质粒构建流程
一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术
一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术构建植物质体表达载体是一种将外源基因导入植物细胞并在植物细胞内进行表达的方法。
以下是一种常见的植物质体表达载体的构建方法及其应用与流程技术：
1.选择载体：选择适合植物质体表达的载体，通常是质粒
（plasmid）或病毒载体。
质粒载体通常由选择标记基因、启动子、终止子和目标基因构成。
2.克隆目标基因：将目标基因（外源基因）插入载体的多克
隆位点中。
这可以通过限制性内切酶切割质粒载体和目标基因的DNA，然后利用DNA连接酶将两者连接起来。
3.构建表达载体：将含有目标基因的质粒进行转化，例如通
过化学方法或电穿孔等手段将质粒导入植物细胞，形成表达载体。
4.选择转化植物细胞：通过对转化植物细胞进行筛选，例如
添加抗性选择剂或利用标记基因表达进行筛选，以筛选出含有目标基因的转基因植物细胞。
5.确认目标基因表达：通过PCR、RNA分析或蛋白质分析等
技术，检测和确认目标基因在转基因植物细胞内的表达情况。
6.稳定转基因植物的培养：将成功表达目标基因的转基因植
物细胞进行培养，以获得稳定转基因植物种子或植株。
7.功能性验证与应用：对获得的稳定转基因植物进行功能性
验证，例如检测表达的蛋白质具有特定的生物活性或应用
于农艺改良、抗病虫害等方面。
8.申请相关许可：如果打算将转基因植物及其产品用于商业
化目的，需要申请相关的许可和审批文件，以确保遵守法
规和伦理规范。
需要注意的是，植物质体表达载体的构建方法与特定目标基因、植物物种和研究目的有关。
1 载体构建流程
目录
载体构建概念 01 02 载体构建原理
载体构建流程 03 载体构建拓展 05
04 载体构建结果
01
载体构建概念
Ø载体构建的概念
载体构建的概念
酶切
连接
酶切
转化
鉴定
载体构建：在基因工程中，将能进入细胞、在装载了外来的NA片段后仍能照样复 制的运载体称为载体，常用的载体是人工构建的质粒。载体构建即是构建含外源 DNA的质粒，将其导入到宿主细胞并能正常复制和表达的过程。
05
载体构建拓展
Ø载体构建新技术
载体构建新技术
片段1
同源臂 片段3
同源臂
片段2
片段1
外切酶，50℃
片段3
片段2
50℃退火，外切酶逐渐失活
片段1
片段3 50℃连接酶修补切口
片段2
片段1
片段3
片段2
无缝克隆：载体末端和引物末端具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个 与载体序列同源性的碱基，依靠碱基间作用力互补配对成环，无需酶连即可直接用于转化宿主菌，进入宿 主菌中的线性质粒(环状)依靠自身酶系将缺口修复。
目的条带
凝胶成像
电泳图
纯化PCR产物
目的条 带凝胶
含DNA 的结合液
离心
离心
离心
高纯度DNA
结合液60℃，
结合
10min
洗涤
洗脱
酶切与连接
AluⅠ
目的片段
BamHⅠ
目的片段
酶切
HaeⅢ
酶切
EcoRⅠ
平末端
粘性末端
22℃，T4 DNA 连接酶催化，连 接2h
植物基因敲除技术步骤
植物基因敲除技术步骤植物基因敲除技术是一种重要的分子生物学工具，可以用来研究植物基因的功能、调控和相互作用。
随着生物技术的不断发展，植物基因敲除技术也得到了广泛的应用。
本文将详细介绍植物基因敲除技术的步骤，从克隆目标基因到诱导敲除突变，以及后续的分子分析和筛选鉴定。
希望通过本文的介绍，读者能够了解植物基因敲除技术的基本原理和操作流程。
一、获得目标基因序列在进行植物基因敲除之前，首先需要获取目标基因的序列信息。
这可以通过数据库查询、基因克隆或PCR扩增获得。
在获取基因序列的过程中，需要注意选择与植物物种相对应的启动子和终止子，确保敲除后的基因调控与表达情况与野生型相似。
二、选择合适的敲除载体获得目标基因序列后，需要选择合适的敲除载体。
敲除载体通常包括T-DNA插入的质粒，其中包含了目标基因的敲除片段、选择标记基因和辅助元件等。
通过选择适当的选择标记基因，可以实现对敲除突变体的诱导和筛选。
三、构建敲除质粒构建敲除质粒是植物基因敲除技术的关键步骤。
将目标基因的敲除片段与T-DNA插入质粒进行连接，然后将所构建的质粒导入大肠杆菌等细菌中进行扩增。
接着进行PCR鉴定和限制性内切酶酶切鉴定等实验，以确认质粒的构建是否成功。
四、植物转化将构建好的敲除质粒导入植物体细胞中进行转化。
目前，常用的转化方法包括农杆菌介导的转化和基因枪介导的转化。
通过这些方法，可以将质粒导入植物体细胞中，从而实现对目标基因的敲除。
五、筛选敲除突变体经过植物转化后，需要对转化植株进行选择和筛选，以获取目标基因的敲除突变体。
这通常通过对转化植株进行抗性筛选或对表型进行鉴定识别等方法。
通过严格的筛选，最终可以获得目标基因的敲除突变体。
六、分子鉴定对获得的敲除突变体进行分子鉴定，确认目标基因的敲除情况。
通过PCR鉴定、Southernblotting等方法，可以验证目标基因是否被成功敲除。
七、功能分析对获得的敲除突变体进行功能分析。
可以通过表型分析、生理生化指标测试等方法，研究敲除基因对植物生长发育、抗逆性等方面的影响，从而揭示基因在生物体中的功能和作用途径。
质粒目的基因插入及引物设计流程
