免疫印迹技术实验报告
immunoblotting免疫印迹法
immunoblotting免疫印迹法免疫印迹法（Immunoblotting）免疫印迹法是一种常用的实验技术，用于检测和分析蛋白质的存在与表达水平。
它结合了免疫学和电泳技术，能够帮助研究者确定特定蛋白质的分子量、定量和免疫反应性。
本文将对免疫印迹法的原理、操作流程和应用范围进行探讨。
一、免疫印迹法的原理免疫印迹法的原理基于抗原抗体反应。
首先，待检样品经过电泳分离，然后将蛋白质从凝胶转移到聚丙烯酰胺膜上。
接着，利用一系列步骤将目标蛋白质与特异性的一抗和二抗结合，形成特异性的免疫复合物。
最后，通过酶促发色反应，将免疫复合物标记出来，产生相应的信号。
二、免疫印迹法的操作流程1. 样品制备：待检样品应首先经过蛋白提取、浓缩和纯化处理，以保证分析的准确性。
其中关键的步骤是蛋白质的电泳分离，常用的方法有SDS-PAGE和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2. 转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚丙烯酰胺膜上，常用的方法有湿式和半湿式转印。
湿式转印适用于小分子量蛋白质，而半湿式转印适用于大分子量蛋白质。
3. 阻断：将转印膜放入含有蛋白质的阻断缓冲液中，防止非特异性结合。
通常使用的阻断缓冲液有牛奶粉、鸡蛋清或BSA。
4. 孵育：将特异性一抗加入阻断缓冲液中，与目标蛋白质发生特异性结合。
一抗的选择应该根据具体的研究目的来确定。
5. 洗涤：将转印膜反复洗涤以去除非特异性结合的抗体和杂质。
洗涤缓冲液的选择应该根据一抗的种类来确定。
6. 结合：加入特异性的二抗，与一抗结合形成免疫复合物。
二抗通常是由小鼠或兔子制备的抗小鼠或反兔子的抗体。
7. 洗涤：再次洗涤以去除未结合的二抗和杂质。
8. 检测：利用酶标技术将免疫复合物标记出来。
常用的酶标方法有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。
酶标反应产生的信号可以使用荧光、发光或显色来检测。
9. 分析：通过分析免疫印迹结果，可以确定目标蛋白质的存在与表达水平。
常用的分析方法有荧光成像、蛋白质印迹仪和密度分析软件。
Western-blotting 技术鉴定人血清免疫球蛋白lgG分子实验报告
Western-blotting 技术鉴定人血清免疫球蛋白lgG摘要：本实验利用Western-blotting 技术鉴定人血清免疫球蛋白lgG，主要包括利用SDS-PAGE进行蛋白质分离之后，将其转移至NC膜上进行蛋白免疫印迹并进行检测，实验中我们用了正常人血清蛋白，肺炎患者，白血病人患者三种血清，使用彩虹Marker，并用其作出标准曲线，以此求出其余IgG的分子质量，并根据不同样本条带颜色，面积等简要判断不同样本LgG含量的多少并给予解释。
关键词：免疫印迹技术；免疫球蛋白；SDS-PAGE引言：蛋白质免疫印迹技术,是1979年斯坦福大学乔治.斯塔克发明的蛋白质印迹法,继southern-blotting 之后起名 Western-blotting,是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究,抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面，是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术，其分析容量大，敏感度高，特异性强，是检测蛋白质性质、表达与分布的一种最常用的方法。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使其去折叠。
聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺和N,N’-亚甲基双丙稀酰胺经共聚合而成。
此聚合过程是由四甲基乙二胺和过硫酸胺激发的。
被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。
人血清中含有人类免疫球蛋白，根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类: lgG、lgA、lgM、lgD、lgE、lgG 是血清的主要抗体成分，占血清免疫球蛋白总量的70%~75%。
在电泳之后，利用抗原抗体结合的特异性，进行蛋白免疫印迹。
1.目的与要求a)掌握SDS-PAGE电源分离蛋白的实验技术和操作；并绘制蛋白质标准曲线,求目的蛋白分子量的方法；b)垂直板电泳装置的安装及灌胶；电泳所用试剂的配制；c)了解电泳过程中常见问题的原因及处理办法，不连续电泳系统分离蛋白质的原理以及垂直板电泳装置的安装和灌胶。
蛋白质免疫印迹检测Caspase-3的活化 预习报告
实验：蛋白质免疫印迹检测Caspase-3的活化预习报告（北医综合实验）一、Western Blot实验原理Western Blot (蛋白质免疫印迹法)是将经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维索薄膜——NC膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肤类型及其生物学活性不变。
然后以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相应的第—抗体(一抗)发生抗原抗体免疫反应，一抗再与酶或同位素标记的第二抗体发生免疫反应，经过底物显色或放射自显影来检测电泳分离的目的蛋白。
