HIF-1作为作用靶点的肿瘤临床治疗研究

【论文关键词】 HIF-1；肿瘤；调节机制；治疗靶点 【论文摘 要】 本文结合HIF-1 的结构和功能特点，详细综述了HIF-1 对肿瘤血管生成的主要调节机制，对以HIF-1 为作用靶点的肿瘤临床治疗前景作了简要展望。

现代研究认为，恶性肿瘤的显著特征是肿瘤细胞的大量增殖和转移。其中，细胞大量增殖导致的组织缺氧是肿瘤的基本微环境，缺氧可以刺激肿瘤细胞一系列基因产物的表达诱导微血管生成，新生微血管不仅为肿瘤细胞带来营养成分，带走代谢产物，同时肿瘤细胞也可以通过新生的毛细血管发生转移。近年的研究表明[1] ， 缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）可在基因水平上直接调控血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，并促进肿瘤生长。本文就HIF-1 与肿瘤的相关性研究作一简要综述。 1 HIF-1 的结构和功能 HIF-1 最先由Semenza 和Wang 于1992 年发现，将其作为被缺氧诱导的连接在EPO 基因诱导元件上的一个核因子 [2]。HIF-1 是由α 亚基和β 亚基组成的异二聚体转录因子，由A、B、C、D 四条链组成。其中A、B 链是DNA 分子，均由14 个碱基组成。C 链为β 亚基，与已知的芳香烃受体核转位蛋白（ aryldrocarbon receptor nuclear translocator ，ARNT）相同，其开放阅读框有2367bp 和2322bp2种，分别编码789 和774 个氨基酸，分子量为80kD。D 链是α 亚单位，人类HIF-1α 基因定位于14q21-24，含有826 个氨基酸，分子量为120 kD，是HIF-1 的调节和活性亚基[3]。HIF-1α 和HIF-1β 的共同特点：N 端具有基本螺旋- 环- 螺旋（ basic helix-loop-helix，bHLH）结构的碱性蛋白，其后紧随PAS（Per-ARNT-Sim）区域，bHLH 和PAS 区域主要介导异源二聚体的形成，以及负责与DNA 的缺氧反应元件（hypoxia response elements，HRE）结合[4]，另外在C 端具有一个或多个反式激活域（trans-activation domains，TAD），负责与转录起始复合物结合参与转录活化[5]。HIF-1α 的C-TAD 与N-TAD 之间576～785 位氨基酸序列为抑制结构域，能降低TAD 的活性，在常氧细胞中该抑制明显。另外，HIF-1α 还包含两个核定位信号（nuclear localization signal，NLS）：N-端核定位信号和C-端核定位信号，C-NLS 在HIF-1α 核定位方面发挥更为重要的作用。HIF-1α常氧状态下极不稳定，半衰期小于5～10 分钟，Huang LE 等[6]1998 年发现，在HIF-1α 401～603 区域， 有一个氧依赖降解区（ oxygen-dependent degradation domain，ODD），其中一部分与N-TAD重合，负责HIF-1的降解。当环境氧的浓度超过5%时，通过激活泛素–蛋白酶体路径，作用于HIF-1α的ODD 区，使其迅速降解。如果截去ODD 区，可以使HIF-1α 在有氧状态下保持稳定，并且仍可与ARNT 形成二聚体及与DNA 结合，此时即使环境不缺氧，它也具有完整的转录活性。HIF-1α 羧基端含有PEST–样基序，因富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸，其主要作用是加速常氧下ODD 介导的HIF-1α 蛋白经泛素–蛋白酶复合体途径降解。HIF-1 的两个亚单位中，HIF-lβ 与细胞的多种功能有关而不仅限于O2 代谢，HIF-1α 则仅与O2 代谢有关。HIF-1β 在细胞中组成性表达，而α 亚基是HIF-1 的调节和活性亚基。HIF-1α 蛋白常氧状态下极不稳定，但能在缺氧条件下保持稳定，并且是组织缺氧的内在标志[7]。 