抗体生成细胞检测.
免疫学检查
CD4+/CD8+↓,s IL-2R ↑↑,透明
3. 血清sIL-2R↑、CRP↑、RF(+)、Ig↑
3.常见的器官特异性自身免疫病与异常免疫指标
肺嗜酸粒细胞浸润症 1. 外周血与痰中嗜酸粒细胞计数↑
(pulmonary infiltration 2. 血清与BALF中IgE↑，Ig↑
with eosinophilia, PIE) 3. 过敏原皮肤试验呈阳性
三、机体免疫功能检查
(一)非特异性免疫功能测定
1. 血清蛋白区带电泳
-
+ 白蛋白
α1、α2清蛋白区带电泳示意图谱
三、机体免疫功能检查
2. 外周血中性粒细胞计数，趋化、吞噬、杀菌 功能测定
① 趋化功能降低：易反复感染、齿龈炎、中耳炎、 Chediak- Higashi综合征、迟钝性白细胞综合征、有 肌蛋白功能不全、高 于IgE综合征等。 ② 吞噬功能降低：中性粒功能异常综合征、补体所 致调理缺陷症、 膜糖蛋白缺陷症、慢性肉芽肿、肌 动蛋白功能不全等。 ③ 杀菌功能降低：慢性肉芽肿、多发性骨髓瘤、巨 球蛋白血症、 慢性粒白血病、糖尿病等
❖ 均质型：抗组蛋白抗体，见于所有活动期SLE者
❖ 周边型：抗ds-DNA，见于SLE，特别伴肾炎者
❖ 核仁型：抗核糖体或抗U3RNP，见于SLE、SSc
❖ 散在斑点型：抗着丝点抗体，见于Crest综合征
❖ 斑点型：抗uRNP抗体(核糖核蛋白)，高滴度见于MCTD， SLE、SSc
❖
抗SM抗体(U族RNA)，见于30%~ 40%SLE
过敏性支气管肺曲霉菌病 1.烟曲菌抗原皮肤试验呈速发和迟发型双相反应
(allergic brochopulmonary 2. 血清特异性IgE呈阳性，总IgE ↑
免疫荧光方法
（2）实验方法（1）用PBS浸洗准备好的细胞涂片3次，每次3min。
（2）0.1%的TritonX-100（用PBS配制）处理涂片5-10min。
（3）PBS洗净载玻片上的TritonX-100，加0.1%的牛血清白蛋白BSA溶液(用PBS 配制)孵育固定好的细胞30min。
（4）弃去BSA，滴加0.1%BSA稀释的一抗(1:200)，即软骨多糖诱导48hH22细胞免疫的小鼠血清，免疫湿盒中4℃过夜。
同时用正常小鼠血清作对照。
（5）用PBS浸洗细胞涂片3次，每次3min，以确保一抗清洗彻底。
（6）避光条件下滴加BSA稀释的荧光标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1:200)，然后室温、暗室中孵育1.5-2h。
（7）PBS洗净荧光二抗，用荧光显微镜观察。
为了防止由于一抗未洗净带来的假阳性现象，实验中同时设置一组阴性对照，涂片染色操作步骤同上，把一抗换成PBS。
3.4.1.1免疫荧光染色法检测抗原、抗体结合情况将H22鼠肝癌细胞制成细胞涂片，分别以空白组小鼠血清、模型组小鼠血清和免疫组小鼠血清为一抗，经荧光二抗染色后得到免疫荧光检测结果，并计算各组细胞的阳性表达率，结果如图3-1所示。
(a) (b)(c)(d)*P<0.01vs模型组,#P<0.01 vs空白组图3-1免疫荧光染色法检测抗体生成Fig.3-1 Theimmunofluorescent staining for antibody test图3-1中(a)、(b)、(c)一抗分别为空白组小鼠血清、模型组小鼠血清、免疫成功小鼠血清，(d)为免疫荧光阳性表达率。
从图3-1中可以看出，一抗为空白小鼠血清的荧光极弱，一抗为模型组小鼠血清的荧光仍然不强，而一抗为治愈小鼠血清的荧光很强，阳性表达率达到了90%以上。
说明免疫成功小鼠血清中存在能与肿瘤抗原结合的特异抗体，免疫小鼠的体液免疫得到增强。
血清中的特异性抗体是由与其相对应的肿瘤特异抗原激活B淋巴细胞产生的。
免疫分析法
人改型抗体（reshaped humanized antibody）；
小分子抗体； 双特异性抗体（bispecific antibody）等。
在体内发生的抗原抗体反应为体液免疫应答的效
应作用。体外的抗原抗体结合反应主要用于抗原
或抗体的检测，用于免疫学诊断。
在药物分析中，免疫分析法的 应用主要集中在以下几方面：