此方法是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，可以定性研究目的蛋白的相对分子质量，或者定量检测目的基因蛋白水平的表达。
通常，Western Blotting的实验操作包括两部分：1. SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE)(1)聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和少量交联剂N，N—甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)，通过化学催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂四甲基乙二胺(TEMED)的化学聚合作用交联聚合形成的三维网状结构的高聚物。
以此为支持物的电泳就称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis，简称PAGE)。
聚丙烯酰胺凝胶的浓度大时，形成的网孔孔径小，适于分离相对分子质量较小的物质，反之，要分离相对分子质量较大的物质就需要选择较小的凝胶浓度。
凝胶浓度与被分离物质的相对分子质量(M r)大小的关系，大致范同如表7-1：(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。
连续系统电泳体系中缓冲液的pH值及凝胶的浓度相同，带电粒子在电场作用下，主要靠电荷效应和分子筛效应进行分离。
不连续系统中缓冲液的离子成分和pH值、凝胶浓度及电位梯度都具有不连续性，带电粒子在电场中的泳动不仅依赖电荷效应和分子筛效应，还依靠浓缩效应，因而其分离的条带清晰度及分辨率均比连续系统高。
实验一 免疫印迹
实验一、免疫印迹免疫印迹又常称Western blot，是一综合性的免疫学检测技术。
它利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上（NC、尼龙或PVDF膜），最后进行免疫学检测。
由于免疫学检测敏感性高，并且通过SDS-PAGE样品中的待检蛋白得到了浓缩，因此，Western blot的灵敏度特别高，可达到放射免疫的分析水平。
而使用一般的免疫学检测技术（如ELISA、放射免疫沉淀）检测时，由于要求被检测蛋白可溶、要求抗体效价高、亲和力高和特异性强，往往并不容易达到目的。
而Western blot却没有这些缺点。
因此，Western blot广泛应用于生物样品中是否存在某一蛋白质（抗原）的检测。
也可用于粗略测定抗原蛋白的相对含量和抗原多肽链的相对分子量。
一、原理是SDS-PAGE电泳与免疫检测相结合的一种蛋白质检测方法。
强阴离子去污剂SDS与还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）时，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
然后将蛋白质转移到膜上，继而用抗体进行检测。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
二、实验材料诱导与未诱导的带有口蹄疫病毒保护性抗原VP1与LTB融合蛋白基因的工程菌。
三、仪器、耗材与试剂（一）仪器、耗材DYY－6C电泳仪、DYCZ－24D垂直板电泳槽、封口机、DYCP－40C半干式转移电泳槽、5ml、1ml、200μl、50μl、10μl移液器及相应的Tip、50ml烧杯。
蛋白质免疫印迹实验
蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）蛋白质免疫印迹（Western Blot）实验原理蛋白质免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的一种蛋白质检测方法。
对已知的表达蛋白，可以用相应的抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可以融合部分的已知片段进行检测，如HA-tag，Flag-tag，c-myc-tag等。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，被检测的是蛋白质，其中检测探针是相应的抗体，显色是使用的标记后的二抗。
经过PAGE凝胶分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，如醋酸纤维素膜，固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质。
然后以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，然后再与标记后的二抗起反应，经过底物显色以检测目的蛋白。
蛋白质免疫印迹（Western Blot）原理蛋白免疫印迹法主要分为三个阶段进行第一阶段是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在这个阶段，经过变性处理的蛋白质样品经SDS处理后会带上阴性电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中在电场的作用下从阴极向阳极泳动,且分子量越小,泳动速度就越快。
所以在此阶段，根据蛋白的泳动速度可以将样品中的蛋白质根据其分子量的大小进行分离，此阶段分离效果肉眼不可见。
如果想观察蛋白的电泳情况，可以在电泳完成后进行考马斯亮蓝染色进行观察；第二阶段为电转移，又称为转膜。
