免疫印迹(immunoblotting)
immunoblotting免疫印迹法
immunoblotting免疫印迹法免疫印迹法（Immunoblotting）免疫印迹法是一种常用的实验技术，用于检测和分析蛋白质的存在与表达水平。
它结合了免疫学和电泳技术，能够帮助研究者确定特定蛋白质的分子量、定量和免疫反应性。
本文将对免疫印迹法的原理、操作流程和应用范围进行探讨。
一、免疫印迹法的原理免疫印迹法的原理基于抗原抗体反应。
首先，待检样品经过电泳分离，然后将蛋白质从凝胶转移到聚丙烯酰胺膜上。
接着，利用一系列步骤将目标蛋白质与特异性的一抗和二抗结合，形成特异性的免疫复合物。
最后，通过酶促发色反应，将免疫复合物标记出来，产生相应的信号。
二、免疫印迹法的操作流程1. 样品制备：待检样品应首先经过蛋白提取、浓缩和纯化处理，以保证分析的准确性。
其中关键的步骤是蛋白质的电泳分离，常用的方法有SDS-PAGE和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2. 转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚丙烯酰胺膜上，常用的方法有湿式和半湿式转印。
湿式转印适用于小分子量蛋白质，而半湿式转印适用于大分子量蛋白质。
3. 阻断：将转印膜放入含有蛋白质的阻断缓冲液中，防止非特异性结合。
通常使用的阻断缓冲液有牛奶粉、鸡蛋清或BSA。
4. 孵育：将特异性一抗加入阻断缓冲液中，与目标蛋白质发生特异性结合。
一抗的选择应该根据具体的研究目的来确定。
5. 洗涤：将转印膜反复洗涤以去除非特异性结合的抗体和杂质。
洗涤缓冲液的选择应该根据一抗的种类来确定。
6. 结合：加入特异性的二抗，与一抗结合形成免疫复合物。
二抗通常是由小鼠或兔子制备的抗小鼠或反兔子的抗体。
7. 洗涤：再次洗涤以去除未结合的二抗和杂质。
8. 检测：利用酶标技术将免疫复合物标记出来。
常用的酶标方法有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。
酶标反应产生的信号可以使用荧光、发光或显色来检测。
9. 分析：通过分析免疫印迹结果，可以确定目标蛋白质的存在与表达水平。
常用的分析方法有荧光成像、蛋白质印迹仪和密度分析软件。
免疫印迹法
原理
经过PAGE分离的蛋白质样品， 转移到固相载体（例如硝酸纤 维素薄膜）上，固相载体以非 共价键形式吸附蛋白质，且能 保持电泳分离的多肽类型及其 生物学活性不变。以固相载体 上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体 起反应，经过底物显色或放射 自显影以检测电泳分离的特异 性目的基因表达的蛋白成分。
免疫印迹法
商宇伟
定义
免疫印迹法（immunobiotting test，IBT） 也被称作酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoeletrotransfer blot，EITB），是 20世纪70年代末，发展起来的一门蛋白质多参 数检测技术。由于其与早先建立的核酸印迹法 southern blot相类似，所以习惯上又叫westernblot。
电泳2小时
转印结果的检查：电泳结束后，用丽春红对NC膜预染下，观察转移 效果。随后用水冲洗掉丽春红的颜色，进行封闭。
3、酶免疫定位
封闭：将上述得到的NC膜，用封闭液在摇床上过夜封闭。为了防止免
疫试剂的非特异性吸附。
清洗：封闭时间达到后用PBST清洗NC膜3次左右，每次约15分钟。 一抗孵育：清洗好后，加入一抗标记2小时左右。一抗一般选择源于兔
特点：HRP能激发化学发光显色底物发光，通过对X线胶片的曝 光，显影定影从而达到显色的目的。灵敏性很高且比较安全。
发光底物的配制： 2ml的A液+2ml的B液+6ml的SW。 摇床上与NC膜避光孵育5分钟。
总结
SDS-PAGE电泳分离蛋白 转膜
过夜封闭 PBST洗3次，每次15分钟 一抗孵育2小时 PBST洗3次，每次15分钟 酶标二抗孵育1小时 PBST洗3次，每次15分钟 DAB显色底物显色法显色 ECL显色法
免疫印迹实验报告
免疫印迹实验报告一、实验目的免疫印迹（Western blotting）是一种广泛应用于分子生物学、生物化学和免疫学等领域的技术，用于检测和定量特定蛋白质在样品中的表达水平。
本次实验的目的是通过免疫印迹技术检测目标蛋白在不同样品中的表达情况，以验证实验假设并为进一步的研究提供数据支持。
二、实验原理免疫印迹实验基于抗原抗体特异性结合的原理。
首先，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）将蛋白质样品按照分子量大小分离。
然后，将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜）上。
接着，膜与特异性抗体进行孵育，使抗体与目标蛋白结合。
最后，通过检测抗体的存在来确定目标蛋白的表达水平。
检测抗体的方法通常包括使用酶标记的二抗结合底物产生显色或发光信号，或者使用荧光标记的二抗通过荧光检测系统进行检测。
三、实验材料和设备1、材料细胞裂解液蛋白酶抑制剂蛋白标准品一抗（特异性针对目标蛋白）二抗（酶标记或荧光标记）化学发光底物（或荧光检测试剂）预染蛋白分子量标准硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜电泳缓冲液转膜缓冲液封闭液（如脱脂奶粉或牛血清白蛋白溶液）洗涤液（含吐温 20 的磷酸盐缓冲液）2、设备电泳仪和电泳槽转膜装置摇床冰箱酶标仪（或荧光检测仪器）四、实验步骤1、蛋白样品制备收集细胞或组织样本，加入适量的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，在冰上裂解一定时间。
离心收集上清液，即为蛋白样品。
2、 SDSPAGE 电泳制备 SDSPAGE 凝胶，根据目标蛋白的分子量选择合适的分离胶浓度。