(1) 在实验药物动力学和临床药物学中，测定生物利用度 和药物代谢动力学参数等生物药剂学中的重要数据，以 便了解药物在体内的吸收、分解、代谢和排泄情况； (2) 在药物的临床检测中，对治疗指数小、超过安全剂量 易发生严重不良反应或最佳治疗浓度和毒性反应浓度有 交叉的药物血液浓度进行监测； (3) 在药物生产中，从发酵液或细胞培养液中快速测定有 效组分的含量，以实现对生产过程的在线监测； (4) 对药品中是否存在特定的微量有害杂质进行评价。
热力学分析： 半抗原和载体蛋白结合后热力
学特征会有变化，差异可通过差示扫描量热法 （DCS）等方法测定。
定量测定方法 相对含量测定法： 通过 ELISA 法比较半抗原
与载体蛋白的相对结合量。
绝对含量测定法： 半抗原具有与载体蛋白完
全不同的广谱吸收特征，且半抗原在此特定波 长下具有较强的吸收；或能利用特定的化学反 应定量测定半抗原的量，且不与载体蛋白发生 反应。
主要内容
一、概述
二、抗原
三、抗体与免疫反应
四、免疫分析方法及应用
五、免疫扩散法
免疫分析实际上是一种特殊的试剂分析， 特点是抗体/抗原成为分析试剂。
1、抗体的结构与功能
抗体泛指机体经抗原刺激由免疫活性细胞 产生的一组免疫球蛋白，通常由两条相同 的重链和两条相同的轻链组成 常用的是IgG分子，其在血清免疫球蛋白 中的含量约70%
血小板 抗原抗体检测
血小板抗原
血小板抗原
血小板抗原
24个抗原主要分布在糖蛋白GPⅡb，GPⅢa，GPⅠb，GPⅠa 以及CD109上 ；
GPⅢa（CD61）携带9种HPA抗原，分别为HPA-1，HPA-4， HPA-6bw，HPA-7bw，HPA-8bw，HPA-10bw，HPA-11bw， HPA-14bw，HPA-16bw GPⅡb（CD41）是跨膜蛋白，细胞外116 kD的重链，通过 二硫键与22 kD的轻链共价结合。GPⅡb上携带 HPA-3和 HPA-9bw；
血清学定型 即用已知特异性抗体检测血小板血型抗原 缺点：特异性抗体来源困难 ---人血清中血小板抗体通常为多特异性 ---单克隆抗体匮乏，目前国际上仅有HPA-1a单抗， 无其它HPA单抗。 基因定型 限制性片段长度多态性分析（RFLP） 序列特异性寡核苷酸聚合酶链反应(PCR-SSO) 序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)
血小板抗体检测 血清学 ELISA法(酶联免疫试验) 血小板抗原单抗特异性固相化法(MAIPA) 固相血小板免疫血清学试验(SPISA)
简易致敏红细胞血小板血清学试验(SEPSA)
流式细胞仪 改良抗原俘获(ELISA) 免疫荧光试验
简易致敏红细胞血小板血清学试验 SEPSA
由HLA抗体引起PTR约占80%，其次为HPA或ABO抗体。 现由于临床广泛输注去白细胞的成分血治疗血液病，发病 率已经大为下降
血小板相关疾病-血小板输注无效(PTR）
非免疫学原因(67.3%) 发热 脾功能亢进 感染 药物作用 DIC 血小板的质量问题 免疫学原因(17.5%) HLA抗体 HPA抗体 ABO血型不合 血小板自身抗体 药物 预防 1.白细胞过滤 2.辐照 3. HLA和HPA配型输注
免疫系统功能评估
免疫系统功能评估1.简介免疫系统是人体内一个复杂而强大的防御系统，它可以帮助人体识别和抵御各种外来病原体和异常细胞。
为了评估免疫系统的功能，科学家们开发了许多方法和指标。
本文将介绍免疫系统功能评估的常用方法和指标。
2.血液细胞计数血液细胞计数是评估免疫系统功能的一种常见方法。
通过检测血液中不同类型的细胞数量，可以了解免疫系统的状况。
一般来说，白细胞数量的增加可能表示免疫系统正在应对感染或炎症反应，而白细胞数量的减少可能表示免疫系统功能受损。
3.血清免疫球蛋白水平血清免疫球蛋白水平是评估免疫系统功能的另一个重要指标。
免疫球蛋白是免疫系统产生的重要抗体，可以帮助身体抵御病原体的侵袭。
通过检测血液中不同类型的免疫球蛋白水平，可以评估免疫系统的抗体生成能力。
免疫球蛋白水平的降低可能表明免疫系统功能下降。
4.细胞介导的免疫功能评估细胞介导的免疫功能评估是一种更为专业和复杂的方法，用于评估免疫系统的特定功能。
例如，通过检测特定T细胞的活性或测量特定细胞的细胞毒性，可以对免疫系统在抗击特定病原体或肿瘤细胞方面的功能进行评估。
