硅胶层析柱的制备

硅胶层析柱的制备

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2012年01月11 日

硅胶层析柱制备

一、实验目的

1．掌握硅胶层析柱的分离原理。

2．熟悉硅胶层析柱的制备方法。

二、实验指导

硅胶层析法的分离是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，根据相似相溶原理，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，用硅胶作固定相过柱子的层析过程是一个吸附与解吸的平衡。即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。

1．层析柱尺寸的选择：

天然产物分离，首先考虑的是样品量的多少，直接决定了你用大柱还是小柱，大柱用来粗分，小柱用来细分，大柱和小柱没有绝对的区别，一般认为500克装柱量的硅胶柱可以认为是大柱，100－500可的装柱量可以认为是中柱，50可以下可以认为是小柱。一般情况下，分离样品量大时用柱径大的，分离样品量小时可用柱径较小的进行分离；此外，若待分离物质组分好分离则用短点的柱子，若不好分离则用长点的柱子。

2．吸附剂的选择：

常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭等：吸附剂一般要经过纯化和活性处理，颗粒大小应当均匀。对吸附剂来说粒子小、表面积大，吸附能力就高，但是颗粒小时，溶剂的流速就太慢，因此应根据实际分离需要而定。

几种常见吸附剂及其特性：

（1）氧化铝：层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三种类型。

碱性氧化铝（pH9-10）：适用于碱性物质（如胺、生物碱）和对酸敏感的样品，这种吸附剂能引起被吸附的醛酮的缩合、酯和内酯的水解、醇羟基的脱水、乙酰糖的去乙酰化等不良反应。所以，这些化合物不宜用碱性氧化铝分离。

酸性氧化铝（pH3.5-4.5）：适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等以及色素和醛类化合物的分离。

中性氧化铝（pH7—7.5）：适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分离，也可以用来分离弱的有机酸和碱等。（2）硅胶：硅胶是硅酸的部分脱水后的产物，其成分是SiO2·xH2O，又叫缩水硅酸。柱色谱用硅胶一般不含粘合剂。

适用范围：非极性和极性化合物，适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸，以及一系列合成产品如有机金属化合物等。

（3）硅酸镁：中性硅酸镁的吸附特性介于氧化铝和硅胶之间，主要用于分离甾体化合物和某些糖类衍生物。为了得到中性硅酸镁，用前先用稀盐酸，然后用醋酸洗涤，最后用甲醇和蒸馏水彻底洗涤至中性。

（4）聚酰胺：色谱用聚酰胺主要又锦纶6（聚己内酰胺）和锦纶66（聚己二酰己二胺）两种，分子量一般在16000～20000，其亲水性和亲脂性均较好，因此既可分离水溶性成份，也可分离脂溶性成分。可溶于浓盐酸、甲酸及热的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中；微溶于乙酸和苯酚等；不溶于醇、氯仿、丙酮、乙醚、苯等；对碱稳定，对强酸可水解。

吸附剂的要求：①对样品组分和洗脱剂都不会发生任何化学反应，在洗脱剂中也不会溶解。②对待分离组分能够进行可逆的吸附，同时具有足够的吸附力，使组分在固定相与流动相之间能最快地达到平衡。③颗粒形状均匀，大小适当，以保证洗脱剂能够以一定的流速（一般为1.5mL·min-1）通过色谱柱。④材料易得，价格便宜而且是无色的，以便于观察。

硅胶颗粒均匀，无色价格便宜，且实验分离物吡啶类物质与硅胶作用强且不发生化学反应故选用硅胶为吸附剂。

3．溶剂

溶剂的选择是重要的一环，通常根据被分离物中各种成分的极性、溶解度和吸附剂的活性等来考虑。展开剂一般首先尝试文献中报道使用的展开剂，然后不断尝试比例，直到找到一个分离效果好的展开剂。样品的展开应首先使用极性较小的溶剂，使最容易脱附的组分分离。然后加入不同比例的极性溶剂配成的洗脱剂，将极性较大的化合物白色谱柱中洗脱下来。常用洗脱剂的极性按如下次序递增：

己烷和石油醚<环己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸

由于石油醚、乙酸乙酯便宜，安全，环保，故本实验选用石油醚、乙酸乙酯洗脱。正己烷价格比较高。使用乙醚、二氯甲烷等沸点较低的溶剂时，它和硅胶的吸附是一个放热过程，特别是夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。由于硅胶中的活性羟基，用甲醇可能会洗下来一些硅胶中的东西。

三、实验材料和仪器

材料：柱层析硅胶、脱脂棉花、石英砂、石油醚、乙酸乙酯、待分离物质。

器材：铁架台、层析柱、玻璃棒、烧杯、锥形瓶、量筒（100ml）、加压球等。

四、操作步骤

1．制备洗脱溶剂：向烧杯中加入石油醚:乙酸乙酯(1:4)，搅拌，摇匀，备用。2．装柱：选择一支合适的层析柱，于下端放入少许脱脂棉花，将层析柱垂直固定在铁架台上，关闭下端旋塞。然后加入少量石英砂，使柱下端为平面，并用溶剂冲洗层析柱壁上残留的石英砂。

本实验采用湿法装柱，将硅胶溶于适量洗脱剂中，使混合均匀，然后转入层析柱内，同时旋开柱底端旋塞，使洗脱剂缓慢流出，并用木锤轻轻敲打柱身，然后使硅胶自然沉降，期间不断将流出的洗脱剂添加回柱内，待沉降完全，即硅胶面不在下降时，用加压球将硅胶压实，柱高约70—100mm，加入薄薄一层石英砂。3．加样：将待分离物质溶于少量乙酸乙酯溶液中，搅拌至溶解，然后分次沿柱内壁转移到硅胶柱中，每次转移量不宜过大。用洗脱溶剂冲洗壁上残留的有色物质，静置并不断补充洗脱溶剂。加入石英砂，继续补加洗脱溶剂。

4．洗脱：反复向柱内补加洗脱剂，直至待分离中祖坟盈动到柱下方时用试管接收至完全分离，同时不断向柱内补加洗脱剂。

5．点样：将接收于试管内的分离组分在硅胶板上点样，用展开剂展开，晾干，在荧光灯下观察并记录。

五、注意事项

1．洗脱剂石油醚与乙酸乙酯比例应为1：4，此时实验的分离效果最好。

2．装柱后的凝胶必须均匀有适当的紧密，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装。

3．若硅胶自然沉降完全时方可用加压球加压，但应避免二次压缩致使分离难度增加，且加压前后上下面均应为平面。

4．装柱过程中柱壁应始终用洗脱剂润湿，以免柱壁与硅胶分离，洗脱时使分离物沿壁流下。

5．加样时，若分离物为固体或液体，可直接转移如硅胶柱中，若为粘稠质（如本实验）则需先溶解于适宜的溶解剂中再转移且溶解时应使用尽可能少的溶剂以避免改变洗脱剂的比例，影响分离效果。

6．加样时每次加样量不宜过大影响分离效果，且加样后开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有一段距离大约2-4cm时再加压，这样避免了溶剂夹带样品快速下行。

7．洗柱子能不用含水的混合溶剂，就尽量不要用。

8．在洗脱的过程中，尤其是开始阶段，不能扰动层面。