2 HIF-1 调节肿瘤血管生成的相关机制 大量的研究表明，在多数恶性肿瘤组织内，HIF-1 都有一定程度的表达，然而，HIF-1 在不同肿瘤中高表达的机制不尽相同，而这些不同的机制下诱导的HIF-1 的表达参与了肿瘤的不同的恶性生物学行为。Birnal 等[8]进一步研究发现HIF-1α 的表达亦与肿瘤细胞的增殖、浸润及转移能力相关，其表达越高，预后越差。大量新生血管形成及糖酵解增强是实质性恶性肿瘤的两个主要特征，正是这两个特征使得肿瘤细胞能够适应缺氧环境。HIF-1 下游 基因既参与血管生成，又参与无氧糖酵解，因此，HIF-1 在瘤细胞适应缺氧环境过程中起中心介导作用，是诱导肿瘤血管生成的核心分子[9]。HIF-1 调节血管生成的主要机制可分为VEGF 依赖途径和VEGF 非依赖途径两类。 2.1 VEGF 依赖途径 HIF-1 通过诱导VEGF 表达，特异地结合位于血管内皮细胞上的特异受体Flt-1 和KDR，促进内皮细胞生长，增加血管通透性，进而促进血管生成。VEGF 是血管生长的主要因子，各种类型细胞中VEGF 的表达随氧气浓度的降低而升高，如低氧培养的细胞VEGF mRNA 水平和蛋白明显升高，恢复正常氧张力时则回降；坏死区周围肿瘤细胞的VEGF mRNA 呈高度表达，说明局部低氧是肿瘤微环境内VEGF 基因表达的主要诱因。Maxwell 等[10]在小鼠皮下种植HIF-1β 突变的肝癌细胞，发现移植瘤生长缓慢，免疫组化示微血管密度显著减少，采用原位杂交技术发现VEGF mRNA 表达近缺失。Ravi 等[11]发现经转染HIF-1α 表达载体的HCT116结肠癌细胞，VEGF 蛋白表达显著增加，异种移植瘤生长速度加快，血管化作用增强。研究发现，HIF-1 通过增强VEGF 的转录活性与增加VEGFmRNA 稳定性两个方面调节VEGF 的稳定表达[12]。进一步研究表明，HIF-1 对VEGF 的调控首先在于其与HRE 的结合，激活C-TAD，使之与p300/CBP环腺苷酸反应元件结合蛋白CH1 的结合力增强，通过此核磷酸蛋白将转录信号传递给VEGF 基因，促进VEGF 的转录及表达[13]。体外细胞培养表明，通过转基因手段强制表达HIF-1 后，在低氧和正常氧分压条件下VEGF的表达均明显增加。有研究表明，去除VEGF 的增强子或诱导HIF-1 结合位点序列内出现点突变则HIF-1 对VEGF 调控作用就不复存在，此时VEGF mRNA 水平显著降低，即使在低氧条件下，VEGF mRNA 也未被诱导表达[14, 15]。另外，缺氧状态下VEGF mRNA 5’非转录区存在内部核糖体插入位点（internal ribosome entry site，IRES），能保护VEGF mRNA 进行蛋白质翻译[16]。这些表明HIF-1 在VEGF mRNA 的稳定表达方面起到了一定作用。另外，HIF-1 可以上调VEGF 受体Flt-1 的转录，Flt-1 的大量表达，加强了VEGF 的生物学效应[17]。最新研究还提示，VEGF mRNA 的3’非转录区富含腺核苷酸-鸟核苷酸（AU），缺氧时高表达的RNA 结合蛋白HuR 与富含AU 的元件具有特别亲和力，HuR 则可使VEGF mRNA 在有氧状态下也不被降解，HuR 表达与HIF-1 密切相关[18]。 2.2 VEGF 非依赖途径 VEGF 非依赖途径主要是HIF-1 通过促进其他因子表达或癌基因发生作用[19]。体外细胞实验证实，HIF-1 可诱导人内皮细胞环氧合酶-2（COX-2）的表达，而COX-2 及其合成产物前列腺素等可通过除VEGF 以外的碱性成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子、表皮生长因子及胰岛素样生长因子等多种途径调节血管生成。国内学者分别将合成的具有HIF-1 特异结合位点的DNA 片段红细胞生成素3'-增强子（EPO 3'-enhancer）及HIF-1 结合位点突变的DNA 片段，经脂质体包裹转入鼠主动脉内皮细胞与肺微血管内皮细胞，应用RT-PCR 对COX-2 的表达进行半定量观察。