无菌检查方法验证
无菌检查方法验证：
取本品，分别加灭菌注射用水1ml溶解，采用薄膜过滤法依法检查（中国药典2010年版二部附录ⅪH），应符合规定。
1、供试品处理
将供试品去掉铝塑盖，外表面用75%酒精全面消毒，然后向每支样品中注入1.0ml0.1%的蛋白胨灭菌溶液，备用。
2、检查
阳性对照：将等量的试验菌直接加入到液体硫乙醇酸盐培养基或改良马丁液体培养基管中，在相应的温度下培养。液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培
养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5天。观察记录。
阴性对照：将灭菌的液体硫乙醇酸盐培养基或改良马丁液体培养基管直接放在相应的温度下培养。液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5天。观察记录。
样品（薄膜过滤法）：每种实验菌取10支处理好的供试品溶液，将溶液合并后加入制备好的菌悬液1ml，用0.1%的蛋白胨灭菌溶液稀释至100ml，按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，将其分为3等份，分别置于含硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作为阳性对照用。其中：试验菌为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌的滤膜接种至液体硫乙醇酸盐培养基管中；试验菌为白色念珠菌、黑曲霉菌的滤膜接种至改良马丁液体培养基管中。液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5天。观察记录。
表中接种管数中1代表用薄膜过滤法接种管；2代表各试验菌不加供试品的阳性对照管。
3、实验结论：含供试品的培养管中微生物生长无微弱、缓慢或不生长，表明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用。
附：试生产三批注射用胸腺五肽（规格10mg）无菌检查原始记录
内毒素测定方法学研究：
取本品三批样品，加0.9%灭菌氯化钠溶液制成0.6mg/ml的溶液，各取适用的家兔3只，共9只，依法测定（中国药典2010年版二部附录ⅪD），剂量按家兔体重每1kg注射1ml。
结论：三批供试样品热原检查均符合规定。细菌内毒素检查法是目前控制临床热原反应较为理想的方法之一，同时也是国际上认为较成熟的检测方法，以下对细菌内毒素方法进行验证。
1、材料：注射用胸腺五肽（10mg/支）（自制样品批号：20100401）；鲎试剂（λ为0.25EU/ml，批号0911271）由湛江安度斯生物公司生产，细菌内毒素工作标准品（10EU/支，批号0905210）由湛江安度斯生物公司生产；内毒素检验用水（批号0909240）由湛江安度斯生物公司生产。
2、鲎试剂灵敏度复核试验：将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混合混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿瓶18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml 细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。
缓缓倒转180℃观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（-）。
结果证明：该鲎试剂的灵敏度为0.25EU/ml。
3、内毒素限值的确定：药品、生物制品的细菌内毒素限制（L）一般按以下公式确定：
L=K/M
L一般以EU/mg表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg.h）表示，注射剂K=5EU/(kg.h);M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以mg/(kg.h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间按1小时计算。
注射用胸腺五肽依据中国药典2010年版二部附录Ⅺ E内毒素限制（L）每1mg中含内毒素的量应小于3EU，在此基础进行内毒素限制试验，结果如下：
4、干扰试验
供试品溶液的制备：取供试品加检查用水溶解并按最大有效稀释倍数60倍稀释，制得供试品溶液。
按鲎试剂灵敏度复核试验项操作，按下表制备干扰试验溶液：
E s=1λ在0.5λ～2λ范围内，E t=1λ在0.5 E s～2 E s范围内，证明供试品在稀释60倍后无干扰作用。
结果表明：注射用胸腺五肽三批中试内毒素检查结果符合规定。
结论：通过对注射用胸腺五肽进行干扰初筛试验和干扰试验，结果证明用细菌内毒素检查法代替热原检查法是可行的，而且具有灵敏、快速等优点，由此可建立该品种的细菌内毒素检查法，细菌内毒素限度定为每1mg样品中内毒素应小于1.5EU。
附：试生产三批注射用胸腺五肽（规格10mg）内毒素检查原始记录
注射用胸腺五肽
Zhusheyong Xiongxian Wutai
Thymopentin For Injection
本品为胸腺五肽与甘露醇等经冷冻、干燥的无菌制品，含胸腺五肽（C30H49N9O9）应为标示量的90.0%~110.0%。
【性状】本品为白色冻干疏松块状物或粉末。
【鉴别】
（1）取本品，每支加水1ml溶解后，加双缩脲试剂（取硫酸铜0.15g，加酒石酸钾钠0.6g，加水50ml,搅拌下加入10%氢氧化钠溶液30ml，加水至100ml）1ml，即显蓝紫色或紫红色。
（2）在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液的主峰的保留时间一致。
【检查】
酸碱度取本品，每支加水5ml溶解后混匀，依法测定（中国药典2010年版二部附录ⅥH），pH值为6.5～7.5。
溶液澄清度与颜色取本品5支，每支加水1ml溶解后，溶液应为澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液（中国药典2010年版二部附录ⅨB）比较，均不得更浓。
干燥失重取本品0.1g，以五氧化二磷为干燥剂，减压干燥至恒重，减失重量不得过5.0%（中国药典2010年版二部附录ⅧL）。
相关多肽取本品适量，加流动相溶解并稀释成1ml含10mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用流动相稀释成每1ml中含0.1mg的溶液，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件，取对照溶液20ul，注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主峰高为满量程的10%～20%，再取供试品溶液20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的2.5倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单一最大杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积（1.0%）；各杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积的2.5倍（2.5%）。
