实时荧光定量PCR实验结果分析PPT课件
合集下载
实时荧光定量PCR技术PPT课件(模板)
大多数荧光定模量板PCRD实N验的AC量T值越在1多8-30，之间荧。 光达到 荧rea光lm定阈a量steP值rCmRix的参数循解析环-- C数T值越少，即Ct值越小。
-引物和扩增产物二级结构的预测
乙1v肝标病准人品血ii+液9Lv中稀oHg释B模缓V的冲板绝液对，起定得量标始准浓品iii度与Ct值呈线 性关系。 已知在50%的乳腺肿瘤样本中, ERBB2表达异常, 因此可以作为一个检测标准
Sample
2 5
绝对定量分析几要素
✓ 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 ✓ 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、
PCR产物、基因组DNA等。 ✓ 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计
显著性。 ✓ 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可。 ✓ 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。
SYBR Green I 染料法——优缺点
优点
缺点
使用方便，不必设计复杂 探针
具有价格优势
无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低
Taqman探针法——原理
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
乙肝病人血液中HBV的绝对定量
PBMioeTr1－-FLAinMegdeenteecstieornie- sERBB2 双SY标BR准法曲实线验法流—程—及结注果意分事析项 样延本伸的 时采间集：、产处物理长和度制决备定；
-引物和扩增产物二级结构的预测
乙1v肝标病准人品血ii+液9Lv中稀oHg释B模缓V的冲板绝液对，起定得量标始准浓品iii度与Ct值呈线 性关系。 已知在50%的乳腺肿瘤样本中, ERBB2表达异常, 因此可以作为一个检测标准
Sample
2 5
绝对定量分析几要素
✓ 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 ✓ 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、
PCR产物、基因组DNA等。 ✓ 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计
显著性。 ✓ 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可。 ✓ 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。
SYBR Green I 染料法——优缺点
优点
缺点
使用方便，不必设计复杂 探针
具有价格优势
无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低
Taqman探针法——原理
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
乙肝病人血液中HBV的绝对定量
PBMioeTr1－-FLAinMegdeenteecstieornie- sERBB2 双SY标BR准法曲实线验法流—程—及结注果意分事析项 样延本伸的 时采间集：、产处物理长和度制决备定；
实时荧光定量PCR技术PPT课件(模板)
Cycle number
Sample
Ck 104
Ck 102 Lg of DNA concentration
qPCR 常用实验方法
A
B
C
简单 成本较低
适用于多重PCR 特异性较好
可进行SNP检测 特异性非常好
SYBR Green I 染料法——原理
SYBR Green I 是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色 激发波长的染料
大多数荧光定模量板PCRD实N验的AC量T值越在1多8-30，之间荧。 光达到 荧rea光lm定阈a量steP值rCmRix的参数循解析环-- C数T值越少，即Ct值越小。
-引物和扩增产物二级结构的预测
乙1v肝标病准人品血ii+液9Lv中稀oHg释B模缓V的冲板绝液对，起定得量标始准浓品iii度与Ct值呈线 性关系。 已知在50%的乳腺肿瘤样本中, ERBB2表达异常, 因此可以作为一个检测标准
待Sta测n样da本rd拷cu贝rv数e （copies/ul标）准=待品测样本浓度5×/样1本0分3 子量×268×.110814 28.64
C-不al要ibr有at连or续: 可4以个用G 带有PCR扩增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸；
输C乙用RHTee入肝Nfa值eol要 病tr-h是eTy查人ne判cRm找血e断NpR的液lAa实Nt蛋中eA验C白Hp成oBo或no功Vtl是r的s与o；l基绝(否N因对的T标标名定C重)准准称量检要品品验参q考PCR体系55××（11引00物45 ）
实验数据 实cD验NA步合骤成：(提两取步H法BVqRDTN-PAC；R)
T9a5q~m1 anS探lop针e法: -—3.—原理
c可D以NA是影含响有q目PC的R基敏因感的度质粒、PCR产物、基因组DNA等。
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用ppt课件
pcrrtpcr反应体系模板45ltagmixture50l025l荧光染料sybrgreen荧光标记的探针taqman探针法rtpcrmonitoringpcrsybrgreendyesybrgreen变性退火延伸rtpcrsybrgreenrtpcr10rtpcrmonitoringpcrtaqmantaqman法11rtpcrtaqman法12taqmanrtpcr13?绝对定量absolutequantificationaq病原体检测转基因食品检测基因表达研究?相对定量relativequantificationrq基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究rtpcr14相对定量通过内标定量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数rtpcr内标endogenouscontrol通常是18s28sactingapdh基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定受环境因素影响小15rtpcr16rtpcrctpcr扩增循环数荧光域值threshold的设定在定量pcr中需要经过数个循环后荧光信号才能够被检测到一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底信号
4