5.免疫功能指标综合评估为了对免疫系统的功能进行综合评估，还可以结合上述方法和指标来进行评估。
通过综合考虑血液细胞计数、血清免疫球蛋白水平和细胞介导的免疫功能等指标，可以更全面地了解免疫系统的整体功能状态。
6.结论免疫系统功能评估是了解免疫系统状况的重要手段。
血液细胞计数、血清免疫球蛋白水平和细胞介导的免疫功能评估是常用的方法。
综合这些指标可以更准确地评估免疫系统的功能状态。
通过评估免疫系统功能，可以帮助人们及时了解免疫系统是否存在问题，并采取相应的治疗干预措施。
以上是免疫系统功能评估的一些常用方法和指标，希望对您有所帮助。
简述抗体产生的一般规律及意义
简述抗体产生的一般规律及意义抗体产生的一般规律及意义抗体，也称为免疫球蛋白，是一种身体免疫系统中重要的组成部分。
人体免疫系统可以通过产生抗体来应对病原体的侵袭。
抗体的产生遵循一般规律，并对维持人体健康起着重要作用。
抗体的产生主要经历了免疫应答的两个阶段：初次免疫和次次免疫。
初次免疫是指身体首次暴露于某种病原体时，免疫系统会识别这个病原体，并启动相应的应答机制。
在初次免疫的过程中，免疫系统的B淋巴细胞会通过突变和选择的过程产生多种亲和力不同的抗体。
其中，那些能够与病原体结合并诱导消灭病原体的抗体会被选择出来，并大量产生。
这些抗体可以中和病原体毒素、阻止病原体进入宿主细胞以及激活其他免疫细胞，从而参与抗体介导的免疫应答。
次次免疫是当身体再次暴露于相同的病原体时，免疫系统会快速、高效地应对。
这一过程是通过记忆B细胞实现的，它们是初次免疫时被选择出来的抗体产生的细胞后代。
记忆B细胞可以在病原体再次入侵时迅速分化为抗体产生细胞，从而快速制造大量具有高亲和力的抗体。
此外，记忆B细胞还能持续地生成新的记忆B细胞，以增强对病原体的长期免疫记忆。
抗体的产生对于人体健康具有重要意义。
首先，抗体能够中和病原体毒素，阻止其对机体细胞的损害，从而起到保护机体的作用。
其次，抗体能够与病原体结合成复合物，并通过激活免疫细胞的Fc受体，引发炎症反应来吞噬和消灭病原体。
此外，抗体还能够标记被病原体感染的细胞，使其成为其他免疫细胞的攻击目标。
最后，抗体还能够调节免疫系统的活性，平衡不同类型的免疫细胞的活动，保证免疫系统的正常有效工作。
因此，了解抗体产生的一般规律对于研究免疫系统的功能以及开发抗体相关的治疗手段具有重要意义。
科学家们通过深入研究免疫反应的机制，努力寻找和开发更有效的疫苗、抗体药物以及免疫调节治疗方法，以应对感染性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤等疾病的挑战。
此外，免疫系统的理解和抗体产生的规律也为疾病诊断提供了新的途径，例如通过检测血液中特定抗体的存在与水平，可以帮助医生判断患者是否感染某种病原体。
中和抗体的检测方法和原理
中和抗体的检测方法和原理
中和抗体是指可以结合病原体并防止其进入宿主细胞或抑制其复
制的抗体。
中和抗体检测主要通过体外细胞培养或动物实验的方式进行。
1. 细胞培养法检测中和抗体
细胞培养法检测中和抗体主要包括细胞防御性中和试验、对中和
抗体的小胶片半微量滴度试验和复合病原体细胞培养中和试验。
其中，细胞防御性中和试验是最常用的方法。
该方法使用细胞系于体外培养，将病原体与中和抗体一起加入培养基内，观察病原体在细胞内是否被
清除，从而判断中和抗体的效力。
2. 动物实验法检测中和抗体
动物实验法检测中和抗体是通过注射病原体，将中和抗体加入动
物体内，观察病原体在动物体内的复制能力，从而判断中和抗体的效力。
常用的动物实验包括小鼠腹腔注射法、兔子狂犬病中和抗体测定
法等。
以上方法主要依靠病原体的复制和细胞的防御能力进行判断，从
而确定中和抗体的效力。
该方法有很高的可靠性和准确性，可广泛应
用于病毒、细菌和其他病原体等的检测中。
抗体
广州中医药大学 免疫室 董燕
概述
抗体（antibody，Ab）： 是B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一种 蛋白质，能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。 主要存在于血清等体液中，是介导体液免疫的重要的 免疫效应分子。