含量均匀度以含量测定项下方法测得的每瓶含量计算，应符合规定（中国药典2010年版二部附录ⅩE）。
无菌取本品，分别加灭菌注射用水1ml溶解，依法检查（中国药典2010年版二部附录ⅪH），应符合规定。
细菌内毒素取本品，依法检查（中国药典2010年版二部附录ⅪE），每1mg中含内毒素的量应小于1.5EU。
其他应符合注射剂项下有关的各项规定（中国药典2010年版二部附录ⅠB）。
【含量测定】照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录V D）测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）-甲醇（90：10）为流动相；检测波长为275nm。理论塔板数按胸腺五肽峰计算不低于1200。取对照品溶液20ul，重复进样6次，其峰面积的变异系数应不大于2.0%
测定法取本品，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含胸腺五肽0.5mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取胸腺五肽对照品适量，同法测定，按外标法以峰面积计算。
【类别】免疫调节药
【规格】10mg（按胸腺五肽计）
【贮藏】密闭，在凉暗处（避光并不超过20℃）保存。
注射用胸腺五肽质量标准起草说明
注射用胸腺五肽10mg规格质量标准制定是在参考国家食品药品
监督管理局注射用胸腺五肽1mg规格质量标准YBH11602005及中国药
典2010年版二部相关内容基础上进行的，热原检查改为内毒素检查。
【性状】根据产品实际外观形状制定。
【鉴别】根据国家标准YBH11602005制定，通过方法学验证。中试和试生产三批均符合要求。
【检查】酸碱度、溶液澄清度与颜色、干燥失重、相关多肽、含量均匀度、无菌根据国家标准YBH11602005制定，其中相关多肽、含量均匀度、无菌通过方法学验证。中试和试生产三批均符合要求。
细菌内毒素依据中国药典2010年版二部附录ⅪE制定，通过方法学验证。中试和试生产三批均符合要求。
其他应符合注射剂项下有关的各项规定（中国药典2010年版二部附录ⅠB）。
【含量测定】根据国家标准YBH11602005制定，中试和试生产三批均符合要求。
【类别】根据国家标准YBH11602005制定。
【规格】根据处方制定。
【贮藏】根据影响因素试验和稳定性试验及中国药典2010年版二部制定。
无菌检验方法验证方案
浙江红雨医药用品有限公司 无菌检验方法 验证方案 验证方案申请人: 日期: 年月日验证方案审核人: 日期: 年月日验证方案审批人: 日期: 年月日
1. 概述： 无菌检查法是为了检查药典要求无菌的医疗器械产品是否无菌而建立的检查法，是作为批准无菌产品放行的检验或监督部门对无菌产品质量监督中的一个重要项目。它是根据用于实验的培养基中是否有微生物生长来判定样品的无菌性，液体培养基变浑浊一般表明样品受微生物的污染。基于微生物污染的不均匀性，使无菌检查法结果的可信度受许多因素制约，如抑菌因素、检查法、检验量、检查用的培养基质量、操作环境、无菌技术等。检验方法的验证是现代质量保证体系中关系到质控技术、方法、手段的科学性、准确性的重要组成部分，是保证检验结果的公正、科学、准确的基础。 2. 验证目的： 验证所采用的方法和条件是否适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。 3. 验证范围： 适用于创可贴无菌检查法的验证。 4.验证人员及职责 5. 文件准备和培训 检查验证所需的各类文件资料，应齐全；相关的文件草案是否已具备。 6. 验证条件 6.1. 仪表量器经过校验合格，且在有效期内。 6.2. 供试品：随机抽取浙江红雨医药有司生产的3个批次医用无菌创可贴
6.3. 培养基及试剂： 6.3.1. 试剂试液： 0.9%氯化钠、氯化钠—蛋白胨缓冲液，配制记录见附件1 6.3.2. 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20140221-00 改良马丁培养基生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20131118-00 营养琼脂培养基生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20150428-03 改良马丁琼脂培养基生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20140322-00 蛋白胨生产厂家：杭州微生物试剂有限公司批号：20140417-00 培养基配制记录见附件2。 6.4. 验证用菌株： 金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】 铜绿假单胞菌【CMCC（B）10104】 枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】 生孢梭菌【CMCC（B）64941】 白色念珠菌【CMCC（F）98001】 黑曲霉【CMCC（F）98003】 标准菌株购自：浙江省食品药品检验研究中心 各验证用菌种传代记录见附件3。 6.5. 无菌检验仪器及相关设备： 压力蒸汽灭菌器 型号：YXQ-LS-50S11 生产厂家：上海博讯仪器有限公司 校验日期：2015-05-25 有效期：2016-05-24 生化培养箱（细菌培养） 型号：SPX-250 生产厂家：金坛市富华仪器有限公司 校验日期：2015-05-25 有效期：2016-05-24 生化培养箱（霉菌培养） 型号：SPX-250B 生产厂家：金坛市富华仪器有限公司 校验日期：2015-05-25 有效期：2016-05-24
无菌检查法-中国药典2010第三部-附录XIIA
附录XII A 无菌检查法 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 无菌检查应在洁净度万级下的局部洁净度百级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统应按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。 培养基 培养基的制备：培养基按以下处方制备，亦可用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2~25℃避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般可在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1年内使用。 