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
5
RT-PCR技术的原理及试验流程
6
RT-PCR技术的原理及试验流程
7
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系
模板
4.5μl
Tag mixture
5.0μl
F(F’)
0.25μl
R(R’)
0.25μl
4
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
5
RT-PCR技术的原理及试验流程
6
RT-PCR技术的原理及试验流程
7
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系
模板
4.5μl
Tag mixture
5.0μl
F(F’)
0.25μl
R(R’)
0.25μl
实时荧光定量PCR实验结果分析共31页
RT-qPCR实验
Color 1 – FAM detectionor GAPDH
结果分析-绝对曲线
结果分析-单双通道相互验证
ERBB2单双通道相互验证的实验结果
A.Multiplex Reactions
Healthy RNA 28.48 28.68 28.78 28.65± 0.15
CT = 21.3 CT = 22.8 CT = 19.3
T
相对定量
相对定量
Control Sample A Sample B
CT = 21.3 CT = 22.8 CT = 19.3
= 1.5ng / tube = 0.5ng / tube = 6.0ng / tube 4
Fold
1 0.33
• 选用GAPDH作为内标基因 －FAM标记的ERBB2探针 －VIC标记的GAPDH探针
• 标准品（质粒）构造标准曲线 • 多重PCR反应 • 阴性对照
－无RNA对照（空白） －无逆转录酶对照（监控基因组污染）
RNA定性及定量分析
正常乳腺组织 RNA
Intact
5 hr. at 90°C
乳癌组织 RNA
△ C（t）GOI- △ C（t）ref= △C（t） △ C（t）sample- △ C（t）calibrator= △ △C（t）
•好处：不做标准曲线
•应用范围：扩增效率较高，目标基因和内标基因扩增效率一
致并且相互独立扩增；不做标准曲线，高通量检测（芯片评估） ；不要求很高的精度
应用实例-基因表达分析
利用TaqMan技术研究ERBB2 在乳腺肿瘤 组织标本中的表达差异
RNA提取 RNA定量 反转录(RT) 设计qPCR实验方法 RT-qPCR实验
实时荧光定量PCR原理与分析方法46页PPT
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
实时荧光定量PCR原理与分 析方法
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
谢谢！
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
实时荧光定量PCR原理与分 析方法
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
齐全版(荧光PCR技术)ppt课件
实时荧光定量PCR技术
一、荧光定量 PCR仪
荧光定量PCR仪是一种 带有激发光源和荧光信 号检测系统的PCR仪， 通常配有电脑系统及相 应的分析软件。
与普通PCR的区别（一）
❖ 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。
❖ 实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对 起始模板进行定量。
❖ MGB探针在检测SNP和定量分析甲基化等位 基因方面具有优势。
TaqMan MGB 探针法
❖ TaqMan MGB 探针能分辨一个碱基的差别
TaqMan MGB 探针法原理图示
❖ 优点：
❖ 1.NFQ为非荧光基团，大大降低测定中荧光的本底值，有提 高了淬灭效率。
❖ 2.MGB结合在探针与靶基因杂交形成的双螺旋的小沟中，促 进探针与靶基因杂交的稳定性和特异性，又使探针的Tm值 大大提高，从而使杂交温度的选择余地更大。
❖ 缺点：
❖ 1.合成TaqMan探针价格昂贵。（一条探针约3000~5000元 ）
❖ 2.中国地区仅有基康生物公司（ABI）提供合成服务，合成 时间长，周期需要1~2个月.
与TaqMan探针相比，MGB探针长度更短，淬灭效率更高。
案例分析
❖ 1.应用SYBR Green I 荧光实时定量PCR检测 成蚊携带的登革病毒。
实时荧光PCR的理论基础
❖ 荧光共振能量转移（FRET）：当一个荧光基 团与一个荧光淬灭基团（可以淬灭前者的发 射光谱）的距离邻近至一定范围时，就会发 生荧光能量转移，淬灭基因会吸收荧光基团 在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不 出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分 开，淬灭作用即会消失。所以，利用核酸杂 交和核酸水解所致荧光基团和淬灭基团结合 或分开的原理，建立各种实时荧光PCR。
一、荧光定量 PCR仪
荧光定量PCR仪是一种 带有激发光源和荧光信 号检测系统的PCR仪， 通常配有电脑系统及相 应的分析软件。
与普通PCR的区别（一）
❖ 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。
❖ 实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对 起始模板进行定量。
❖ MGB探针在检测SNP和定量分析甲基化等位 基因方面具有优势。
TaqMan MGB 探针法
❖ TaqMan MGB 探针能分辨一个碱基的差别
TaqMan MGB 探针法原理图示
❖ 优点：
❖ 1.NFQ为非荧光基团，大大降低测定中荧光的本底值，有提 高了淬灭效率。
❖ 2.MGB结合在探针与靶基因杂交形成的双螺旋的小沟中，促 进探针与靶基因杂交的稳定性和特异性，又使探针的Tm值 大大提高，从而使杂交温度的选择余地更大。
❖ 缺点：
❖ 1.合成TaqMan探针价格昂贵。（一条探针约3000~5000元 ）
❖ 2.中国地区仅有基康生物公司（ABI）提供合成服务，合成 时间长，周期需要1~2个月.
与TaqMan探针相比，MGB探针长度更短，淬灭效率更高。
案例分析
❖ 1.应用SYBR Green I 荧光实时定量PCR检测 成蚊携带的登革病毒。
实时荧光PCR的理论基础
❖ 荧光共振能量转移（FRET）：当一个荧光基 团与一个荧光淬灭基团（可以淬灭前者的发 射光谱）的距离邻近至一定范围时，就会发 生荧光能量转移，淬灭基因会吸收荧光基团 在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不 出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分 开，淬灭作用即会消失。所以，利用核酸杂 交和核酸水解所致荧光基团和淬灭基团结合 或分开的原理，建立各种实时荧光PCR。