即将在凝胶中已经分离的蛋白质条带通过电场的作用转移至硝酸纤维素膜上, 一般选用恒流300 mA，通电90 min即可将凝胶中的蛋白条带转移到醋酸纤维素膜载体上。
转移到载体上的蛋白条带也是肉眼不可见的，如果想观察转移的效果，可以在转移后对载体进行丽春红染液染色。
第三阶段为酶联免疫显色检测将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使目的条带蛋白显色。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验⽅法原理步骤及注意事项实验⽅法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋⽩质转移到膜上，然后利⽤抗体进⾏检测的⽅法。
对已知表达蛋⽩，可⽤相应抗体作为⼀抗进⾏检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交⽅法类似，但Western Blot采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋⽩质，“探针”是抗体，“显⾊”⽤标记的⼆抗。
经过PAGE分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。
以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。
该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。
实验材料蛋⽩质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基⼄醇ddH2O⽢氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰⼄酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离⼼机离⼼管硝酸纤维素膜匀浆器剪⼑移液枪刮棒实验步骤⼀、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基⼄醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：⽢氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容⾄1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O⾄1000 ml。
5. 膜染⾊液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；⼄酸2 ml；ddH2O118 ml。
实验三 免疫印迹
Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白1. 背景印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern blotting。
之后，James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授又发明了RNA杂交检测技术，因与Southern blotting相似，故命名为Northern blotting。
George Stark这位教授在两年后又开发出类似的蛋白质检测方法。
1981年，在Neal Burnette所著的Analytical Biochemistry中，首次将单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western blotting。
此后开发的Eastern blotting是Western blotting的变形，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern blotting。
30年来，Western blotting技术已成为蛋白质研究中最常用的工具，用于鉴定目的蛋白是否存在样品当中，蛋白质的表达情况（上调或下调表达）和不同的样品之间的表达差异性。
pET系统是在E. coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。
目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶诱导。
T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。
2. 实验目的利用Western Blotting技术，定性（或定量）检测苦荞黄酮醇合酶基因（Flavonol synthase gene, FtFLS）在大肠杆菌表达宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的诱导表达。
Westernblotting蛋白免疫印迹实验
裂解液用量说明： 通常6孔板每孔细胞加入150μL裂解液，若细胞密度非常高可以适当加大裂解液用量至200μL或250μL。
22
3.1.2 蛋白含量测定
a).配制BCA工作液：根据标准品和样品数量，按50体积试剂 A,1体积试剂B配制适量BCA工作液，充分混匀。
b).将标准品、待测样品和工作液按下表加入到96孔板中，混
5
1.2 蛋白免疫印迹的应用
• 检测样品中特异性蛋白质是否存在
例转 ：移 李 桂 波 . 利 用 免 疫 印 迹 法 钓 取 P C 3 M 细 胞 中 与 人 前 列 腺 癌 高 相关特异性短肽结合蛋白的研究[D].吉林:吉林大学,2007.