1、硫乙醇酸盐流体培养基 酪胨（胰酶水解）15.0g 酵母浸出粉 5.0g 葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5g L-胱氨酸0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0mL 硫乙醇酸钠0.5g （或硫乙醇酸0.3mL） 琼脂0.75g 水1000mL 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，加入水葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调pH值使灭菌后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2，灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经1000℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）后，迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。 2、改良马丁培养基 胨 5.0g 磷酸氢二钾 1.0g 酵母浸出粉 2.0g 硫酸镁0.5g 葡萄糖20.0g 水1000mL 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调pH值约为6.8，煮沸；加入putaotang 溶解后，摇匀，滤清，调pH值使灭菌后为6.4±0.2，分装，灭菌。 3、选择性培养基 按上述硫乙醇盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法验证试验。 4、营养肉汤培养基 胨10.0g 氯化钠 5.0g 牛肉浸出粉 3.0g 水1000mL 取上述成分混合，微温溶解，调pH值为弱碱性，煮沸，滤清，调pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。 5、营养琼脂培养基 按上述营养肉汤培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，灭菌。
除菌过滤后消毒剂无菌验证方案
消毒剂除菌过滤后检验方法验证方案
目录 1.0 概述 (3) 1.1 目的 (3) 1.2 范围 (3) 1.3 职责 (3) 2.0 可接受标准 (4) 3.0 确认前条件 (4) 1.1 人员确认 (4) 1.2 文件确认 (5) 4.0 文件记录要求 (5) 5.0 程序 (5) 5.1 仪器的确认 (5) 5.2 菌株、培养基及试剂 (5) 5.3 验证步骤 (7) 5.4 验证总结 (9) 6.0 再确认 (9) 7.0 偏差 (9) 8.0 变更 (10) 9.0 术语 (10) 10.0 参考文件 (10) 11.0 修订历史 (10) 12.0 附录列表 (10)
1.0概述 1.1目的 2010版GMP附录无菌第九章第四十四条A/B级洁净区应当使用无菌的或经无菌处理的消毒剂和清洁剂。本公司在A/B级洁净区使用的消毒剂有75%乙醇、过氧乙酸消毒液PAA，清洁剂为注射用水。 按2010版GMP第七章第一百四十条规定对该除菌方式进行验证。 1.2范围 本确认方案时应用于江苏复旦复华药业有限公司消毒剂除菌过滤后检验方法验证工作。 1.3职责 1.3.1QC检验员职责 QC检验员，同时作为验证实施部门，职责如下： 1.3.1.1起草验证草案，完成验证报告； 1.3.1.2负责对相关人员进行培训，确保验证工作按方案进行； 1.3.1.3负责本方案的实施，验证数据的收集及数据分析； 1.3.1.4协调进行验证中可能出现的偏差的调查、完成变更的书面记 录、完成验证报告； 1.3.1.5负责向QC部门经理及时报告验证中出现的问题。 1.3.2QC部门经理职责 1.3. 2.1QC经理审核本验证方案与验证报告； 1.3. 2.2负责指导验证中发生的偏差的调查及审核验证期间发生的 偏差； 1.3. 2.3负责安排具有资格的操作人员开展验证工作； 1.3. 2.4负责验证过程中的监督与指导等其它工作。 1.3.3QA职责 1.3.3.1负责确认工作实施的监督； 1.3.3.2协调进行验证中可能出现的偏差的调查、完成变更的书面记 录； 1.3.3.3为制定和实施本验证方案提供相关程序等必要文件、技术支 持；
无菌检查法-2015版中国药典
无菌检查法-2015版中国药典 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 无菌检查应在环境洁净度B 级背景下的局部A 级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需气菌培养；胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养。培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。 1. 硫乙醇酸盐流体培养基 酪胨(胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g 葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5g L-胱氨酸0.5g 新配制的0.1% 刃天青溶液1.0ml 硫乙醇酸钠0.5g 琼脂0.75g (或硫乙醇酸) （0.3 ml) 纯化水1000ml 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH 值使灭菌后为7.1±0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培2养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20 分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。除另有规定外，硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。 2. 胰酪大豆胨液体培养基 胰酪胨17.0g 氯化钠 5.0g 大豆木瓜蛋白酶消化物 3.0g 磷酸氢二钾2.5g 葡萄糖（一水合/无水）2.5g （2.3g）纯化水1000mL 除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，调节pH 值使灭菌后在25℃的pH 值为7.3±0.2，加入葡萄
无菌检查方法学验证