在AflI后至BamHI 前的序列插入目的基因序列，并选择features给插入的目的基因命名UGT1A1
在目的基因的终止密码子TGA前还需再加上HA tag标签（阳性对照蛋白，即质粒转染并成功表达的话，该段蛋白必定存在，可用WB测出），标签序列登录addgene官网查询：
寻找目的基因mRNA序列及CDS阅读框（蛋白质对应的基因序列）
选中CDS开发阅读框（表达蛋白的序列）基因序列，共162个碱基； 注意CDS特征，前段非编码区如果太长，需要增加保护序列；后端非编码区如果长，
则说明CDS序列稳定可用；
将查到的CDS序列粘贴至new DNA file框中，选择linear类型DNA，软件即可自动分析该 段序列中的可能酶切位点
三.克隆引物设计
2量少，Tm尽量小的原则，5端后选20个左右；3端从酶切位点终点往前数59个， 因为除去CDS框的20个碱基后还要包括HA位点和酶切位点序列。
5端引物序列即为atggctgtggagtcccag，
01
但是还要再加上一段保护碱基AAATATATCTTAAG
02
最后可得Forward primer为AAATATATCTTAAGatggctgtggagtcccag
03
tcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct
目的基因的20个碱基
3端引物设计的起点（不含BamHI酶切位点）和方向
最后要把引物顺序调整过来，点击“5→3”既得Reverse primer序列tcaAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAatgggtcttggatttgtgggct
（本实验的UGT1A1为肝脏中存在的一种药物代谢酶，因此最好选择肝脏细胞系），提取
稳转细胞系构建流程
稳转细胞系构建流程英文回答：Stable cell line generation workflow.Stable cell line generation is a crucial technique in cell biology and biotechnology. It involves introducing genetic material into a host cell to create a cell linethat stably expresses the desired gene product. This approach allows for the production of therapeutic proteins, industrial enzymes, and other valuable products.The workflow for stable cell line generation typically includes the following steps:1. Plasmid construction: The gene of interest is cloned into an expression vector, which contains elements necessary for gene expression, such as a promoter, transcription termination signal, and selection marker.2. Transfection or transduction: The expression vectoris introduced into the host cell using a variety of methods, including transfection with chemical reagents or electroporation and transduction with viral vectors.3. Selection: Cells that successfully take up and express the expression vector are selected using a suitable selection marker, such as antibiotic resistance or fluorescence.4. Clonal expansion: Individual cells are isolated and expanded to establish clonal cell lines.5. Characterization: Clonal cell lines arecharacterized for their expression levels, stability, and other relevant properties to identify those with thedesired characteristics.Stable cell lines are essential tools for basic research, drug discovery, and industrial biotechnology.They offer several advantages over transient expression systems, including sustained and high-level production ofthe desired gene product, genetic stability, andscalability for large-scale production.中文回答：稳转细胞系构建流程。