将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性。
上样，进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部。
3、转膜电泳结束后，将凝胶浸泡在转膜缓冲液中平衡。
按照“三明治”结构组装转膜装置，依次为阴极、滤纸、凝胶、膜、滤纸、阳极。
在冰浴或冷室中进行转膜，根据蛋白分子量和转膜条件确定转膜时间。
4、封闭转膜结束后，将膜放入封闭液中，在摇床上孵育一定时间，以封闭非特异性结合位点。
免疫印迹(immunoblotting)
免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
主要实验步骤如下：1.蛋白质抽提a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。
加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
免疫印迹法
电泳2小时
转印结果的检查：电泳结束后，用丽春红对NC膜预染下，观察转移 效果。随后用水冲洗掉丽春红的颜色，进行封闭。
3、酶免疫定位
封闭：将上述得到的NC膜，用封闭液在摇床上过夜封闭。为了防止免
疫试剂的非特异性吸附。
清洗：封闭时间达到后用PBST清洗NC膜3次左右，每次约15分钟。 一抗孵育：清洗好后，加入一抗标记2小时左右。一抗一般选择源于兔
色法中最常用的底物，可以和HRP作用形
成褐色不溶性产物。反应速度快，灵敏性 较高，特异性好。但是显色后光照数小时
会褪色不易保存。
DAB显色液的配方： 9ml的0.01mol/L Tris-Cl(pH7.6) 1ml的0.3%的CoCl2 DAB少许 10ul的H2O2
2.化学发光显色法(ECL法)
免疫印迹法
商宇伟
定义
免疫印迹法（immunobiotting test，IBT） 也被称作酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoeletrotransfer blot，EITB），是 20世纪70年代末，发展起来的一门蛋白质多参 数检测技术。由于其与早先建立的核酸印迹法 southern blot相类似，所以习惯上又叫westernblot。
特点：HRP能激发化学发光显色底物发光，通过对X线胶片的曝 光，显影定影从而达到显色的目的。灵敏性很高且比较安全。
发光底物的配制： 2ml的A液+2ml的B液+6ml的SW。 摇床上与NC膜避光孵育5分钟。
总结
SDS-PAGE电泳分离蛋白 转膜
过夜封闭 PBST洗3次，每次15分钟 一抗孵育2小时 PBST洗3次，每次15分钟 酶标二抗孵育1小时 PBST洗3次，每次15分钟 DAB显色底物显色法显色 ECL显色法
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。
下面将详细介绍WB实验的具体步骤。
1.细胞裂解和蛋白质提取：首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集，并添加适量的裂解缓冲液。
使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱，使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。
再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。
2.蛋白质浓度测定：根据实验需要，采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度，以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。
3.蛋白质电泳：将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中，进行电泳。
电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移，分子量小的蛋白质迁移速度较快，分子量大的较慢。
电泳结束后，将凝胶转移到膜上。
4.膜上瞬时染色：在转移至膜上后，可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法，以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。
5.阻断：在膜上的蛋白质检测之前，需要对膜进行阻断处理，以防止非特异性结合。
常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液，进行阻断。
6.一抗反应：加入已稀释好的一抗抗体，与目标蛋白质特异性结合。
一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。
7.清洗：一抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的一抗抗体。
8.二抗反应：9.清洗：二抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的二抗抗体。
10.显色和成像：使用显色剂（如ECL）使膜上的蛋白质发生化学发光反应，然后将膜放入X射线片中，进行曝光。
最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。
11.数据分析：使用专业的成像软件分析成像结果，计算蛋白质的相对表达水平，并与内参蛋白进行比较。
需要注意的是，在进行WB实验的过程中，要严格操作，避免污染和交叉反应的出现。
同时，应根据实验需求选择适当的试剂和抗体，并进行标记、保存和储存等操作。
Western印迹法
Western印迹法Western 印迹法Western印迹法又称为免疫印迹（immunoblot）。