无菌检查方法学验证 1. 概述 将规定量的供试品按无菌检查法中的薄膜过滤法进行操作,并接种小于100cfu 的试验菌,同时设置阳性对照,按规定温度培养3~5 天,与各相应的阳性对照管比较: 如含供试品各管中的试验菌均生长良好,则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用,可按此法进行供试品的无菌检查;如含供试品的任一管中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长,则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用,应采用增加冲洗量或使用中和剂等方法消除供试品的抑菌作用,并再重新进行验证试验。 2. 验证前提条件 供试品的选择原则:相同配方,不同规格的制品,选择其中装量最大的制品进行验证。种类相同,含量不同的制品,选择含量最高的制品进行验证。照此原则,多规格制 品按下表选择供试品进行验证。 3. 验证方法 3.1菌液制备 3.1.1细菌菌液制备程序 ①取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的冻干菌种管各一支，分别在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后，吸出滴入营养琼脂斜面上,使均匀分布，置30~35C培养18h~24h。用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于营养琼脂培养基斜面上，于30~35C培养18h~24h o 同法操作,培养得第3代培养物。 ②取生抱梭菌的冻干菌种管一支,在无菌操作下打开,以毛细吸管加入适量营养 肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后,吸出滴入胃酶肉肝疱斜面上,使均匀分布,置30~35C培养18h~24h o用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于胃酶肉肝疱斜
面上，于30~ 35°C培养18h~24h。取生抱梭菌的第二代新鲜培养物至硫乙醇酸盐流 体培养基中,30~35C培养18h~24h,得第3代培养物。 ③分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌的第3代营养琼脂斜面新鲜培养物，用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中,用电动混合器混合20s或在手掌上振敲80次,以使细菌悬浮均匀,得初步菌悬液。 ④取初步制成的上述菌悬液和生抱梭菌第3代新鲜培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至不高于标准比浊管的浓度，即得每1ml含菌数小于100cfu验证细菌菌液。 3.1.2抱子悬液制备程序 ①取白色念珠菌和黑曲霉的冻干菌种管各一支,分别在无菌操作下打开,以毛细 吸管加入适量营养肉汤,轻柔吹吸数次,使菌种融化分散后,吸出滴入改良马丁琼脂斜面上，使均匀分布，置23~28C培养5~7天。用接种环取适量第1代培养菌苔，划线接种于改良马丁琼脂斜面上,同上述条件培养得第2代培养物。取第2代培养物,同法操作,得第3代培养物。 ②用5.0ml吸管吸取3.0ml~5.0ml0.9%无菌氯化钠溶液加入上述第三代新鲜斜 面试管内,反复吹吸,洗脱抱子,用管口带有薄的无菌棉花或纱布的毛细吸管吸出抱子悬液至无菌试管内,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至不高于标准比浊管的浓度,即得每1ml含菌数小于100cfu验证抱子悬液。 3.2 薄膜过滤 3.2.1 供试品试验组 取规定量供试品,按《无菌检查标准操作细则》薄膜过滤后,如为不含防腐剂供试品，则往其中一只滤筒内接入100ml改良马丁培养基，往另一只滤筒内各接入100ml 的硫乙醇酸盐流体培养基,用5ml灭菌注射器抽取1ml验证菌液，从集菌培养器胶管处注入培养基中;如为含防腐剂供试品,则待供试品过滤完后,连续 3 次用
无菌检验验证方案样本
类别：编号: 部门：页码: 无菌检验方法验证 版次：□新订口替代: ________________ 制定人: ___________________ ____________ H H 日审批会签: _____________________________________________
1.1 确认所用的检查方法适用于一次性活检钳的无菌检查。 1.2 确认检查结果的准确性、可靠性、重复性和可操作性及检查方法的完整 性。 2. 验证范围 适用于我公司生产的一次性活检钳无菌检验。 3. 检验依据 《中国药典》附录无菌检查法 ISO11737-2: 医疗器械的灭菌微生物学方法第一部分: 确认灭菌过程的无菌试验 GB/T14233.2- 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分: 生物学试验方法 4. 验证器材 4.1 检验环境: 无菌检查应在环境洁净度10000 级下的局部100 级的单向流空气 区域内进行操作。 4.2 设备: 医用净化工作台、生物安全柜、无菌检查膜过滤器、电动吸引器、 电热干燥箱、霉菌培养箱、数显生化培养箱、压力蒸汽灭菌器、电子天平、pH 计、冰箱、恒温水浴锅、显微镜等。 4.3 培养基及稀释液: 硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、pH7.0 氯化钠- 蛋白胨缓冲液、0.1% 蛋白胨水溶液、营养琼脂。 4.4其它实验材料：微孔滤膜（孔径w 0.45um,直径约50mm）、无菌过滤杯、无 菌剪刀、无菌镊子、无菌钳子、无菌手套、吸管（1ml和10ml）、酒精灯、三角烧瓶、接种环、培养皿。
5.1 原理: 活检钳的形状为不溶物, 为微生物转移更彻底, 特选用无菌检查法中的 薄膜过滤法。 5.2 设备器材: 验证中所用器材、设备已经过国家计量单位鉴定合格并有鉴定证书。 5.3 培养基: 验证中所用培养基以经过培养基灵敏度实验检测合格。 5.4 操作步骤: 5.4.1 供试品的取样按照GB/T 2828.1- 相关规定进行逐批取样。 5.4.2 将所需物品, 供试品表面消毒, 经过传递窗, 紫外线照射半小时. 无菌室紫 外线消毒半小时。 5.4.3 操作人员用洗手液、自来水清洗双手, 关闭紫外灯, 换拖鞋, 脱外衣放入衣 柜, 穿洁净白大衣, 进入缓冲间, 再用洗手液、纯化水清洗双手, 用75% 乙醇对手进行消毒, 穿戴无菌衣、帽、口罩、手套等。 5.4.4 进入菌检室, 打开医用洁净工作台风机, 运行至少15分钟以上。 5.4.5 将所需物品由传递窗取出, 两只消毒液桶分别放置于菌检洁净工作台一侧, 其余物品放置于传递窗一侧的方形桌上, 剥去牛皮纸外包装。 5.4.6 医用洁净工作台内点燃酒精灯。打开3个养琼脂平板, 置于医用洁净工作 台的不同位置。 5.4.7 取供试品, 在医用洁净工作台内, 打开包装袋, 小心将供试品取出, 将其剪成 约10cm的小段，浸入500ml 0.1%无菌蛋白胨水溶液中，充分振摇作为供 试液。 5.4.8 将供试液平均转入三个薄膜过滤器的滤杯中, 开启电动吸引器开关进 行过滤，用pH7.0蛋白胨-氯化钠缓冲液每次100ml冲洗滤膜三次，用平口镊子夹取滤膜（过程保持滤膜的完整性） , 一张转移到100ml 改
无菌检查方法验证方案
安徽捷众生物化学有限公司 无菌检查方法（薄膜过滤法） 验证方案 文件编号：QY·TS·05·007-00
无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案QY·TS·05·007-00 第1 页/共11页批准日期：年月日实施日期年月日
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安徽捷众生物化学有限公司 无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案 目录 1．验证目的 2. 验证频次 3. 验证操作内容与要求 3.1. 验证操作试验 3.2 试验菌要求 3.3.验证方法步骤 3.4. 验证准备 3.5验证试验操作 4．验证结果评价分析 5．附件