一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术
一种植物质体表达载体的构建方法及应用与流程技术植物质体表达载体是一种用于将外源基因转化至植物质体中进行表达的工具，具有许多应用于农业、医药和工业领域的潜力。
本文将介绍一种常用的植物质体表达载体构建方法以及其在相关领域的应用和流程技术。
植物质体是细胞中的一种特殊器官，其中包含了丰富的DNA、RNA 和蛋白质。
通过将外源基因导入质体中进行表达，可以使植物细胞产生特定的蛋白质，从而实现对目标基因功能的研究和生产特定蛋白质的目的。
一种常用的植物质体表达载体构建方法是利用嵌合质粒。
嵌合质粒是由质体和细菌染色体DNA片段组合而成的具有双重起源和选择标记的质粒。
该方法的具体步骤如下：步骤一：选择合适的细菌质粒作为载体。
常用的载体包括Agrobacterium、E. coli等。
首先根据需要选择合适的细菌质粒，该质粒需要能够稳定复制并在植物中高效表达外源基因。
步骤二：选择合适的启动子和终止子。
启动子是控制基因转录起始的区域，终止子是控制转录终止的区域。
通过选择适合的启动子和终止子，可以调控外源基因在植物细胞中的表达水平。
步骤三：克隆外源基因。
将目标基因克隆到载体上，通常使用限制酶切和DNA连接技术。
可以选择不同的限制酶来线性化质粒和选择目标基因以适应不同的表达需求。
步骤四：转化植物细胞。
通过植物转基因技术将构建好的载体导入植物细胞中。
常用的方法包括农杆菌介导的转化和基因枪法。
步骤五：筛选转化成功的植物。
使用适当的选择标记基因，如抗生素抗性基因，来标记成功转化的植物细胞。
通过诱导植物细胞分化和培养，最终得到转化植株。
植物质体表达载体在农业、医药和工业领域有广泛的应用。
在农业领域，该技术可以用于改良作物，使其具备抗病虫害、耐逆性、提高产量等特点。
在医药领域，植物质体表达载体可以用于生产重要的药物和疫苗，如疫苗蛋白、抗体等。
在工业领域，该技术可以用于生产生物材料和生物燃料等高附加值产品。
总结起来，植物质体表达载体构建方法主要包括选择合适的载体、启动子和终止子，克隆外源基因，转化植物细胞，筛选转化成功的植物等步骤。
质粒大提原理
质粒大提原理
质粒大提原理（Plasmid Maxiprep Principle）是指在实验室中从大容量培养物中纯化大量质粒DNA的方法。
它是分子生物学中非常重要的技术，用于提取纯度较高的质粒DNA，以满足高效率的转染和进一步的实验需求。
质粒大提原理的基本流程包括以下几个步骤：
1. 质粒培养：将含有目标质粒的细菌在培养基中大量培养，以增加质粒的数量。
2. 细胞收获：将培养的细菌离心，收集菌体沉淀。
3. 菌体裂解：使用裂解缓冲液将菌体裂解，释放出细胞内的质粒DNA。
4. 蛋白质去除：通过加入蛋白酶和盐，除去蛋白质，使DNA 不受干扰。
5. DNA精制：通过加入酒精沉淀以及洗涤步骤，去除杂质，提纯DNA。
6. DNA溶解：将精制后的DNA用适当的溶液溶解，以便后续实验使用。
质粒大提原理的关键是将培养所得的细菌菌体裂解，释放出细胞内的质粒DNA。
通过一系列的化学处理和物理分离步骤，可实现对质粒DNA的提纯和纯化。
这样，可以获得足够高纯度的质粒DNA，以进行后续的分子生物学实验，例如重组DNA构建、基因克隆、基因表达等。
总结来说，质粒大提原理是一种利用细菌培养和DNA分离技
术，从大容量培养物中高效提取质粒DNA的方法。
它在分子生物学研究中有着广泛的应用，并为后续实验奠定了基础。
基因工程药物之干扰素的制备流程
基因工程药物之干扰素的制备流程概述干扰素是一类重要的基因工程药物，具有抗病毒、抗肿瘤等作用。
本文将详细介绍干扰素的制备流程，包括干扰素的基因工程、表达和纯化等主要步骤。
1. 干扰素的基因工程干扰素的基因工程是制备干扰素的第一步，可以通过重组DNA技术构建包含干扰素基因的重组质粒。
具体步骤如下：•选择干扰素基因：从已知的干扰素基因库中选择合适的基因序列。
•克隆基因：将选定的干扰素基因通过PCR扩增等技术获得基因片段。
•构建重组质粒：将干扰素基因插入适当的表达载体中，构建重组质粒。
2. 干扰素的表达完成基因工程后，接下来是通过表达系统将干扰素基因表达为蛋白。
常见的表达系统包括大肠杆菌、哺乳动物细胞等，其中大肠杆菌表达系统是最常用的。
表达步骤如下：•转染表达宿主：将构建好的重组质粒导入表达宿主中。
•培养表达宿主：在适当的培养条件下，培养表达宿主，促使干扰素基因表达为蛋白。
•蛋白提取：采用合适的方法提取表达的干扰素蛋白。
3. 干扰素的纯化获得表达的干扰素蛋白后，还需要进行纯化步骤，将目标蛋白从其他杂质中分离出来，确保干扰素的纯度。
常见的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析等：•亲和层析：利用干扰素与某种亲和基质之间的特异识别作用，实现干扰素的分离纯化。
•离子交换层析：根据蛋白的电荷性质，通过离子交换柱将干扰素与杂质分离。