是用特异性抗体鉴定已被分离并转移到一种膜上的蛋白质混合物中的特殊抗原的方法。
即针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测的方法。
Western Blot 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上（固相载体以非共价键吸附蛋白质，并能保持其类型和生物学活性的不变）。
二、基本原理当蛋白质经高分辨率的SDS-PAGE电泳后，可被分离成许多不同的蛋白质区带，由于蛋白质的各个组分被固定于凝胶的网状结构中，可以将电泳后的蛋白带经电转移技术，转移到固相的硝酸纤维素膜上，再和特异性的抗体结合，经直接或间接抗原-抗体反应显示特异性的阳性条带。
Western印迹法分三个阶段进行第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移。
将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压转移即可完成。
此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位。
将印有蛋白条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体（一抗）和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色，阳性反应的条带清晰可辨。
三、操作步骤一）配制SDS-PAG 灌胶:分离胶浓缩胶二）上样蛋白质样品的制备直接用电泳加样缓冲液裂解细胞制备细胞蛋白质提取液三）SDS-PAGESDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关。
在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系。
丙烯酰胺凝胶对蛋白质的分辨范围丙烯酰胺（%[w/v]）分离范围（kDa）15 15~4512.5 15~6010 18~757.5 30~1205 60~212（四）蛋白质的电转移打开蛋白质转移槽的胶板，依次放入：海绵、两张滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、再两张滤纸、海绵（以上所有的材料都需缓冲液浸湿，凝胶也必须保持湿润），合上转移槽的胶板，放入转移槽中，凝胶在负极一侧，倒入转移缓冲液，电泳。
免疫印迹技术(Immunoblotting technique)
免疫印迹技术(Immunoblotting technique)免疫印迹技术又称蛋白质印迹(Western blotting)是一种借助抗原鉴定特异性抗体的有效方法，该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
本实验以检测可提取性核抗原(ENA)抗体为例。
【实验原理】先将ENA混合抗原经SDS-PAGE电泳，使各种抗原成分根据分子量不同区分开来，再通过电转印将各种抗原成分转印到硝酸纤维素薄膜上，血清中抗ENA抗体与硝酸纤维素薄膜上的ENA抗原成分结合，再与碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体结合，形成抗原抗体酶标抗体复合物，洗涤后加入底物显色，根据有无显色带的出现判断抗ENA抗体的有无，显色带的位置判断抗ENA抗体的类型。
【主要试剂与器材】1.ENA多肽抗体谱检测试剂盒包括印有ENA的硝酸纤维素薄膜、碱性磷酸酶记标的抗人IgG抗体、显色液(BCIP/NBT)、浓缩洗涤液和样品缓冲液、终止液、ENA多肽抗体标准带图谱等，有商品供应。
2.待检血清和阳性质控血清3.小型摇床、恒温箱、反应槽、吸管、微量移液器、滤纸等。
【操作方法】1.将浓缩洗涤液、样品稀释液按说明书用蒸馏水进行稀释。
2.抗原条放入反应槽中，每个槽内加入样品稀释液1.5ml浸泡5min后，弃去槽内液体。
3.用样品稀释液将血清1∶10稀释，吸取1.5ml稀释血清加入槽内，置小型摇床上孵育30min。
4.弃去槽内液体，每个槽内加入1∶10稀释的洗涤液 1.5ml浸泡5min后，弃去槽内液体，用吸水纸吸干。
5.吸取1.5ml用样品稀释液1∶10稀释AP标记的抗人 IgG，加入槽内，置小型摇床上孵育30min。
6. 同4洗涤。
7.每个槽内加入底物液1.5ml，置小型摇床上孵育 20min后，弃去槽内液体，用自来水洗净，加入终止液。
8.与标准显色带比较，判断结果。
【结果判断】将印迹膜上出现的显色区带与标准图谱比较，可判断哪种ENA抗体阳性。
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免疫印迹（immunoblotting）
免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
主要实验步骤如下：
1.蛋白质抽提
a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2.蛋白质定量：
按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)
将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.膜的封闭和抗体孵育
a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。
加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6.结果检测：
化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
7.数据分析：
目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。
8.实验报告，包括详细的实验方法及免疫印迹实验结果的相关图表。