安徽捷众生物化学有限公司 无菌检查方法（薄膜过滤法）验证方案编号QY·TS·05·007-00 页数共11 页 制定人制定日期年月日修订日期年月日审核人审核日期年月日颁发部门质量管理部批准人批准日期年月日生效日期年月日分发部门相关部门 1．验证目的 确认所采用的方法适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性，以保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。 2. 验证频次 2.1. 建立药品的无菌检查法时 2.2. 修订检验方法时 2.3. 供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时 3. 验证操作内容与要求： 3.1. 验证时，按“供试品的无菌检查”的规定要求进行验证操作试验： 3.1.1. 对每一试验菌应逐一进行验证。 3.1.2. 硫乙醇酸盐流体培养基—金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生 孢梭菌。 3.1.3. 改良马丁琼脂培养基—白色念珠菌、黑曲霉。 3.2 试验菌要求： 3.2.1验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保 证试验菌株的生物学特性。
无菌检测法
Ⅱ-Ⅺ H无菌检查法 无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件 下未发现微生物污染。 无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程中必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试 方法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环 境的洁净度须符合无菌检查的要求。 培养基 培养基的制备 培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在 一年内使用。 1、硫乙醇酸盐流体培养基（用于培养好氧菌、厌气菌） 酪胨（胰酶水解）15g；氯化钠 2.5g；葡萄糖5g；新配制的0.1%刃天青溶液 1.0m l；L-胱氨酸0.5g（或新配制的0.2%亚甲蓝溶液0.5m l）；硫乙醇酸钠0.5g；琼脂0.75g （或硫乙醇酸0.3m l）；水1000m l；酵母浸出粉5g 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解后，调节p H为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节p H值使灭菌后为7.1±0.2，分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色） 不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟）迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。 硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。 2、改良马丁培养基（用于培养真菌） 胨5g；磷酸氢二钾1g；酵母浸出粉2g；硫酸镁0.5g；葡萄糖20g；水1000m l 除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节p H值约为 6.8，煮沸，加入葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节p H值使灭菌后为 6.4±0.2，分装，灭菌。 改良马丁培养基置23～28℃培养。 3、选择性培养基 按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂或表面活性剂，如对氨基苯甲酸（用于磺胺类供试品）、聚山 梨酯80（用于非水溶性供试品）或β-内酰胺酶（用于β-内酰胺类供试品）等。中和剂或表面活性剂的用量应通过验证。 4、营养肉汤培养基 胨10g；牛肉浸出粉 3.0g；氯化钠5g；葡萄糖 5.0g；水1000m l
无菌检验验证方案
类别：编号： 部门：页码： 无菌检验方法验证 版次：□新订□替代: 制定人: 年月日审批会签: 批准人：年月日生效日期：年月日
1.验证目的 1.1确认所用的检查方法适用于一次性活检钳的无菌检查。 1.2确认检查结果的准确性、可靠性、重复性和可操作性及检查方法的完整性。 2.验证范围 适用于我公司生产的一次性活检钳无菌检验。 3.检验依据 《中国药典》2010版附录无菌检查法 ISO11737-2:2009 医疗器械的灭菌微生物学方法第一部分：确认灭菌过程的无菌试验 GB/ 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法 4.验证器材 检验环境：无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部100级的单向流空气区域内进行操作。 设备：医用净化工作台、生物安全柜、无菌检查膜过滤器、电动吸引器、电热干燥箱、霉菌培养箱、数显生化培养箱、压力蒸汽灭菌器、电子天平、pH计、冰箱、恒温水浴锅、显微镜等。 培养基及稀释液：硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、氯化钠-蛋白胨缓冲液、%蛋白胨水溶液、营养琼脂。 其他实验材料：微孔滤膜（孔径≤，直径约50mm）、无菌过滤杯、无菌剪刀、无菌镊子、无菌钳子、无菌手套、吸管（1ml和10ml）、酒精灯、三角烧瓶、接种环、培养皿。 5.验证方案 原理：活检钳的形状为不溶物，为微生物转移更彻底，特选用无菌检查法中的薄膜过滤法。 设备器材：验证中所用器材、设备已通过国家计量单位鉴定合格并有鉴定证书。 培养基：验证中所用培养基以通过培养基灵敏度实验检测合格。 操作步骤： 供试品的取样按照GB/T 相关规定进行逐批取样。 将所需物品，供试品表面消毒，通过传递窗，紫外线照射半小时.无菌室紫外线消毒半小时。 操作人员用洗手液、自来水清洗双手，关闭紫外灯，换拖鞋，脱外衣放入衣柜，穿洁净白大衣，进入缓冲间，再用洗手液、纯化水清洗双手，用75%乙醇对手进行消毒，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套等。
无菌检查法
无菌检查法 1.目的：建立对成品无菌检查的标准操作规程。 2.范围：对成品的无菌检查。 3.责任：质量监督部。 4.内容： 4.1概述：无菌检查是检查药品与敷料是否染有活菌的一种 方法。无菌检查的操作环境和全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，同时也应避免在有抑菌条件下操作。 4.2仪器、设备和用具： ℃及除湿装置。缓冲间及操作室内均设置能达到空气消毒的紫外光灯和照明灯，操作室或工作台应保持空气正压。℃预培养48小时，证明无菌后将3个平板以无菌方式带入无菌操作间的洁净区域左、中、右各放1个；打开碟盖扣置，平板在空气中暴露30分钟后将盖盖好，置35-37℃培养48小时，取出检查，3个平板上生长的菌落数相加总数不得超过10个。 无菌操作台面或超净工作台应定期请有关部门检测其洁净度，应达到100级（一般用尘埃粒子计数仪），检测尘埃粒径≤5μm的粒数不得超过3.5个／升；空气流量应控
