅｏ ａ ｎＵ ｉｅ ｔ Ｆ ｊ ｎ ｃ ｎ ｅ ｈ ｌ Ｘ ｓ ｙ ａ
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北京索莱宝科技有限公司
小鼠胚胎成纤维细胞，NIH3T3贴壁培养
细胞名称：小鼠胚胎成纤维细胞，NIH3T3
形态特性：成纤维细胞样
生长特性：贴壁生长
培养条件：DMEM-H(4.5g/L Glucose）+10%FBS
传代方法：1:3传代
冻存条件：细胞冻存液
特征特性：该细胞来自NIH/3T3，可作逆转录病毒的包装细胞。
细胞处理方法：
1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超
净台中操作。
2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%
的CO2的温箱中继续培养。
细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。
3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞
完全脱壁后加培养基吹打混匀，分瓶培养。
特别注意：（如使用公共实验室或初次接触细胞培养，建议添加双抗培养）
1.我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。
2.如签收时出现培养瓶壁破裂，漏液等情况请及时拍照并联系售后。
3.细胞任何售后问题，均需拍照存档并在2周之内及时联系客服。
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