• 对特异性蛋白质进行半定量分析
例：
6
1.3 WB的原理
积。 注意事项: • 过滤后4℃保存。 • 这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节pH值，而不用 Tris-HCL。 ④转移缓冲液：
2 . 9 g 甘 氨 酸 、 5 . 8 g Tr i s 碱 、 0 . 3 7 g S D S ， 并 加 入 2 0 0 m L 甲 醇 ， 加 水 至 总 量 1 L 。
匀。
管号 试剂(μL)
空白
标准管
管 1×3 2×3 3x3 4×3 5×3
6×3
测定管 ×2
蛋白质标准液 (1mg/mL)
0
1
2
4
6
8
10
—
蒸馏水(μL) 10 9
8
6
4
2
0
—
待测样(μL) — — —
—
—
—
—
10
BCA工作液 (μL)
200
200
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免疫印迹技术实验报告
免疫印迹技术实验报告
引言：
免疫印迹技术是一种广泛应用于生物学研究领域的实验方法，通过检测目标蛋
白在细胞或组织中的表达情况，可以帮助科学家深入了解生物体内的分子机制。
本文将介绍我们在实验室中使用免疫印迹技术的实验过程和结果，以及对实验
结果的分析和讨论。
实验材料与方法：
我们使用了以下材料和方法进行实验：
1. 细胞或组织样本：我们选择了人类肺癌细胞系A549作为研究对象，同时还
使用了正常肺组织作为对照组。
2. 蛋白提取：利用细胞裂解液将细胞或组织中的蛋白质释放出来。
3. SDS-PAGE凝胶电泳：将蛋白样品分离成不同大小的带状蛋白条带。
4. 转膜：将分离的蛋白迁移到聚合物膜上，以便进行后续的免疫检测。
5. 免疫检测：使用特异性抗体对目标蛋白进行检测，并使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗进行信号放大。
6. 显色：通过添加显色底物，使目标蛋白在免疫印迹膜上形成可见的带状条带。
7. 图像获取与分析：使用化学发光成像系统获取免疫印迹膜上的图像，并使用
图像分析软件进行定量分析。
实验结果：
在实验中，我们成功地提取了A549细胞和正常肺组织中的蛋白质，并进行了SDS-PAGE凝胶电泳分离。
通过免疫检测，我们发现在A549细胞中，目标蛋白
X的表达水平明显高于正常肺组织。
此外，我们还观察到在A549细胞中，目标蛋白Y的表达水平也有所上调。
对实验结果的分析与讨论：
通过实验结果的分析与讨论，我们可以得出以下结论：
1. 目标蛋白X在肺癌细胞中的过度表达可能与肺癌的发生和发展有关。
这一发
现与之前的研究结果相符，进一步验证了目标蛋白X在肺癌中的重要作用。
2. 目标蛋白Y的上调表达可能与肺癌细胞的增殖和侵袭能力增强有关。
这一发
现为进一步研究目标蛋白Y在肺癌发展中的功能和机制提供了线索。
进一步研究的展望：
基于本次实验结果，我们提出了以下进一步研究的展望：
1. 探究目标蛋白X在肺癌细胞中的功能和调控机制，以揭示其在肺癌发展中的
具体作用。
2. 研究目标蛋白Y的下游信号通路，以深入了解其在肺癌细胞增殖和侵袭过程
中的作用机制。
3. 进一步分析其他与肺癌发展相关的蛋白质，以综合了解肺癌发展的分子机制。
结论：
通过本次实验，我们成功地应用了免疫印迹技术对A549细胞和正常肺组织中
的蛋白质进行了检测，并发现了目标蛋白X和目标蛋白Y的表达水平异常。
这
些结果为我们进一步研究肺癌的发生和发展提供了重要的线索。
免疫印迹技术
作为一种重要的实验方法，将继续在生物学研究领域发挥重要作用，帮助科学
家们更好地理解生物体内的分子机制。