制在0.75-1.0m3/s；细菌菌落数平均<1个，可根据无菌状况定期置换过滤器。 ℃的生化培养箱。 4.2.3离心机、显微镜、高压消毒炉、标准pH比色器（0.02 酚红指示剂和溴钾酚蓝指示剂）、恒温烤箱。 ℃灭菌30分钟。 4.2.4.1移管、刻度吸管在管口上端内，松松地塞入少许棉 花，然后放于吸管筒内或牛皮纸袋内，盖严，消毒备用。±0.5）℃蒸气灭菌30分钟，物品取出时切勿立即置冷处，以免急速冷却，使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，易致染菌，应置恒温培养箱中烘干。适于高温灭菌的器皿也可采用160℃干热灭菌2小时。 4.3试液： 4.3.175％乙醇溶液配制酒精棉球用。 4.3.2碘酊溶液配制碘酒棉球用。 4.3.3灭菌生理盐水0.9％氯化钠溶液，分装于试管或三角 瓶中，瓶口用棉塞或海棉胶专用塞塞紧并用牛皮纸包扎，灭菌备用。 4.3.4新洁尔尔灭（1:1000）溶液。 4.3.53-5％甲酚溶液。 4.3.60.02％酚红指示剂pH6.8-8.4系列比色液管。
医疗器械无菌检验方法验证方案
**********有限公司 无菌检验方法 验证方案 验证方案申请人: 日期: 年月日验证方案审核人: 日期: 年月日验证方案审批人: 日期: 年月日
1. 概述： 无菌检查法是为了检查药典要求无菌的医疗器械产品是否无菌而建立的检查法，是作为批准无菌产品放行的检验或监督部门对无菌产品质量监督中的一个重要项目。它是根据用于实验的培养基中是否有微生物生长来判定样品的无菌性，液体培养基变浑浊一般表明样品受微生物的污染。基于微生物污染的不均匀性，使无菌检查法结果的可信度受许多因素制约，如抑菌因素、检查法、检验量、检查用的培养基质量、操作环境、无菌技术等。检验方法的验证是现代质量保证体系中关系到质控技术、方法、手段的科学性、准确性的重要组成部分，是保证检验结果的公正、科学、准确的基础。 2. 验证目的： 验证所采用的方法和条件是否适合于供试品的无菌检查。即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。 3. 验证范围： 适用于医用纱布无菌检查法的验证。 4.验证人员及职责 5. 文件准备和培训 检查验证所需的各类文件资料，应齐全；相关的文件草案是否已具备。 6. 验证条件
6.1. 仪表量器经过校验合格，且在有效期内。 6.2. 供试品：随机抽取*******医药有司生产的3个批次医用无菌医用纱布6.3. 培养基及试剂： 6.3.1. 试剂试液： 0.9%氯化钠、氯化钠—蛋白胨缓冲液，配制记录见附件1 6.3.2. 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基生产厂家：批号： 改良马丁培养基生产厂家：批号： 营养琼脂培养基生产厂家：批号： 改良马丁琼脂培养基生产厂家：批号： 蛋白胨生产厂家：批号： 培养基配制记录见附件2。 6.4. 验证用菌株： 金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】 铜绿假单胞菌【CMCC（B）10104】 枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】 生孢梭菌【CMCC（B）64941】 白色念珠菌【CMCC（F）98001】 黑曲霉【CMCC（F）98003】 标准菌株购自：浙江省食品药品检验研究中心 各验证用菌种传代记录见附件3。 6.5. 无菌检验仪器及相关设备： 压力蒸汽灭菌器 型号：生产厂家： 校验日期：有效期： 生化培养箱（细菌培养） 型号：生产厂家：
无菌检查法验证方案
XXX无菌检验方法学验证方案 编号：VP.SV.039.00
目录 验证方案的审批 验证小组名单 验证实施进度 技术性文件 引言 1．概述 2．验证目的 3．职责 无菌检查方法学的确认 再验证周期
验证方案审批
验证小组名单 验证实施进度 技术性文件
引言 1.概述 1.1根据2010版《中华人民共和国药典》二部附录ⅪH规定，当建立药品的无菌检查方 法时，需进行方法学的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的检测。当药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检测方法应重新验证。 2.验证目的： 2.1根据2010版《中华人民共和国药典》二部附录ⅪH无菌检查方法要求，通过试验， 寻找合适的材料、条件和方法，最终确定氧氟沙星滴眼液的检验方法，并将其定为日常检测的正式方法。 3.职责 3.1验证办 3.1.1负责验证方案的审批。 3.1.2负责验证的协调工作，以保证验证方案规定项目的顺利实施。 3.1.3负责验证数据及结果的审核。 3.1.4负责验证报告的审核。 3.1.5负责再验证周期的确认。 3.2质量监控部 3.2.1负责验证所需的标准品、样品、试剂、试液等的准备。 3.2.2负责仪器、仪表、量具的校正。 3.2.3负责取样及样品检验。 3.2.4负责收集各项验证、试验记录，对结果进行分析，起草验证报告，报验证办。 3.2.5负责拟订验证方案。 3.2.6负责组织试验所需设备。 3.2.7负责按照验证方案里各项操作步骤进行操作。 3.2.8负责保证设备的正常运转。
无菌检查方法学的确认 1.验证环境、设备及实验前准备： 1.1无菌室内（无菌检查应在环境洁净度B级下的局部洁净度A级的单向流空气区域或 隔离操作器内完成。由QA人员定期按国家相关要求进行环境监控。 1.2仪器和设备：①GSP-9080MBE型隔水式电热恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗 设备厂）；②生化培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；③AL204型电子天（梅 特勒—托利多仪器有限公司）；④GZX-9070MBE型电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实 业有限公司医疗设备厂）；⑤YXQ-LS-50SI型高压蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公 司医疗设备厂）；⑥HTY-2000A集菌仪、全封闭集菌培养器可重复使用集菌培养器（杭 州高得·泰林医疗器械有限公司）；⑦超净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备 厂)；。⑧微孔滤膜（孔径0.45μm直径50mm）… 1.3供试品： 1.4所需培养基： 1.4.1硫乙醇酸盐流体培养基（细菌培养）；批号：050104；灵敏度：应符合定 厂家：北京三药科技开发公司； 改良马丁培养基（真菌培养）；批号：050106 ；灵敏度：应符合规定 厂家：北京三药科技开发公司； 营养琼脂培养基（分离单个菌落及传菌种）；厂家：北京三药科技开发公司； 改良马丁琼脂培养基（培养真菌及传菌种）；厂家：北京三药科技开发公司； 1.5稀释液、缓冲液： 0.9%氯化钠溶液；PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 (配制方法参照chp2005附录—90页) 1.6验证用菌种：金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]；大肠埃希菌[CMCC（B）44 102] 生孢梭菌[CMCC（B）64 941]；枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]；黑曲霉[CMCC（F） 98 003]；白色念珠菌[CMCC（F）98 001]。（以上菌种均由湖北省药品检验所提供）1.7培养基的无菌检查：培养基配制好并采取验证合格的灭菌程序灭菌后随机取 5瓶 (管)，培养 14 天，结果应无菌生长。 2.方法学验证: 2.1简要方法说明：本品为喹诺酮类抗生素，通过抑制细菌的DNA旋转酶和DNA复制而发
