结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)
T-SPOT_TB操作说明电子版
结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）说明书【产品名称】通用名称：结核感染T细胞检测试剂盒（免疫斑点法）英文名称：T-SPOT.TB【包装规格】24人份/盒。
【预期用途】该产品用于检测人外周抗凝全血中的结核特异抗原刺激活化的效应T细胞，仅适用于临床疑似结核病的辅助诊断。
结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，作为免疫应答的一部分，T细胞受结核抗原刺激致敏，形成活化的效应T细胞，包括CD4和CD8，从全血中单独被分离出来，在体外受特异抗原刺激并被记数。
从结核分枝杆菌复合群（人型、牛型、非洲型）中选择有用的抗原降低与BCG（卡介苗）和环境分枝杆菌的交叉反应提高特异性。
两个单独的抗原模仿ESAT-6和CFP 10，联合应用提高检测灵敏度。
T-SPOT.TB是一种更简单的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测方法。
ELISPOT检测是高灵敏度的，在细胞分泌的细胞因子扩散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。
这使得ELISPOT检测更加的灵敏，超过传统的ELISA实验。
T-SPOT.TB 被设计出来用于检测结核特异抗原刺激活化的效应T细胞。
T-SPOT.TB记数每个活化的结核特异效应T细胞。
【检验原理】外周血单个核细胞（PBMCs）从全血样本中被分离，通过洗涤排除本底干扰因素。
记数PBMCs，保证有标准的细胞数量用于检测。
这可以保证因为免疫系统削弱（免疫力低下和免疫抑制）而导致T细胞浓度低的样本也有足够的细胞数加入反应孔检测。
与ELISPOT技术一样的洗涤和记数过程，提高了检测结核病和结核感染的性能。
抗原和PBMCs一起孵育，刺激所有的致敏T细胞。
分泌的细胞因子被预包被在反应孔膜上的特异抗体捕获，然后细胞和其它不必要的物质通过洗涤被去除。
标记二抗，碱性磷酸酶配对的与细胞因子上不同的抗原决定簇结合，在反应孔膜上捕获细胞因子。
通过洗涤去除任何未标记的抗体。
可溶的底物溶液加入到每个检测孔中，在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。
结核感染T细胞斑点试验在疑似结核患者诊断中的应用
结核感染T细胞斑点试验在疑似结核患者诊断中的应用目的：比较结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT. TB）和结核抗体试验（TB-Ab）在疑似结核患者诊断中的敏感性和特异性，探讨两者在结核感染中的诊断价值。
方法：对疑似结核的74例患者进行前瞻性研究，分别采用T-SPOT. TB和TB-Ab 试验，比较二者对结核诊断的敏感性、特异性、阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）、阳性似然比（LR+）和阴性似然比（LR-）。
结果：74例疑似结核患者确诊结核52例。
T-SPOT. TB试验在敏感性、特异性、PPV、NPV等方面显著优于TB-Ab（P＜0.05）；T-SPOT. TB的LR+值明显高于TB-Ab，LR-值明显低于TB-Ab。
结论：T-SPOT. TB试验是诊断结核的快速敏感方法，显著优于结核抗体试验（TB-Ab），更适于作为结核筛检试验，在结核疾病诊断中有着重要价值。
标签：结核；结核感染T细胞斑点试验；结核抗体试验结核病的快速诊断是结核病防控工作中的一个难题，我国近年来结合感染率有上升趋势，结核抗体试验（TB-Ab）对于活动性结核的诊断价值低。
结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT. TB）即γ干扰素释放试验是一种结核诊断的新方法，这种试验采用酶联免疫斑点方法定量检测外周血单核细胞在结核菌特异性抗原刺激下释放γ干扰素的水平，用于诊断潜伏性结核分枝杆菌感染以及结核病。
本研究采用T-SPOT. TB和TB-Ab两种检测方法在疑似结核病人中进行对比研究，探讨二者在结核诊断中的敏感性和特异性。
