分子生物学技术在水产动物疾病诊断上的应用

基金项目　河南省科技攻关计划(0624030022);河南省高等学校青年

骨干教师资助计划(2006);河南省动物学重点学科(04006)。

作者简介　孔祥会(1968-),男,河南虞城人,博士,教授,从事环境效

应和水生动物健康研究。

收稿日期　2007206210

分子生物学技术在水产动物疾病诊断上的应用

孔祥会1,边中春2　(1.河南师范大学生命科学学院,河南新乡453007;2.河南师范大学图书馆,河南新乡453007)

摘要　对限制性酶切、探针杂交和PCR 诊断等方面对分子生物学在疾病诊断上的应用进行了综述,旨在为水产动物疾病的分子诊断

相关研究提供参考。关键词　分子生物学;水产动物疾病;分子诊断中图分类号　S941 文献标识码　A 文章编号　0517-6611(2007)31-09939-02　Application of Molecular Biology T echnology in Diagnosing Diseases of Aqu atic A nim als

K ong X iang 2hui et al (C ollege of life Science ,Henan N ormal University ,X inxiang ,Henan 453007)

Abstract Application of m olecular biology technology in diagnosing diseases of aquatic animals were summarized on restriction enzyme digestion ,probes hybridization and polymerase chain reaction (PCR )diagnose s o as to supply s ome references for relative studies on m olecular diagnosis of aquatic animal diseases.

K ey w ords M olecular biology ;Aquatic animal disease ;M olecular diagnosis

分子生物学技术不仅在水产养殖上可以培育生长快、抗寒、抗病的新品种,而且在水产动物疾病诊断上亦可显示其独有的优势。传统的鱼病诊断主要依据肉眼观察、症状判别、显微境检查、微生物培养、表型分析、血清学分析、病理切片观察等,这些方法的诊断时程较长。而水产动物发病迅速,由于不能及时治疗而给生产造成重大损失。如鱼发病时,由于诊断结果尚未得出,人们往往大量使用氯制剂、硫酸铜和孔雀石绿等药物先行治疗,结果由于残毒影响,很难生产出健康的水产品。分子生物学技术的诞生,使水产动物疾病快速而直接的分子诊断得以实现。分子生物学技术在鱼病诊断上的应用,显示了其强大的优势,可以为微生物病原体的鉴定提供直接的方法,不仅可以鉴定特定病原种类,也可以鉴定和区分出不同的品系和亚种;不仅可以鉴定微生物鱼病,也可以鉴定寄生虫鱼病。通过病原体遗传物质DNA 的扩增诊断水产动物疾病,可极大提高诊断的特异性和灵敏度;可缩短诊断的时程,使水产动物疾病诊断方式发生根本性的变革,大有替代传统诊断方法的趋势[1]。目前在水产动物疾病诊断上常用的分子生物学方法有限制性酶切、探针杂交和PCR 等,笔者对此进行了综述,以期为水产动物疾病的分子诊断提供指导。1　限制性酶切(R estriction enzyme digestion)检测

限制性酶可识别DNA 上较短的序列,在识别位点上切开DNA ,单个核苷酸变化即可导致限制性酶切位点的增加或缺失。因此,酶切后产生的片段数目发生了改变,即所谓的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polym or 2phisms ,RF LP )。然后进行凝胶电泳,酶切后的DNA 片段根据大小在凝胶电泳上进行分离,染色后即可观察各个不同的片段,进行遗传变异的分析。不同样品总DNA 酶切后即可产生限制性酶切多态性。然而检测这些多态性差异,需要使用标记的特异DNA 探针加以确定。同位素标记通过放射自显影显示,非同位素标记(如酶标记等)可通过显色技术显示,从而揭示DNA 的多态性。另一种方法可以不需要

DNA 探针杂交,而首先对DNA 片段进行限制性酶切,然后靶

定DNA 特定片段,通过PCR 扩增显示限制性片段多态性,

即所谓的扩增片段长度多态性(Am plification fragment length polym orphisms ,AF LP )。这种诊断对于病原微生物是相当有用而直接的方法[2-4]。也可以鉴别特定的寄生虫[5-6]。Chang 等从美国3个不同的海岸水体(New Y ork 、New Jersey 、T exas )收集的蓝蟹(Callinectes sapidus ),通过PCR 和原位杂交分析两步诊断证实存在白斑综合症病毒(White spot syndrome virus ,WSS V )。通过RF LP 方法,对于一个1156bp 片段的WSS V rrl 2specific RsaI 进行扩增,从而区别New Jersey 蓝蟹WSS V 和其他地方分离的WSS V [7]。2　探针杂交(Probes hybridization )检测