无菌检查方法的验证
无菌检查方法的验证 无菌检查方法是为了检查药典要求无菌的制剂及其他制品是否无菌而建立的试验方法，是作为无菌产品批放行的重要依据及药监部门对无菌产品质量监管的一个重要项目。因此如何确保无菌检查方法的准确可靠至关重要，而检查方法的验证是保证检查结果的公正、科学和准确的基础，因此各个主要国家的GMP或药典都对无菌检查方法的验证提出了严格的要求，2010版中国药典对分析方法验证和检查的要求也有大幅度的提高，同时也是GMP检查中检查的重点和容易发现问题的区域。 验证要求与方法 无菌检查方法验证一般分为前验证和再验证两种。 前验证，也称预验证，指在无菌分析方法正式使用前，按照预定验证方案进行的验证。如果没有充分的理由，任何检查方法必须进行前验证。 再验证，指某一检查方法经过验证并在使用一段时间后进行的，旨在证实已验证状态没有发生飘移而进行的重新验证及对检查方法进行修订、改变时进行的验证。 通常一个无菌产品的检查流程为：首先基于产品的剂型、溶解度等性质，按照药典的要求确定是否需要进行前处理;然后根据产品的特性是否有抑菌性，确定是否需要增加去除产品抑菌性的方法;最后验证整个检查方法中用到的一切及试验过程中的每一个环节包括样品的预处理方式、检查过程、培养条件等均不影响样品中微生物的生长。 这里，验证的重点环节包括： 前处理方法直接影响后续步骤的效果和重现性，应是验证的重点。 供试品中抑菌活性的去除是当前验证工作的重点，尤其强调应充分验证供试品本身对微生物生长的影响。 具体的验证方法如下： 菌种的选择 无菌检查方法验证中通常选择以下6种试验中常用的控制菌的标准菌株，它们分别代表不同类型的菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]代表药品中常见的污染菌——芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]代表革兰阳性菌、生孢梭菌[CMCC(B)64 941]代表厌氧菌、大肠埃希菌[CMCC(B)44 102]代表革兰阴性菌、白色念珠菌[CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑曲霉菌[CMCC(F)98 003]代表霉菌。 菌液的制备 接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30~35 ℃培养18~24h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，
无菌试验方法验证方案
一次性使用无菌医疗器械无菌试验 方法验证方案 编制：日期： 审核：日期： 批准：日期：
1.验证目的 通过实验验证检测方法的适用性及培养基的适用性、无菌性、灵敏度。 2.样品信息 3.实验设备及器材 3.1使用仪器及器具：大试管、灭菌锅、洁净工作台、生物安全柜、电子天平、电热恒温培养箱、霉菌培养箱。 3.2使用材料及菌种：硫乙醇酸盐液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、生饱梭菌、白色念珠菌、大肠埃希菌。 4.验证组成员及职责 姓名部门职责 品质部组长：负责验证方案的审核、核准并负责验证报告的核准 品质部负责验证方案、验证报告的起草并组织实施 品质部负责验证过程中现场的监控及验证实施和试验过程的操作 5.验证依据 《中国药典》2015版和GB/14233.2-2005 6.验证步骤 6.1检测设备计量有效性验证 确认以下设备经过校量并在有效期内 设备名称是否校验是否在有效期内备注 灭菌锅 洁净工作台 生物安全柜 电子天平
电热恒温箱 霉菌培养箱 确认人/日期：审核/日期： 6.2培养基适用性检查 6.2.1无菌性检查：取每种每批培养基5支（瓶），培养14天，应无菌生长。检查结果见表1。 表1
6.2.2灵敏度检查 6.2.2.1菌液制备方法描述 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体或者胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生胞梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30℃-35℃培养18-24小时，接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基或者沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20℃-25℃培养24-48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20℃-25℃培养5-7天，加入3-5ml含0.5%（ml/ml）聚山梨酯80无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。 菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2℃-8℃，可在24小时内使用。 6.2.2.2培养基接种 取每管将量为12ml的硫乙醇酸盐液体培养基7支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生饱梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。 6.2.2.3结果判断，空白对照应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该批培养基的灵敏度检查符合规定。 6.2.2.4试验结果见表2 表2 培养基试验液是否长菌菌生长情况培养条件判定 硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球 菌1ml 1. 30℃-35℃培 养3天 2. 铜绿假单胞菌 1ml 1. 2. 生饱杆菌1ml 1. 2. 空白对照 胰酪大豆胨枯草芽孢杆菌 1.20℃-25℃培
无菌检查方法验证告报告2015
编号：FAL-YZ-003.1 无菌检查方法 验证报告 科技发展
目录