4. 干扰素的检测与质控最后一步是对制备好的干扰素进行检测与质控，确保其质量符合要求。
常见的检测方法包括SDS-PAGE凝胶电泳、Western blotting等：•SDS-PAGE凝胶电泳：通过电泳分析蛋白的相对分子质量。
•Western blotting：通过特异抗体的靶向检测确认蛋白的存在。
结语通过上述步骤，干扰素的制备工作完成，得到的干扰素蛋白可以用于临床治疗等用途。
干扰素的基因工程、表达和纯化过程都需要严格控制，保证干扰素的质量和稳定性，为临床应用奠定基础。
fosmid 质粒提取流程及方法
Fosmid质粒提取方法及流程细菌培养1）按照流程构建fosmid，转染后的克隆约2.0ml，加入等体积的LB培养基37度，180rpm培养过夜。
2）吸取过夜培养物2.0ml用于加甘油保存，另外2.0ml接种到10mlLB（含氯霉素）中，加入诱导剂阿拉伯糖（终浓度为0.1mg/ml），250rpm培养超过5小时（过夜）（菌体要足够浑浊），小样法提取质粒。
注意：此处用50ml离心管，保证一定的空气。
质粒提取：1、菌液分装：取2.0ml菌体于Ep管，12000rpm离心30秒，弃上清液；2、加0.lml溶液I(50mM葡萄糖，10mM EDTA pH8.0，25mM Tris-HCl pH8.0)充分混合；3、加入0.2ml溶液II(0.2 N NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min ；4、加入0.15ml溶液III(3M KAc，11.5%冰乙酸)，轻轻翻转混匀，置于冰浴15 min ；5、以12000rpm离心5min，取上清液于另一新Ep管；6、加入等体积的苯酚-氯仿，混匀后12000rpm离心5min；7、取上清液于另一新Ep管，加入等体积异丙醇，充分混匀，室温放置10min，12000rpm，4℃离心10min。
8、 吸掉上清，加1ml 70%乙醇，轻弹管壁，使沉淀悬浮并反复颠倒几次，之后，12000rpm，4℃离心3min。
9、 吸掉上清，然后加1ml无水乙醇，轻弹管壁，使沉淀悬浮并反复颠倒几次，12000rpm，4℃离心3min。
倒掉上清，室温放置约30min至乙醇完全挥发干净。
10、每管加入20µl TE溶解沉淀（含Rnase，终浓度20ng/ul），用手轻弹管壁，室温1h消化。
注：质粒提取完后用0.6%琼脂糖凝胶电泳检测质粒大小及浓度。
表达质粒重组和转化的主要技术流程
表达质粒重组和转化的主要技术流程1.首先，需准备目的质粒和DNA的供体质粒，用于质粒重组实验。
First, the recipient plasmid and the donor plasmid needto be prepared for plasmid recombination experiment.2.将供体质粒进行酶切，以释放目的基因片段。
The donor plasmid is digested with enzymes to release the target gene fragment.3.将目的基因片段和目的质粒进行连接，形成重组质粒。
The target gene fragment is ligated with the recipient plasmid to form a recombinant plasmid.4.将重组质粒转化至宿主细胞中，使宿主细胞具有目的基因。
The recombinant plasmid is transformed into host cells to introduce the target gene into the host cells.5.转化宿主细胞的方法包括热冲击法、电穿孔法、化学法等。
Methods for transforming host cells include heat shock, electroporation, and chemical methods.6.通常使用大肠杆菌作为转化的宿主细胞。
E. coli is commonly used as the host cell for transformation.7.转化宿主细胞后，将细胞在含有选择性抗生素的培养基中培养。
After transforming the host cells, the cells are cultured in a selective antibiotic-containing medium.8.选择性抗生素可杀死未转化的细胞，只留下携带质粒的转化细胞生长。
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质粒构建流程一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。
使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。
3）选择载体。
根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。
如pcDNA3.1(+)，4）选择酶切位点。
对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。
载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。