•血清蛋白通过电泳方法分为： •白蛋白、α1、α2、β及γ球蛋白等组分。 •抗体活性主要在γ球蛋白组分（即丙种球蛋白） •还存在于α、β球蛋白处。见图1。
二硫键 补体结合部位 Fc受体结合部位
图3 免疫球蛋白（IgG）基本结构图
三、免疫球蛋白的水解片段
1.木瓜蛋白酶:（铰链区近N端处）可得三个片段 ① 2个相同的Fab段，即抗原结合片段（fragment of antigen binding) ② 1个Fc段,可结晶片段（fragment crystallizable)
独特型抗原决定簇由Ig超变区特有的氨基酸序列和
构型决定。 人体体内具有数目庞大的不同的独特型决定簇。在
一定条件下，可刺激机体产生抗独特型抗体。
独特型网络学说：Jerne 等
抗原X Ab to X (D)
抑制 IR to D (E)
增强
抑制 IR to E (F)
抑制 IR to F
增强
和ε链，其氨基酸种类和排列顺序不同，抗原特异性不 同。 免疫球蛋白分为五类：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE
轻链（L链）： 分子量约 25 kD，由214个氨基
酸残基构成 根据L链的抗原特异性的差异:
分为两种，即κ型和λ型。
2. 可变区和恒定区：
•① 可变区（variable
region，V区) ：氨基酸的
5. IgE： 含量最少，呼吸道和胃肠道等处的粘膜固有层的浆细胞产生。
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识别阶段
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活化阶段
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膜攻击阶段
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实验二 抗体生成细胞检测
免疫学教研室 李宗喜 5346
脾脏
第二大免疫器官 捕获血源性抗原 储存血液
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小鼠B细胞溶血空斑形成试验
溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可 活化补体，溶解细胞的原理来检测抗体形 成细胞的一种体外试验方法，是用于检查 动物的抗体产生功能的经典的试验。
7. 微量进样器和离心机等。
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操作步骤
免疫小鼠 血清分离 脾细胞分离、计数 溶血空斑试验
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血清分离
眼球取血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻 压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽 量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突 出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒 立，用1.5mlEp管接住流出的血液。每 次采血量1－2ml。
ELISPOT不仅可应用于B细胞分泌抗体功 能的测定，也能检测分泌细胞因子的T细 胞和巨噬细胞。
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结束
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将SRBC免疫过的小鼠脾细胞制成细胞悬液， 与一定量的SRBC在琼脂凝胶内混合，在补 体参与下，使抗体产生细胞周围的SRBC溶 解，形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要 用于测定B细胞抗体产生能力。