1 资料与方法1.1 一般资料：2011年8月至2014年8月在我科住院疑似或待排结核患者74例，在其他详细检查基础上同时行T-SPOT. TB检测和TB-Ab检测。
1.2 方法：⑴T-SPOT. TB试验：根据T-SPOT. TB试剂盒（上海复兴医药股份有限公司）的说明书进行以下步骤：分离外周血单核细胞，与结核特异性抗原相对分子质量为6000的早期分泌抗原靶和相对分子质量为10000的培养滤液蛋白在抗γ-干扰素抗体预包被的板中共同孵育，37℃放置16-20小时。
T-SPOT TB解析
Antigens ESAT-6
+
+ +
Antigens Environmental Strains ESAT-6
M. abcessus
M. avium M. branderi M. celatum M. chelonae
CFP 10
+
+ +
CFP 10
-
-
moreau
tice tokyo danish glaxo
•
1.1、试剂盒研制临床背景
结核病——全球关注的问题 全球
• • • 20亿人口感染结核 新增活动性结核病人约900万/年 每年130万患者死亡
中国
• 450万活动性结核病人
•
•
新增活动性结核病人约145万/年
死亡人数约13万/年
活动性结核与潜伏感染
接触活动性结核病患者 暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力清除
终身处于感染状态
潜伏感染
活动性结核
控制结核的关键
早发现 早治疗
结核病的常规诊断方法
（1）细菌学检查 是结核病诊断的金标准，但涂片阳性率低，培养又耗费时日
（2）分子生物学检查
虽然快速、灵敏，但操作烦琐、技术要求高 （3）结核抗体诊断 诊断价值有限，但其简便、快速，可以作为结核病的辅助诊断方 法之一 （4）PPD（TST）实验 传统的结核感染检测方法，对于接种过卡介苗(BCG)或环境分枝
ROC曲线
ROC Plot 1 0.9 0.8
机体被感染
- 没有症状,结核杆菌仍旧 存在而不能被侦测
5%
- X-光/ CT 扫描显示正常
- 没有抗体应答 - 诊断困难 - 传统的结核感染检测只有 TST（PPD）
结核嵌入pcr技术原理
结核嵌入PCR技术原理介绍结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性感染疾病，是全球主要的公共卫生问题之一。
传统的检测方法需要较长的时间，并且对于特殊样本（如胸腔积液）的检测效果较差。
结核嵌入PCR（T-SPOT.TB）技术是一种新型的分子生物学检测方法，能够高效、准确地检测结核感染。
本文将详细介绍结核嵌入PCR技术的原理及其在结核病诊断中的应用。
结核嵌入PCR技术原理结核嵌入PCR技术是一种基于T细胞的免疫学原理的检测方法。
其原理如下：1. 血液采集首先，从患者的外周静脉采集一定量的血液样本。
这些血液样本中含有T细胞，其中部分T细胞已经感染了结核分枝杆菌。
2. T细胞分离通过特定的分离方法，将血液样本中的T细胞分离出来。
这些分离得到的T细胞中含有被结核分枝杆菌感染的T细胞。
3. T细胞培养将分离得到的T细胞培养在特定的培养基中，提供适宜的环境使其继续增殖。
4. 抗原激活在培养过程中，向T细胞中加入结核分枝杆菌的特定抗原，刺激感染了结核分枝杆菌的T细胞。
5. T细胞分泌被刺激的T细胞会分泌干扰素-γ（IFN-γ），这是一种由T细胞产生的细胞因子。
6. 干扰素-γ检测通过特定的试剂盒，可以检测到样本中的IFN-γ水平。
这个试剂盒中包含与IFN-γ特异性结合的抗体，可以形成特定的复合物。
7. 结果解读根据试剂盒中复合物的形成情况，可以判断患者是否感染了结核分枝杆菌。
如果复合物形成，则表示患者感染了结核分枝杆菌；反之，则表示患者未感染。
结核嵌入PCR技术在结核病诊断中的应用结核嵌入PCR技术具有以下优点，使其在结核病诊断中得到广泛应用：1. 高敏感性结核嵌入PCR技术可以检测到非常低浓度的结核分枝杆菌DNA，因此具有很高的敏感性。
这使得该技术可以在早期感染时进行准确的诊断，提高了结核病的检测率。
2. 高特异性结核嵌入PCR技术通过特定的抗原激活T细胞，只检测感染了结核分枝杆菌的T细胞分泌的IFN-γ。
因此，该技术具有很高的特异性，可以避免误诊。
T-SPOT.TB检验在活动性肺结核诊断中的临床意义