5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。
6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。
一般选择三个保护碱基。
7）引物设计完成，送公司合成。
二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒：Bioteke 高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL 4℃、漂洗液RW -20℃保存）准备：冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套操作步骤：1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。
2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。
3）4℃，12000rpm离心10min。
4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl）5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s7）弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s9）弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min11）吸附柱放入新EP管，加50μl RNase free water于膜上，室温放置2min12）4℃，12000rpm离心60s13）点样：5μl RNA+ 1μl 10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。
14）-20℃保存2.RNA反转录试剂盒：TaKaRa primescript RT reagent kit with gDNA eraser（-20℃保存）准备：冰盒，②④⑤⑥取出解冻，①③为酶不可取出，预冷离心管操作步骤：1）基因组DNA去除（10μl体系）② 5×gDNA eraser buffer 2μl① gDNA eraser 1μlTotal RNA 4μl(可根据RNA浓度调整)⑥ RNase free water 3μlPCR仪中进行，程序：42℃，2min→4℃注：RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入2）反转录反应（20μl体系）④ 5×primerScript buffer 2 4μl③ primerScript RT enzyme mix I 1μl⑤ RT primer mix 1μl⑥ RNase free water 4μl1）反应液10μlPCR仪：37℃，15min→85℃，5s→4℃注：可直接将第2步反混合液好后加入到第1步反应液中3）1.5mlEP管收集，-20℃长期保存3. PCR扩增高保真酶primerstar扩增，50μl5×PS buffer 10μldNTP 4μldH2O 32.5μlPrimerstar 0.5μlcDNA 1μl(可变)R-primer 1μlF-primer 1μl点样：5μl PCR产物+ 1μl 6×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，15min4.PCR产物纯化1）液相纯化（产物电泳结果只含目的条带）试剂盒：Microelute cycle-pure spin protocol(OMEGA bio-tek) D6293-01①将PCR产物加入1.5mlEP管，加入5倍体积buffer CP，混匀。
②转移至HiBind MicroElution DNA 柱（套收集管），室温离心10000g，1min。
③弃废液，加700μl DNA wash buffer（含乙醇）到柱子，室温离心10000g，1min。
④弃废液，重复③⑤弃废液，空管离心13000g，1min⑥柱子放入新EP管，加10-20μl Elution buffer到膜上，室温孵育3-5min，离心10000g，1min⑦电泳检测2）割胶回收（产物电泳结果含杂带）①将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5ml EP管。
②加等体积（1g=1ml）binding buffer（XP2）,60℃金属浴7min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min③溶液加入离心柱，离心10000g，1min，废液倒回再离一次④弃废液，加300μl binding buffer（XP2），离心10000g，1min⑤弃废液，加700μl SPW washing buffer，离心10000g，1min⑥重复⑤⑦空管离心13000g，2min，弃废液，柱子转移到新EP管⑧加入30-50μl elution buffer于膜上，室温孵育1min，离心13000g，1min⑨ 电泳检测三、双酶切30μl 反应体系如下：PCR 纯化产物 15μl10×M/L/K buffer 