发现在缺氧时，主动脉和微血管内皮细胞COX-2 的表达都有增加，但经转入EPO 3'DNA 片段的内皮细胞，缺氧对COX-2 的诱导作用被显著减弱，转入将HIF-1 结合位点突变的DNA 片段则无此抑制作用。据此推测缺氧诱导COX-2 表达时，HIF-1 在其信息传递中可能起着关键作用。氯化钻（CoCl2）是特异性的HIF-1诱导剂，在其作用下体外培养的人脐静脉内皮细胞COX-2 mRNA 水平显著提高，提示CoCl2 可使COX-2 基因转录明显增强，而向细胞导人EPO 3'-增强子野生片段可阻断CoCl2 诱导的COX-2 转录，若导入点突变片段则无阻断作用。进而推断COX-2基因序列中可能存在类似的HIF-1 结合序列，HIF-1诱导COX-2基因表达增强可能主要通过HIF-1 与该序列的结合实现，由于EPO 3'-增强子片段对HIF-1竞争性结合抑制，导致被转入细胞对缺氧反应的减弱。Naomoto 等[20]的研究也证实了HIF-lα 可能通过COX-2 途径在多种肿瘤的血管生成中起重要作用。但是缺氧条件下，HIF-1 调节肿瘤血管生成还是以VEGF 依 赖途径为主。 3 HIF-1 与肿瘤治疗 肿瘤组织内的缺氧环境可以诱导HIF-1α 的表达，继而诱导下游多种靶基因的转录和表达增强，尤其HIF-1诱导VEGF 表达途径，在促使肿瘤的微血管的生成，肿瘤细胞的生长代谢以及恶性转化过程中起到了重要的枢纽作用。目前，HIF-1α 在肿瘤治疗方面的研究大致可分为药物治疗和基因治疗两类。接下来我们结合这两种研究思路，总结并展望一下以HIF-1 为靶点的肿瘤治疗前景。 3.1 药物治疗 目前，正在研究的抑制HIF-1 活性药物大体可分为两类：①阻断相关信号转导通路；②小分子HIF-1 活性抑制剂。可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂YC-1 能够有效抑制HIF-1α 表达，且能够抑制VEGF的表达，减弱血管化作用[21]。热休克蛋白90 抑制剂格尔德霉素，通过抑制热休克蛋白90 与HIF-1α结合而使HIF-1α 稳定性消失[22]。苯甲酸类似物是一类新的HIF-1 抑制剂，能够有效地抑制缺氧时人类肝癌Hep3B 细胞中HIF-1α 蛋白集聚和其靶基因的表达[23]。雷帕霉素可通过下调HIF-1α 和VEGFmRNA 的水平而抑制肝癌的生长和转移[24]。非甾体消炎药和缺氧性细胞毒素TX-402，亦可通过阻断或抑制HIF-1 的表达来抑制血管生成。在脑胶质细胞瘤中， 一种新发现的小分子HIF-1α 抑制剂103D5R[25]以及ras 癌基因抑制剂[26]，可通过减少HIF-1α 蛋白合成而抑制其下游靶基因的表达。最新研究表明，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丁酸钠在低氧环境下，能够通过抑制HIF-1 介导的血管生成抑制HT1080 人纤维肉瘤细胞的生长[27]。 3.2 基因治疗 肿瘤的基因治疗的关键在于肿瘤特异性的载体的开发，通过其结合肿瘤特异性表位以实现基因治疗。Ruan 把自杀基因Bax 反义RNA 导入HRE的下游，在缺氧状态下转染了自杀基因质粒的细胞优先凋亡[28]。另外可以通过利用反义RNA 来抑制HIF-1 的活性，利用RNA 干扰配合放疗[29]。反义HIF-1α 可能通过阻断HIF-1α 和survivin 的表达而增强胰腺癌对化疗的敏感性[30]。酪蛋白激酶2（CK2）siRNA 可通过升高p53 蛋白水平降低缺氧时HIF-1 活性[31]。利用表达pshHIF-1α（plasmid DNA expressing short hairpin RNA targeting HIF-1α）的质粒DNA 转染Colon26 和B16-BL6 细胞，能在体外有效抑制HIF-1α 的表达， 且经门静脉注入pshHIF-1α 至荷瘤鼠肝脏中，正常肝细胞和肿瘤细胞HIF-1α 蛋白表达均降低，通过沉默正常和肿瘤细胞中HIF-1α 表达，抑制肝