T-SPOT.TB 检验在活动性肺结核诊断中的临床意义【摘要】目的：观察分析活动性肺结核行T-SPOT.TB（结核感染T细胞）检验的临床价值。
方法：选取2020年1月-2020年12月本院收治的110例疑似活动性肺结核患者作为研究对象，入院后均给予PPD结核菌素试验以及T-SPOT.TB检验。
比较不同检验方法的准确度、特异性、灵敏度。
结果：与PPD试验相比，T-SPOT.TB检验准确度、特异度、灵敏度明显更高，结果差异显著（p<0.05）。
结论：相较于PPD试验，T-SPOT.TB检验效能相对更高，能够准确诊断活动性肺结核，且操作便捷，值得推广应用。
【关键词】活动性肺结核；PPD试验；T-SPOT.TB；诊断价值肺结核传染性较强，是因感染结核分枝杆菌所致，是我国重视程度较高的一类慢性传染病，尤其是活动性肺结核，传染性强，给患者身心健康带来了严重影响。
由于活动性肺结核初期症状不典型，易被患者忽略，以致于患者错过最佳治疗时机。
另外，活动性肺结核引起的咯痰以及咳嗽等症状容易与呼吸道感染混淆，所以临床误诊率较高。
若患者咯血，则说明病情已经步入了中晚期，需要临床尽快给予诊断、干预治疗，以改善疾病预后[1]。
痰培养具有一定的诊断效果，但是标本污染问题严重。
有必要探索一种更加可靠高效的检验方法，为临床准确诊断活动性肺结核提供依据。
1.一般资料与方法1.1一般资料本研究纳入110例疑似活动性肺结核患者作为研究对象，纳入时间2020年1月-2020年12月，包括56例男性、54例女性，年龄22-75岁，均龄（48.6±13.5）岁。
均伴有咳痰、高热不退、咳嗽、气喘以及咯血等呼吸道症状；征得当事人同意前提下签署研究同意书；与医学伦理要求相符。
排除精神病史、呼吸道感染、视听障碍或认知异常而不能正常配合的患者。
1.2方法所有入组的观察对象均行PPD试验、T-SPOT.TB检验，其中（1）PPD试验：选取结核菌素稀释液0.2ml，经皮内注入进行皮肤试验；通常注入左前臂掌侧下方1/3处；结束注射操作之后，局部表层便会产生一个皮丘，2-3d之后测量皮丘范围。
结核T-SPOT
结核T-SPOT传统手段：结核菌素皮试：低敏感性：免疫力低下人群中其敏感性大大降低。
低特异性：与卡介苗接种和其他环境分枝杆菌有交叉，易造成“假阳性”结果。
细菌学检查：常规培养：2月；快速培养：1周。
阳性率取决于采集标本中细菌数量，不利于早期诊断。
病理学检查：阳性率低，对取材标本有较高要求，有创伤，对肉芽肿性病变需进一步鉴别。
结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T 淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子（IFN-γ），因此，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断。
由于效应T细胞存活时间很短，而且具有特异性，因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临床症状。
T-SPOT.TB 高特异性ESAT-6（早期靶原6）&CFP10（培养滤液蛋白10）均来自结核分枝杆菌基因组RD1区域。
仅结核分枝杆菌复合群（人型，牛型，非洲型）存在RD1区基因。
卡介苗和大多数环境分枝杆菌缺失RD1区基因。
T-SPOT.TB 不会受卡介苗接种影响。
通常阴性对照没有或仅有很少斑点。
根据抗原A或/和抗原B孔的反应判断结果；阴性对照孔斑点数为0-5，阳性样本应为：（抗原A或抗原B斑点数）-（阴性对照孔斑点数）≥6.当阴性对照孔斑点数≥6 spot，阳性样本应为（抗原A或抗原B斑点数）≥2×（阴性对照孔斑点数）如果阳性对照孔结果良好，但抗原A或抗原B均达不到阳性样本判断标准，则结果为阴性。
阳性结果说明患者体内存在针对结核杆菌的效应T淋巴细胞。
阴性结果提示患者可能不含针对结核杆菌的效应T淋巴细胞。
T-SPOT.TB 检测单个反应细胞可以检测样品中每一个反应的T细胞即使在免疫功能低下的患者，只要单个的T淋巴细胞有反应，也同样可以被检出。
T-SPOT.TB 检测所有类型的T细胞亚型CD4和CD8T细胞均被检测即使HIV患者中CD4T细胞被清除，只要CD8细胞有针对抗原的反应，也同样被检出。
结核感染T细胞检测方案
32
Kim et al. Arch Intern
Med.