3μl3dH2O 10μl酶A 1μl酶B 1μl反应条件：takara 酶30℃水浴1h →65℃金属浴10min 终止反应注：buffer 类别依使用的酶具体选择，见附表四、连接1）双酶切后，可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2μl2）酶切产物液相纯化3）20μl 连接体系（皆可）PCR 产物 5μlpcDNA3.1 2μl10×T4buffer 2μlT4 ligase 1μl3dH2O 10μlPCR 仪中进行：22℃，30min →4℃冰箱过夜注：连接产物-20℃可长期保存五、转化准备：碎冰，灭菌EP 管、LB 空液体培养基，带抗性培养板，超净工作台，移液枪，水浴锅加热42℃1）将感受态细胞置于冰上，待其融化2）超净工作台中，将连接产物10μl 加入100μl 感受态细胞，或质粒1-3μl 加入100μl 感受态细胞3）轻混匀，冰浴30min4）热击水浴42℃，45s ，冰浴1min5）加900μl LB 空培养基，摇菌150rpm ，37℃，1h6）浓缩离心13000rpm ，1min ，上清液留约200μl 重悬菌体，部分涂板（50-100μl ）7）完全吸收后，37℃倒置培养12-16h六、菌落PCR1）以rTaq 酶50μl 体系配制PCR3dH2O 35.7μl 10×buffer 5μl MgCl2 3μl dNTP 4μl rTaq 0.3μl R-primer 1μlF-primer 1μl2）灭菌牙签挑单菌落放入PCR体系中搅一下，再在新板划板（注意编号），每板挑10个菌。
新划的板37℃倒置培养12-16h。
3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，记录含目的条带的菌落号备用。
七、测序1.摇菌1）PCR检测有目的条带的菌落，挑选2-3个较好的以供摇菌2）三角瓶中分装10ml LB抗性液体培养基3）用10μl 枪头挑起选择的菌落打到培养基中4）37℃。
250rpm摇菌12-16h2.送样每瓶取1ml箘液，送华大基因测序3.比对将测序结果与基因序列进行比对，比对正确则构建成功，比对错误则重新构建。
（注：数据库中基因序列可能有误，若出现少数突变，可换其他数据库比对试试）八、菌种保存菌种比对成功，则可保存菌种备用。
1）超净工作台中取1.5mlEP管，加200μl 80%灭菌甘油。
2）再加入800μl 箘液，轻混匀。
3）液氮冻存。
（一个基因冻2管即可）九、质粒提取菌种比对成功，冻存菌种后，箘液用于提取质粒。
试剂盒：AXYGEN axyprep plasmid miniprep kit 250-prep操作步骤：1）取3-5ml箘液，室温下离心10000g，1min2）弃上清，加250μl solution I/ RNase A 重悬菌落，混匀3）加250μl solution II，倒置轻混匀，孵育2min。
（整个裂解反应不超过5min）4）加入250μl solution III，立即倒置混匀，直到生成白色絮状沉淀。
5）室温离心13000g，10min6）上清液小心转入HiBind miniprep column(有套管)，室温离心10000g，1min7）弃废液，加500μl buffer HB，室温离心10000g，1min8）选择性步骤：重复第7步9）弃废液，空管室温离心13000g，2min10）柱子转入新EP管，加30-50μl elution buffer或3dH2O到膜上，室温孵育1-2min11）室温离心13000g，1min12）提取的质粒-20℃保存备用附：感受态制备方法（皆采用LB空白培养基）：1. 菌种活化1）用接种环直接取冻存的E.coli/ DH5α菌种，在LB平板上划线，37℃倒置培养16h2）挑单菌落转到2-10ml LB液体培养基中，摇菌37℃，250rpm，12-16h3）取1ml箘液加入到100ml LB液体培养基，摇菌37℃，250rpm，3h4）检测箘液OD600≤ 0.5（0.3-0.4）2.感受态制备准备：0.1M CaCl2灭菌，50ml离心管灭菌，冰水，1.5ml离心管冰上预冷，离心机4℃预冷。
步骤：1）将箘液用50ml离心管分装，调平，4℃离心3000rpm，8min2）弃上清，0.1M CaCl2 10ml重悬（冰水中进行，动作轻），两管合成一管3）冰上放置一段时间，4℃离心2500rpm，8min4）弃上清，0.1M CaCl2 10ml重悬，4℃冰箱过夜沉淀5）上清液取出8ml，剩2ml，加670μl 80%甘油（箘液：80%甘油=3:1），轻混匀6）1.5mlEP管分装，每管分装100μl ，液氮冻存。
试剂配制：1.琼脂糖凝胶（1.2%）琼脂糖粉0.6g1×TAE 50ml微波炉加热溶解，冷却一会儿后加入1μl gold view核酸染料，混匀，倒板2.电泳缓冲液TAE（50×）2mol/L tris-碱242g1mol/L 冰醋酸57.1mlEDTA(pH8.0) 18.622g二蒸水至1L用NaOH调节pH至8.6，常温储存。
用时稀释成1×溶液使用。
3.LB培养基Yeast extract（酵母提取物）1gTryptone 2gNaCl 2gAgar powder（琼脂粉）3g（配1.5%固体培养基时加入）二蒸水200ml灭菌20min，冷却后加入抗生素。