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实验原理
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使用显微镜
安放好载玻片 打开电源 调整瞳孔间距 调整光源 先粗调，再微调 10×物镜找到细胞层和计数室 40×物镜找到白细胞计数区域
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细胞计数板（Hemacytometer）
表面雕刻有带刻度的计数室用来计数细 胞和微粒的特制玻璃板。
2ml冷NH4Cl裂解RBC约5min 1500r/min再离心5min去上清
Hank’s液5ml洗涤细胞，2000r/min离心10min去上清
悬浮细胞于1ml的Hank’s液中
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脾细胞计数
10倍稀释脾细胞悬液 计数脾细胞 调整细胞浓度至2×l06/ml
4℃静置24h，离心10000rpm，5min，收 集血清，-80℃保存待抗体水平检测。
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脾细胞分离计数
处死小鼠 取脾 制备脾细胞悬液 脾细胞计数
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取脾
70%酒精浸湿皮毛，右侧卧位 左侧肋骨最低点与髋关节间做
2.5cm切口 镊子钝性分离结缔组织，暴露
腹膜 腹膜做2cm切口，暴露脾脏 分离结缔组织和系膜 脾脏放入5mlHank’s液的平皿中
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制备脾细胞悬液
镊子夹住脾
注射器吸取2mlHank’s液
刺入脾脏冲洗脾细胞
收集8ml细胞悬液于离心管
1500rpm离心10min去上清
溶血空斑试验
制作反应板 加样：30ul 温箱10分钟
双面胶 盖玻片
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定量溶血分光光度法（quantitative hemolysis spectrophotometry，QHS）
该法又称B细胞介导的红细胞定量溶血分光光 度法，是根据溶血空斑试验的原理衍化而来， 可用以测定由B细胞产生和分泌的抗体裂解红 细胞所释放的血红蛋白(以吸光值表示)，从而 反映机体的体液免疫功能。试验时，将免疫的 脾细胞与SRBC及新鲜豚鼠血清等体积混合，于 37℃水浴1小时，离心后测上清吸光值，其与 产生抗体的量成正比。
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细胞计数板
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计数方法
细胞浓度/ml=稀释倍数×4个方格的平均数×104 Department of Immunology
计数红细胞
细胞浓度/ml=稀释倍数×5个小方格总数×5×104
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溶血反应试验
溶血素 sRBC
C N.S.
பைடு நூலகம்
1 0.2ml 0.2ml 0.2ml 0.4ml
2 0.2ml 0.2ml
0.6ml
3 0.2ml 0.2ml 0.6ml
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ELISA-空斑试验
又称酶联免疫斑点试验ELISPOT。该法与 ELISA不同之处是，加入的待检标本是细 胞，而非可溶性物质；所使用的底物可 形成不溶性终产物。
试剂与器材
1. 小鼠；
2. 绵羊红细胞悬液（2.5%）；
3. 指示细胞悬液： 含10% 绵羊红细胞悬液
0.5ml，补体0.3ml，Hank’s液2.0ml；
4. 细胞裂解液0.17mol的NH4Cl； 5. Hank’s 液（pH7.2）、凡士林油；
6. 动物解剖器械、注射器（5ml）、平皿、试管、 吸管、载玻片、盖玻片、双面胶；