2007; 167;20:2255-2259
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Kim et al. Am J Med
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Janssens et al ERJ
2007；30(4):722-8
32
Dominguez et al Clin
Vacc
结核特异性T细胞，这些淋巴细胞在受到结核特异
抗原刺激后分泌γ 干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验。 检测外周血中受结核特异抗原刺激释放γ 干扰素的T淋巴细
胞，经酶联免疫显色后，通过ELISPOT分析系统 对斑点进行计数，1个斑点代表一个分泌细胞，计算出抗原 特异性细胞的频率。
空白对照孔内斑点数小于10且阳性对照孔内斑点 数大于20时视为试验有效
Diseases
2009,9:60
6.结论
T-SPOT.TB在诊断结核感染方面具有良好的敏感 性和特异性，在现有结核诊断方法存在缺陷的今 天， T-SPOT.TB 可以给临床诊断提供参考。
基于结核抗原特异性T细胞向病变部位集中的特点 ， T-SPOT.TB的检测物已不局限于静脉血，支气 管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、脑脊液等也可用 于对肺内及肺外结核的诊断。
受试者数 量
72
文献发表
Meier et al Eur J Microbiol Infect Dis (2005)；24: 529-536
在经培养确诊的活动性结核受试者中，T-SPOT.TB的灵敏 度为96.6%。其中29例免疫力低下患者，T-SPOT.TB的灵 敏度为100%
在确诊病例（涂片或培养阳性）和临床诊断病例（有临床 症状和抗痨治疗有效）中，T-SPOT.TB的灵敏度为90.3% ，并且不受CD4细胞数量影响。
结核感染T细胞检测在菌阴性肺结核诊断中的应用价值
系统医学 2023 年 11 月第 8 卷第 22期结核感染T细胞检测在菌阴性肺结核诊断中的应用价值肖洁，温志华，刘圣泽，简丽萍韶关市粤北第二人民医院肺科，广东韶关512000[摘要]目的探讨结核感染T细胞检测（T-SPOT.TB）在菌阴性肺结核诊断中的应用价值。
方法选择2019年1月—2021年1月韶关市粤北第二人民医院诊断为菌阴性肺结核的100例患者以及同时间段内在本院就诊的100例非结核肺部疾病患者的数据资料进行回顾性分析。
描述菌阴性肺结核组患者的初次治疗分布情况以及非结核肺部疾病组患者的疾病分布情况。
分析T-SPOT.TB对菌阴性肺结核患者的诊断价值。
结果 T-SPOT.TB对菌阴性肺结核患者的诊断灵敏度为86.00%（86/100），诊断特异度为95.00%（95/100），诊断准确度为90.50%（181/200），诊断的阳性预测值为94.51%（86/91），诊断的阴性预测值为87.16%（95/109）。
结论 T-SPOT.TB的检测方法对于菌阴性肺结核患者具有较为良好的诊断效能。
[关键词]菌阴性肺结核；诊断；公共卫生问题；传染病；特异度[中图分类号]R521 [文献标识码]A [文章编号]2096-1782（2023）11(b)-0031-04 Application Value of Tuberculosis Infection T Cell Detection in the Diagno⁃sis of Bacterial Negative Pulmonary TuberculosisXIAO Jie, WEN Zhihua, LIU Shengze, JIAN LipingDepartment of Pulmonary, North Guangdong Second People's Hospital, Shaoguan, Guangdong Province, 512000 China [Abstract] Objective To explore the application value of TB infection T cell detection (T-SPOT.TB) in the diagnosis of bacteria negative pulmonary tuberculosis. Methods The data of 100 patients diagnosed with bacterial negative pul⁃monary tuberculosis and 100 patients with non-tuberculosis pulmonary disease in North Guangdong Second People's Hospital from January 2019 to January 2021 were selected for retrospectively analyzed. The distribution of initial treat⁃ment in patients with bacterial negative tuberculosis and the distribution of disease in patients with non-tuberculous lung disease were described. The diagnostic value of T-SPOT.TB in patients with bacteria-negative pulmonary tuber⁃culosis was analyzed. Results The diagnostic sensitivity of T-SPOT.TB for bacterial negative pulmonary tuberculosis patients was 86.00% (86/100), the diagnostic specificity was 95.00% (95/100), the diagnostic accuracy was 90.50% (181/200), the positive predictive value of diagnosis was 94.51% (86/91), and the negative predictive value of diagno⁃sis was 87.16% (95/109). Conclusion The detection method of T-SPOT.TB has better diagnostic efficacy in patients with bacteria negative tuberculosis.[Key words] Bacteria negative tuberculosis; Diagnosis; Public health issues; Infectious diseases; Specificity结核病在世界范围内一直就是备受关注的重大公共卫生问题[1]。
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1520文档结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)
一.临床意义：
结核病临床表现复杂多样，可累及全身各个系统，给临床诊断带来很大困难。
本项目检测通过将分离标本中的单个核细胞加入结核分枝杆菌特异性抗原A、B分别进行细胞培养后，分别检测分泌γ干扰素的特异性淋巴细胞的数量诊断结核感染。
本检测诊断结核感染的敏感性为90%-95%，特异性为93%-100%。
对临床诊断或排除结核病具有重要的参考价值。
二.标本类型、采集及运送要求：
1.采集要求：标本采集后4小时内必须送到实验室，标本采集后如果超过4小时未送检将严重影响检测结果。
2.静脉血：肝素钠（绿头管）抗凝管采集静脉血4ml，立即颠倒数次，充分混匀，以免血液凝固。
采血后向试管中注入血液时请缓慢进行，避免用力过猛造成细胞破坏影响检测结果。
三．标本采集时间、结果发放时间及检测频率
1.标本采集时间：每周一上午12点之前采血；并于4小时之内送到临床微生物实验室。
（必要时可与临床微生物实验室联系）
2.结果发放时间：周二下午4点半检验报告发出。
3.检测频率：暂定每周检测一次。
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