特异性的核酸探针杂交是鉴定病原体十分有效的方法,探针可用于检测和确定病原体特定序列,甚至可检测被其他核苷酸片段污染的样品。但探针的设计及杂交的条件要求严格,主要目的是确保探针和样品中互补核酸序列特异性结合。T ijssen 对关于核酸探针的标记和检测系统的多样性进行了综述[8]。目前常用的标记有半抗原(如生物素或地高辛)标记[5]和荧光标记[9]。标记和检测方法的多样性能够提供适宜的系统进行点印迹或原位杂交。限制性酶切后,可以用探针确定和检测片段,尤其在多种片段混合物存在的情况下,通过探针和随后凝胶电泳确定片段的相对位置,可以鉴定样品。组织切片也可运用原位杂交探针,用以检测病原体在组织和细胞内的定位。在对特定病原进行大规模调查时,这种方法的运用具有较大的优点。也可以设计适当的探针检测鱼类、贝类和虾蟹类原生动物寄生虫[10-11]。Venkateswaran 等使用了旋转酶B 基因(gyrase B ,gyrB )作为分子诊断探针。可以在用病毒(Vibrio.Para 2haemolyticus )人工接种的27个虾样本中检测到病毒。对于虾中V.parahaemolyticus 病毒的检测提供了一个快速、可靠、

灵敏的方法[12]

。Mari 等从纯化的TS V (T aura Syndrome Virus )提取ssRNA 基因,转录成双链cDNA 并且被用来构建cDNA 文库。然后通过载体和质粒重组的方法筛选两个特异性的pP15和pQ1探针,通过N orthern bloting 和d ot bloting ,两个探针能够特异性地与提取的RNA 2TS V 基因、TS V 和感染TS V 的虾组织匀浆液进行杂交。这两个探针在对TS V 病虾组织切片原位杂交中也得以证实[13]。

安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2007,35(31):9939-9940责任编辑　胡先祥　责任校对　俞洁

3　聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测PCR是用于在体外酶促扩增特定DNA片段的快速方法。PCR反应包括模板DNA(从样品组织中提取纯化的DNA),引物(可以和模板DNA任一端结合的单链寡核苷酸),聚合酶和一定浓度的脱氧核苷三磷酸(dNTP,用来形成新复制子)和合适的无机盐缓冲液。PCR每一热循环包括变性(模板DNA变性)、退火(引物到互补区)、延伸(模板DNA与引物结合后,多聚酶催化相应核苷酸加到每一引物未端进行延伸)。理论上讲,每一循环使PCR产量应呈几何级数增长。这样PCR可以极大提高诊断速度。由于PCR受多因素影响,即使产物中出现了某一DNA,也不足以说明样品被某一特定病原体感染。还需进一步试验(如限制性酶切、探针杂交或核苷酸测序)增加诊断的特异性[14]。实际上,应用过程中往往是多种方法结合使用。W alton等报道了P病毒探针的构建,P病毒基因组杂交探针,可通过PCR大量制备。然后用来进行点印迹或者原位杂交特异地检测自然或实验室感染动物的组织和细胞。这是对于温带蟹地方性病毒构建的第1个基因探针,对于病毒生态、病毒和寄主相互作用研究非常重要[15]。斑节对虾(Penaeus monodon)用WSS V病毒接种,通过RT2PCR分析,在感染4h后tk2tmk基因的转录可以被检出[16]。

基于DNA的分子诊断,结合适宜的扩增(如PCR)技术,在水产动物疾病诊断上得到了广泛的应用。尤其对传染性疾病的发现和认定提供了有力的工具。通过遗传物质特定序列的比较和识别,可以对病原进行调查和跟踪研究。对特定病原控制,可以更方便地为管理部门提供策略[17]。用于诊断目的的PCR反应条件需要优化,影响因子需要考虑。为了获得更大的灵敏度和特异性,引物设计非常重要。引物应有适宜的长度,太长或太短均会使引物序列不能在模板链上完美结合。引物上多余的核苷也会增加非特异性结合。模板制备是疾病诊断的关键环节,传统的核酸提取方法需消耗相当长的时间。目前DNA提取试剂盒已有商品出售,为模板DNA制备提供了方便。然而在水产动物组织匀浆粗提液中也会含有抑制PCR扩增的物质,从而影响PCR 反应的效果。所以PCR反应条件必须优化。在许多情况下,实验室PCR的优化条件与野外诊断PCR的优化条件存在差异。模板进行扩增的条件与检验样品DNA的要求也会不同。所以,PCR在诊断检测上的实际应用还有待于适宜有效的分子生物学技术的发展。

4　结语

分子生物学技术的快速发展为水产动物疾病诊断提供了许多十分有效的方法。以核酸为标耙,通过核酸的多态性分析,从而提高诊断的特异性、敏感性和速度。由于实验室研究与实际病原诊断存在差距,分子生物学技术真正在水产动物疾病诊断上的应用还需要实验条件的探索和优化、仪器设备的改进和简化、试验方法的成熟和认证。随着分子生物学技术的发展和应用,水产动物疾病分子诊断也日益展开,目前已有多种病原体的PCR诊断试剂盒问世。随着诊断方法的优化和仪器设备的简化,分子诊断技术将会在水产养殖发病现场快速应用。

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0499安徽农业科学2007年