无菌检查方法验证报告 1.目的 通过对培养基无菌性检查、灵敏度检查，对产品的无菌检查方法适用性进行试验，证明该方法适用于产品无菌检查日常检测。 2.围 适用于本公司产品的无菌检查方法的建立和确认。 3．依据 中国药典（2015年版） GB/T14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学实验方法 4. 职责权限 5. 验证方法 实验前的准备 a仪器设备
b操作环境 微生物限度检查应在环境洁净度10000 级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。 c稀释液和试剂： PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 d器具无菌注射器仪液器 YT－603集菌仪 5.1培养基的适用性检查 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及胰胳大豆胨肉汤培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。 培养基：硫乙醇酸盐批号20140408 生产厂家：日水生物技术 胰胳大豆胨肉汤培养基批号20151023 生产厂家：尼赛欣合生物技术
5.1.1无菌性检查：每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），培养 14 天，应无菌生长。 5.1.2灵敏度检查 菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第 0 代），试验用菌种应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕 白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕 黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕 5.1.3菌液制备 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉微生物培养基质控品,使用前注入1.1ml稀释液充分溶解后,在漩涡混合器上震荡混匀,制成10-100 cfu/0.1ml菌悬液,3-5天用完。 5.1.4培养基接种取每管装量为12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于100 cfu 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2 支，另1支不接种作为空白对照，培养3 天；取每管装量为9ml的胰胳大豆胨肉汤培养基7支,分别接种小于100 cfu 的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2 支，另1 支不接种作为空白对照，培养5 天。逐日观察结果。 5.1.5结果判定空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该
无菌检测方法
四川乐至贵均卫生材料有限公司医疗器械产品无菌检测方法
1.目的 建立无菌检测标准规程，对灭菌后的医疗器械产品进行无菌检测，以确定灭菌的有效性。 2.范围 本规程适用于本公司对医疗器械产品的无菌检测。 3.依据 《中国药典》2015版 4.设备、器皿、药品的准备 4.1 设备的准备 电子天平、干热灭菌箱、高压灭菌箱、洁净工作台、放大镜、移液枪、电热培养箱、霉菌培养箱、冰箱、斜口钳、接种环、酒精灯 4.2 器皿的准备 锥心瓶（500ml）、烧杯（1000ml）、试剂瓶（60ml）、量筒（50ml、1000ml）、培养皿（Ф90mm ×15mm）、斜口钳、玻璃棒。 4.3 药品的准备 硫乙醇酸盐流体培养基、胰酪大豆胨液体培养基、纯化水、pH7.0 无菌氯化钠溶液。 5.器皿的清洗 将所需的锥形瓶、烧杯、试剂瓶、培养皿、玻璃棒放入超声波清洗机中用纯化水清洗两次，每次15分钟，将清洗完的器皿在180℃条件下进行干热灭菌2小时。 6.取样 按灭菌批次或者生产批次进行取样，随机抽取同一型号的产品4件作无菌检测样品7.培养基的制备 7.1 硫乙醇酸盐流体培养基的制备 取15g硫乙醇酸盐流体培养基和1000ml纯化水于烧杯中混合，加热至微沸（注意加热过程中要不断地搅拌，使其混合均匀）用棉花塞塞紧复用无尘布和绳子绑好后转移至高压灭菌锅内灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间30分钟。灭菌后摇均，冷却至45℃待用。 7.2 胰酪大豆胨液体培养基的制备 取15g胰酪大豆胨和1000ml纯化水于烧杯中混合，操作方法同6.1。 8. 培养基灵敏度检查 8.1 菌种的要求
培养基灵敏度检查所用的菌株（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）传代次数不得超过5代。 8.2 菌液的制备 接种金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基上，30-35℃培养24小时；接种枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基上，20-25℃培养24小时。 将上述经24小时培养后的培养物用0.9﹪无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu(菌落形成单位)的菌悬液。制备好的菌液应在2-8℃条件下保存，并在24小时内使用。 8.3 接种及培养 取每管装量15ml的硫乙醇酸盐流体培养基3支，其中2支接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌，另一支不接种作为空白对照，30-35℃培养3天逐日观察并记录。 取每管装量10ml的胰酪大豆胨液体培养基3支，其中2支接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌，另1支不接种作为空白对照，20-25℃培养5天，逐日观察记录。 8.4 灵敏度检测结果判断 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基试管菌落均生长良好，则判定该培养基的灵敏度检查符合规定。 9. 供试品的无菌检测 9.1 对照试验 取每管装量15ml的硫乙醇酸盐流体培养基3支，接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌，另一支不接种作为空白对照，30-35℃培养14天逐日观察并记录。 取每管装量10ml的胰酪大豆胨液体培养基3支，其中2支接种小于100cfu的枯草芽孢杆菌，另1支不接种作为空白对照，20-25℃培养14天，逐日观察记录。 9.2 供试品的准备及接种 于微生物实验室超净工作台内将样品剪成小碎段（2～3cm）,其中2件接种于各培养皿足以浸没供试品的适量硫乙醇酸盐流体培养基中，另外2件接种于各培养皿足以浸没供试品的适量胰酪大豆胨液体培养基中，冷却。 9.2 培养 将接种过的硫乙醇酸盐流体培养基的培养皿倒置于电热培养箱中30～35℃条件下培养14天，逐日观察是否有菌落生长并记录； 将接种过的胰酪大豆胨液体培养基的培养皿倒置于霉菌培养箱中20～25℃条件下培养14天，逐日观察是否有菌落生长并记录。